楊文杰 王曉明 童文娟 董學(xué)妍 戴衛(wèi)健 林源吉 王賢軍 余道軍

人類呼吸道感染主要是由病毒引起，通過氣溶膠或接觸發(fā)生傳播[1]，常見的呼吸道病毒包括流感病毒（influenza virus，IFV）、人冠狀病毒（human coronavirus，HCOV）、人鼻病毒（human rhinovirus，HRV）、人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）和人腺病毒（human adenovirus，HADV）等。呼吸道病毒可單一感染，也可出現(xiàn)混合感染，這些病毒引起的呼吸道感染臨床表現(xiàn)相似，病毒類型常常難以區(qū)分[2-3]。呼吸道病毒的檢測，目前國內(nèi)外多采用病毒的分離培養(yǎng)與鑒定、核酸序列測定法、免疫學(xué)檢測以及分子生物學(xué)檢測法[4]。臨床上對病毒快速檢測的迫切需求使得分子生物學(xué)技術(shù)得以廣泛應(yīng)用[5]，如PCR-熒光探針法（熒光定量PCR 法）和核酸序列測定法（Sanger 測序法）等，這些檢測方法或周轉(zhuǎn)時間更短，或靈敏度更高。本文采用PCR-熒光探針法和核酸序列測定法檢測呼吸道病原體，對比分析兩種方法的檢測效能，為基于熒光定量PCR 方法檢測呼吸道病原體分子診斷試劑研發(fā)提供臨床驗證數(shù)據(jù)；進(jìn)一步分析呼吸道感染患者呼吸道病原體的流行特征，為臨床分析判斷呼吸道病原體流行狀況及診治提供幫助，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2019 年7 至12 月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院呼吸道感染患者309 例，其中男159 例，女150 例，年齡4.00（3.00，7.00）歲。根據(jù)年齡不同分為：＜6 歲組198 例（64.08%），6～21 歲組71 例（22.98%），22～59 歲組29 例（9.39%），≥60 歲組11 例（3.55%）。入選標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷為呼吸道感染的病例[如甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）、乙型流感病毒（influenza B virus，IBV）、人副流感病毒Ⅰ（human parainfluenza virus type Ⅰ，HPIV Ⅰ）型、人副流感病毒Ⅱ（human parainfluenza virus type Ⅱ，HPIV Ⅱ）型、人副流感病毒Ⅲ（human parainfluenza virus type Ⅲ，HPIVⅢ）型、HADV、HRSV、人冠狀病毒229E（human coronavirus 229E，HCOV-229E）、人冠狀病毒OC43（human coronavirus OC43，HCOV-OC43）、人 冠 狀 病 毒NL63（human coronavirus NL63，HCOV-NL63）、人冠狀病毒HKU1（human coronavirus HKU1，HCOV-HKU1）、人博卡病毒（human bocavirus，HBOV）、人偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）、HRV、風(fēng)疹病毒（rubella virus，RV）、麻疹病毒（measles virus，MeV）、腮 腺炎病毒（mumps virus，MuV）、肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）及 肺 炎 衣 原 體（chlamydia pneumoniae，CP），共17 個型別的呼吸道病毒和2 種非典型性肺炎病原體]；樣本為臨床診療常規(guī)檢測后剩余樣本，樣本余量不少于500 μL；樣本信息完整、可溯源，包含年齡、性別、病例編號、采樣日期、臨床診斷等。排除標(biāo)準(zhǔn)：樣本量不足以檢測者；樣本信息不明確；因人為因素（操作過程樣本污染）或儀器問題導(dǎo)致無法完成實驗過程的樣本；實驗測定結(jié)果只有PCR-熒光探針法或核酸序列測定法的檢測結(jié)果。

1.2 實驗材料和儀器 人呼吸道病原體核酸聯(lián)合檢測試劑盒（批號：2019030011，廈門安普利生物工程有限公司生產(chǎn)），核酸提取試劑盒（閩廈械備20170006，廈門安普利生產(chǎn)），實時熒光定量PCR 儀（型號：7500，注冊證號：國械注進(jìn)20163220767，美國ABI 公司生產(chǎn)），ABI3730XL 測序儀[通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司生產(chǎn)]。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集方法 從口腔取樣時，棉拭子在口腔拱形上顎的后方擦拭；從鼻腔取樣時，棉拭子插入鼻孔內(nèi)至鼻腭處，稍加壓力旋轉(zhuǎn)采集，用相同方法擦拭另一側(cè)鼻孔；將采集標(biāo)本后的棉拭子浸入預(yù)加1 mL 標(biāo)本保存液的離心管中充分洗脫，將棉拭子充分?jǐn)D干后丟棄，檢測前振搖標(biāo)本管，使之充分混勻備用。待測分泌物拭子在2～8 ℃保存，保存期不超過72 h；實驗采用的樣本類型為鼻咽拭子或咽拭子，為臨床診療過程中正常采集樣本的剩余樣本。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過[批準(zhǔn)文號：2019 醫(yī)倫審第（011）號-1]，免于受試者的知情同意。

1.3.2 標(biāo)本設(shè)盲編號 標(biāo)本入組完成后，設(shè)盲人員將標(biāo)本充分混勻分裝成兩管（一管用于試驗用體外診斷試劑PCR-熒光探針法檢測（不少于200 μL），另一管用于核酸序列測定法檢測（不少于300 μL），同時按照設(shè)盲表填寫設(shè)盲記錄，設(shè)盲表為隨機(jī)軟件生成，在每份標(biāo)本管上標(biāo)記設(shè)盲號，而不標(biāo)記樣本編號，設(shè)盲后將設(shè)盲表封存，由盲態(tài)試驗人員進(jìn)行檢測，在兩種方法檢測完畢后揭盲，將檢測結(jié)果填寫在臨床試驗結(jié)果記錄表上。

1.3.3 試驗方法 （1）PCR-熒光探針法：收集樣本分裝、隨機(jī)編號、設(shè)盲后，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，可檢測出19 個型別的呼吸道病原體。（2）核酸序列測定法：采用Sanger 法測序進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以百分率表示。以核酸序列測定結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對PCR-熒光探針法的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，分析PCR-熒光探針法檢測不同病原體的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值[5]。

2 結(jié)果

2.1 PCR-熒光探針法檢測各病原體的結(jié)果 對309例標(biāo)本進(jìn)行PCR-熒光探針法和核酸序列測定法檢測，PCR-熒光探針法對各病原體的檢測靈敏度均為100.00%，特異度為99.65%～100.00%，陽性預(yù)測值為75.00%～100.00%，陰性預(yù)測值均為100.00%，見表1。兩種方法檢測結(jié)果不一致或不完全一致的樣本共2 例（其中1 例PCR-熒光探針法檢測MP 陽性，但核酸序列測定法檢測為陰性，另1 例熒光PCR-熒光探針法檢測結(jié)果為HADV、HRSV 同時陽性，但核酸序列測定法結(jié)果僅HADV 陽性）。

表1 PCR-熒光探針法檢測各病原體的結(jié)果

2.2 兩種方法檢測各病原體的陽性結(jié)果 兩種方法檢測各病原體的陽性結(jié)果比較見表2，兩種方法檢測HCOV 和HPIV 各亞型的陽性結(jié)果比較見表3、表4。

表2 兩種方法檢測各病原體的陽性結(jié)果比較[例（%）]

表3 兩種方法檢測HCOV 各亞型的陽性結(jié)果比較[例（%）]

表4 兩種方法檢測HPIV 各亞型的陽性結(jié)果比較[例（%）]

2.3 不同年齡組的病原體分布情況 ＜6 歲組和6～21 歲組檢測出18 種呼吸道病原體，其中以HRV 檢出率最高，其次是HADV 和MP；22～59 歲組共檢出9 種呼吸道病原體，其中以HRV 檢出率最高；≥60 歲組共檢出8 種呼吸道病原體，以HBOV 為主。見表5。

表5 不同年齡組的病原體分布情況[例（%）]

3 討論

臨床上，造成呼吸道感染的病原體主要涉及病毒、細(xì)菌和真菌，其中病毒的占比最高[7]。呼吸道病毒感染常為細(xì)菌定植提供條件，常常引起細(xì)菌和病毒混合感染[8]，其臨床感染癥狀和流行特點相似，僅靠臨床表現(xiàn)難以鑒別，而準(zhǔn)確快速的病原學(xué)診斷對于臨床制定治療方案和控制傳染病的流行具有重要意義。

目前呼吸道感染病原體的實驗室診斷有多種方法，痰細(xì)菌培養(yǎng)仍是常規(guī)檢測方法，但對于其他如病毒、非典型病原體等，培養(yǎng)耗時長，技術(shù)要求非常高，僅適用于實驗室研究；血清學(xué)方法技術(shù)成熟，有商品試劑盒供應(yīng)，靈敏度和特異度都已明確，缺點是需要檢測急性期和恢復(fù)期雙份血清才有診斷意義，在臨床實際應(yīng)用中受到限制；多重?zé)晒舛縋CR 檢測法可準(zhǔn)確快速同時檢測呼吸道感染多種病原體，且取材方便，不受抗生素影響，簡單實用，經(jīng)濟(jì)方便[9-10]。鑒于此，本研究使用了可同時檢測多種呼吸道病原體的多重?zé)晒釶CR 試劑盒（PCR-熒光探針法），對309 例患者的臨床樣本進(jìn)行病原體核酸檢測，以核酸序列測定法為金標(biāo)準(zhǔn)，分析PCR-熒光探針法對不同病原體檢測的靈敏度和特異度，結(jié)果表明PCR-熒光探針法的檢測靈敏度均為100.00%，特異度為99.65%～100.00%，兩種方法的檢測結(jié)果不一致或不完全一致的樣本僅2 例，說明兩種方法的檢測結(jié)果具有高度一致性。核酸序列測定法是基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[11]，具有準(zhǔn)確度好且特異度高的優(yōu)點，但其檢測時間長、成本高等問題，不利于臨床大面積推廣及應(yīng)用[12]。在本研究中，核酸序列測定法和PCR-熒光探針法的檢測結(jié)果出現(xiàn)2 例不完全一致，可能是PCR-熒光探針法檢測靈敏度較核酸序列測定法高，導(dǎo)致低濃度樣本PCR-熒光探針法檢測結(jié)果為陽性而核酸序列測定法檢測結(jié)果為陰性。相較于核酸序列測定法，PCR-熒光探針法特異度強、靈敏度高、檢測周期短，而且操作簡便快捷，對操作人員技術(shù)要求相對較低，使用儀器設(shè)備簡單，檢測費用相對低廉，能夠?qū)崿F(xiàn)絕對定量。因此，PCR-熒光探針法能夠快速檢測病原體，為臨床的早期診斷和治療提供了更大的可能性[13]。

在確定PCR-熒光探針法試劑的可靠檢測性能后，本研究對309 例呼吸道感染患者的病原體分布特征進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)：學(xué)齡前（＜6 歲）和6～21 歲呼吸道感染患者檢測出多達(dá)18 種病原體，22～59 歲和60 歲及以上呼吸道感染患者病原體檢出種類相對較少（分別檢出9 種和8 種），但兒童和22～59 歲呼吸道感染患者病原體檢出率最高的都是HRV，而60 歲及以上呼吸道感染患者以HBOV 為主。研究結(jié)果表明，兒童及中青年呼吸道感染病原體分布廣泛，種類眾多，但以HRV 為主。HRV 廣泛存在，很容易在學(xué)校和辦公場所等人群聚集的地方擴(kuò)散，毒力相對較弱[14]，兒童及中青年人群社會活動范圍較大，交流頻繁，極易導(dǎo)致交叉感染，故而導(dǎo)致兒童及中青年感染HRV 較多；60歲及以上患者卻以HBOV 為主，可能與這類人群以居家為主，外出活動較少，而HBOV 可在人和動物之間傳播[15]，老年人因居家時間較長，與寵物接觸相對較多[16]，故而導(dǎo)致60 歲及以上患者以HBOV 為主。不過，本研究中60 歲及以上患者較少，只有3 例HBOV 陽性，這也可能是與其他文獻(xiàn)報道不一致的原因。另外，本研究結(jié)果顯示呼吸道混合感染以兩種病原體共感染為主，兒童以HRV 與其他病毒混合感染最為常見，而60 歲及以上患者以HBOV 與其他病原體混合感染為主。

鑒于HPIV 和HCOV 亞型較多，各亞型的流行特征和致病力各有不同，因此，本研究對HCOV 和HPIV 的各亞型檢出率進(jìn)行了統(tǒng)計分析。HPIV 各亞型中檢出率從高到低分別為HPIVⅡ型、HPIVⅠ型和HPIVⅢ型，其中HPIVⅡ型檢出率是HPIV Ⅲ型的2 倍，表明本研究人群HPIV 感染以Ⅱ型為主，這與國內(nèi)文獻(xiàn)報道一致[17-18]。另外，本研究對主要的冠狀病毒亞型進(jìn)行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)β-冠狀病毒HCOV-OC43 的檢出率最高，其次是α-冠狀病毒HCOV-229E，表明HCOV 感染以HCOV-OC43 為主。HCOV-OC43 感染后，主要表現(xiàn)為上呼吸道感染，一般情況下癥狀不嚴(yán)重，但HCOVOC43 對免疫力低下患者具有神經(jīng)侵襲性，可能導(dǎo)致致命性腦炎[19-20]。因此，應(yīng)密切監(jiān)控HCOV-OC43 流行趨勢，一旦檢測到HCOV-OC43 感染，應(yīng)引起足夠重視，以防病情演變。

綜上所述，本研究通過兩種方法同時檢測鼻咽拭子中的呼吸道病原體，結(jié)果表明PCR-熒光探針法更簡便、靈敏、準(zhǔn)確、安全，具有較高的臨床應(yīng)用價值。呼吸道感染病原體主要是鼻病毒，混合感染也比較常見，主要是以兩種病原體混合感染為主，對HPIV 和HCOV 的分型檢測臨床意義明顯。