宋麗麗,王亞峰,管玉潔,黃閃,劉煒

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 血液腫瘤科,河南 鄭州 450000)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)是兒童最常見(jiàn)的惡性實(shí)體腫瘤之一,具有異質(zhì)性高、惡性程度高、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)[1]。目前治療NB的方法有手術(shù)、化療、放療及自體干細(xì)胞移植等,但臨床效果及預(yù)后欠佳,因此探索NB的分子機(jī)制對(duì)早期診斷、預(yù)后改善有重要意義[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類(lèi)非編碼小分子RNA,不僅參與細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等過(guò)程,還與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。miR-204是一類(lèi)重要的miRNA,在多種惡性腫瘤中異常表達(dá),在癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲中發(fā)揮重要調(diào)控作用[5-6]。但目前國(guó)內(nèi)外缺乏關(guān)于miR-204與NB的研究,且其作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確。本研究通過(guò)檢測(cè)NB患兒腫瘤組織中miR-204的表達(dá),探討其與NB臨床病理及預(yù)后的關(guān)系,同時(shí)分析過(guò)表達(dá)miR-204對(duì)NB細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,初步探討其在NB中的生物學(xué)功能及機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例資料

收集2020年1月至2022年1月在鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院治療的NB患兒的腫瘤組織及癌旁組織標(biāo)本。入選標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)臨床、影像學(xué)及病理學(xué)確診為NB,初次治療且臨床資料完整。本研究共納入42例NB患兒,其中男22例,女20例;年齡3～120個(gè)月;臨床分期Ⅰ期4例,Ⅱ期6例,Ⅲ期9例,Ⅳ期18例,Ⅳs期5例;發(fā)生骨轉(zhuǎn)移11例;危險(xiǎn)度中低危22例,高危20例;N-myc擴(kuò)增有7例,無(wú)35例。出院后所有患兒定期復(fù)查,隨訪(fǎng)時(shí)間截至2023年1月。總生存期(overall survival,OS)指從初始住院至死亡。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

人NB細(xì)胞SH-SY5Y購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),Trizol提取試劑和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;miR-204 mimics及mimics-NC購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司,miR-204和U6引物由上海生工生物公司合成,CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC凋亡試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司,Bax、Bcl-2、VEGF、MMP-2、MMP-9、GAPDH抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組

SH-SY5Y細(xì)胞置于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,并置于含5%(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)液每隔2 d更換1次,待細(xì)胞生長(zhǎng)至約85%密度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)3～5代后,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞隨機(jī)分為miR-204 mimics(轉(zhuǎn)染miR-204 mimics)組、mimics-對(duì)照(mimics- normal control,mimics-NC)組(轉(zhuǎn)染miR-204 mimics的陰性對(duì)照)、空白對(duì)照(blank control,BC)組(不進(jìn)行轉(zhuǎn)染),根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染24 h后開(kāi)始進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)miR-204表達(dá)

按照zTriol提取試劑盒操作說(shuō)明提取組織及細(xì)胞總RNA,然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。miR-204引物序列:上游為5’-CCTTTGTCATCCTATGCC-3’,下游為5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’。U6引物序列:上游為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。qPCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃變性30 s,55 ℃變性30 s,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參,用2-△△Ct法計(jì)算miR-204的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

將各組細(xì)胞分別接種于96孔板(每孔5×103個(gè)細(xì)胞)中繼續(xù)培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48、72和96 h后加入10 μL CCK-8溶液,孵育4 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各組吸光度值。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取各組細(xì)胞(1×105個(gè)細(xì)胞)離心重懸于結(jié)合緩沖液中,加入1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC混勻,室溫避光孵育15 min后加入5 μL PI染色。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲力

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):取各組細(xì)胞,用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸(每毫升5×105個(gè)細(xì)胞),取200 μL加入上室,將600 μL含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的培養(yǎng)液加入下室。培養(yǎng)24 h后取出小室,用棉簽去除散落細(xì)胞,40 g·L-1多聚甲醛固定,1 g·L-1結(jié)晶紫染色,風(fēng)干,鏡下觀(guān)察,隨機(jī)抽取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將基質(zhì)膠按1∶8稀釋,包被Transwell小室基底膜。其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.3.6Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞,采用蛋白提取試劑盒提取蛋白,并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后用50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h,洗膜后加入Bax、Bcl-2、VEGF、MMP-2、MMP-9和GAPDH一抗(稀釋比1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后加入二抗(1∶5 000),室溫孵育2 h,加入ECL化學(xué)發(fā)光,成像、拍照。利用Image J軟件進(jìn)行圖像分析,以GAPDH為內(nèi)參分析各蛋白條帶灰度值,并計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-204在NB患兒腫瘤組織中表達(dá)

NB患兒腫瘤組織中miR-204表達(dá)水平(0.45±0.11)低于癌旁組織(1.02±0.58),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.587,P<0.001)。

2.2 miR-204低表達(dá)組與高表達(dá)組相關(guān)指標(biāo)

將42例NB患兒按照miR-204表達(dá)的中位值(0.45)分為高表達(dá)組(≥0.45)和低表達(dá)組(<0.45)。miR-204高表達(dá)組和低表達(dá)組臨床分期、骨轉(zhuǎn)移、危險(xiǎn)度及N-myc比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩組間性別和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表1。NB患兒的中位隨訪(fǎng)時(shí)間為25(8～36)個(gè)月。采用Kaplan-Maier方法分析miR-204表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-204低表達(dá)組OS短于高表達(dá)組(χ2=5.122,P=0.024),見(jiàn)圖1。

圖1 NB患兒miR-204水平與OS的相關(guān)性

表1 miR-204低表達(dá)組與高表達(dá)組相關(guān)指標(biāo)比較[n(%)]

2.3 各組細(xì)胞miR-204表達(dá)水平

miR-204 mimics組細(xì)胞中miR-204表達(dá)水平高于BC組和mimics-NC組(P<0.05);BC組和mimics-NC組miR-204表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

2.4 上調(diào)miR-204后對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響

miR-204 mimics組24、48、72和96 h時(shí)細(xì)胞吸光度值均低于BC組和mimics-NC組(P<0.05)。BC組和mimics-NC組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞吸光度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

2.5 上調(diào)miR-204后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V/PI雙染結(jié)果顯示,miR-204 mimics組的細(xì)胞凋亡率高于BC組和mimics-NC組(P<0.05),而B(niǎo)C組和mimics-NC組間細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4A。進(jìn)一步對(duì)凋亡下游標(biāo)志蛋白進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,與BC組和mimics-NC組相比,miR-204 mimics組Bax蛋白表達(dá)水平升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);BC組和mimics-NC組細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4B。

A為上調(diào)miR-204對(duì)NB細(xì)胞凋亡的影響;B為上調(diào)miR-204對(duì)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響;與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

2.6 上調(diào)miR-204后對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲力的影響

miR-204 mimics組細(xì)胞遷移和侵襲能力均低于BC組和mimics-NC組(P<0.05);BC組和mimics-NC組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖5。Western blot分析遷移和侵襲相關(guān)標(biāo)志性蛋白表達(dá)顯示,miR-204 mimics組VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平均低于BC組和mimics-NC(P<0.05);BC組和mimics-NC組細(xì)胞中VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖6。

與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

與BC組和mimics-NC組相比,*P<0.05。

3 討論

NB是兒童常見(jiàn)的惡性腫瘤,約占兒童癌癥病死率的15%[7]。雖然近年來(lái)NB的診療手段得到很大改進(jìn),但該腫瘤極易復(fù)發(fā),預(yù)后差,嚴(yán)重威脅兒童生命健康[8-9]。因此尋找新的分子靶點(diǎn)對(duì)NB的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估有重要意義。隨著基因芯片、原位雜交及高通量測(cè)序等技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用,miRNA在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中的作用已成為研究熱點(diǎn)。因此,鑒定NB相關(guān)miRNA不僅有利于理解miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用,而且對(duì)探尋新的治療靶點(diǎn)也非常重要。miR-204是一類(lèi)重要的miRNA,在多種惡性腫瘤中異常表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后及耐藥性密切相關(guān)[10-11]。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn),miR-204在膽囊癌患者血清及癌組織中低表達(dá),可作為膽囊癌的診斷指標(biāo),且與TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度及不良預(yù)后有關(guān)。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn),膀胱癌組織和細(xì)胞系中miR-204的表達(dá)降低,與T分期與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。丁祺等[14]研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌患者血清miR-204水平降低,與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存時(shí)間縮短有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,miR-204在NB患兒腫瘤組織中異常低表達(dá),與骨轉(zhuǎn)移、臨床分期、危險(xiǎn)度及N-myc擴(kuò)增密切相關(guān),同時(shí)生存分析發(fā)現(xiàn)miR-204低表達(dá)NB患兒OS短于高表達(dá)組,提示miR-204的低表達(dá)與NB不良預(yù)后有關(guān),與以往的研究結(jié)果[15]類(lèi)似,進(jìn)一步證明miR-204與NB患兒預(yù)后有關(guān)。

此外,大量證據(jù)顯示miR-204不僅與多種惡性腫瘤預(yù)后有關(guān),還能影響癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等[16-17]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-204在所有檢測(cè)的肺癌細(xì)胞系中均下調(diào),且通過(guò)靶向增殖細(xì)胞核抗原-1調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力。Fan等[19]研究發(fā)現(xiàn),miR-204在所有檢測(cè)的乳腺癌細(xì)胞系中均表達(dá)下調(diào),通過(guò)靶向PI3K/AKT通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲轉(zhuǎn)移,促進(jìn)細(xì)胞死亡和G2/M細(xì)胞周期阻滯。范曉紅等[20]研究發(fā)現(xiàn),miR-204靶向Bcl-2影響卵巢癌細(xì)胞增殖和凋亡。本研究結(jié)果顯示,上調(diào)miR-204后,SH-SY5Y細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力降低,凋亡率升高。此外,Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-204后凋亡相關(guān)蛋白Bax表達(dá)水平升高,Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,同時(shí)遷移和侵襲相關(guān)蛋白(VEGF、MMP-2和MMP-9)降低,說(shuō)明上調(diào)miR-204表達(dá)能夠抑制NB細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

miR-204低表達(dá)與NB患兒臨床分期、骨轉(zhuǎn)移、危險(xiǎn)度、N-myc擴(kuò)增及不良預(yù)后密切相關(guān),并對(duì)NB細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移和凋亡具有調(diào)控作用,可作為NB患兒的潛在預(yù)后評(píng)估和治療靶標(biāo),為臨床診治提供新的方向。