王葳 李征寒 徐濱華 李?yuàn)檴?王晶 王立平 崔海波 趙艷寧

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是引起下肢動(dòng)脈粥樣硬化性病變（lower extremity atherosclerotic disease，LEAD）的重要原因之一[1]。與非糖尿病患者相比，T2DM 更易累及脛前動(dòng)脈和股深動(dòng)脈等中小動(dòng)脈，LEAD 風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病患者增加2～4 倍，是T2DM 患者殘疾和死亡的主要原因[2-3]。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是T2DM 合并LEAD 的根本原因，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[4-5]。新蝶呤是機(jī)體內(nèi)蝶呤合成途徑中一種中間代謝產(chǎn)物，能反映機(jī)體細(xì)胞免疫活化和炎癥反應(yīng)狀態(tài)，血清新蝶呤升高與急性冠脈綜合征患者冠狀動(dòng)脈病變程度有關(guān)[6-7]。豆莢蛋白是免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要因子，能通過(guò)蛋白水解激活先天免疫系統(tǒng)的Toll 樣受體，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)豆莢蛋白在頸AS斑塊中表達(dá)上調(diào)，可能成為AS 的生物標(biāo)志物[9]。Wnt1-誘導(dǎo)的信號(hào)通路蛋白1（Wnt1-induced signaling pathway protein 1，WISP1）是脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪因子，與代謝紊亂和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）有關(guān)，同時(shí)Wnt 信號(hào)通路參與AS 發(fā)生、發(fā)展，且研究發(fā)現(xiàn)血清WISP1 水平是冠心病的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[10-12]。然而到目前為止，關(guān)于血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平與T2DM 合并LEAD 的關(guān)系仍不明確。基于此，本研究分析了T2DM 合并LEAD 患者血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平與炎癥反應(yīng)指標(biāo)、糖代謝及脂代謝指標(biāo)的關(guān)系，并探討3 者預(yù)測(cè)T2DM 合并LEAD 的價(jià)值，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2021 年1 月至2022 年1 月哈爾濱市第一醫(yī)院收治的T2DM 患者114 例為T(mén)2DM 組，其中男60 例，女54 例；年齡34～84（62.25±10.47）歲；BMI 17～26（21.96±2.15）kg/m2；T2DM 病 程5.00（3.00，9.25）年。另?yè)裢谠诒驹哼M(jìn)行體檢的健康志愿者52名為對(duì)照組，其中男28 名，女24 名；年齡32～81（61.51±8.65）歲；BMI 18～26（22.05±1.68）kg/m2。兩組對(duì)象性別、年齡、BMI 等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。T2DM 組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2017 年版）》T2DM 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1 型糖尿病、妊娠期糖尿病等其他類型糖尿病，合并感染性疾病、冠心病或腦卒中，有高血壓史、腦卒中史、高脂血癥史，合并嚴(yán)重肝腎功能損害、造血和免疫系統(tǒng)損害、惡性腫瘤者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：202012261），患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 患者一般資料收集 收集T2DM 組患者T2DM病程、吸煙情況，使用日本歐姆龍HEM-7200 電子血壓計(jì)測(cè)量患者入院時(shí)的收縮壓和舒張壓。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 采集T2DM 組患者入院后次日清晨和對(duì)照組體檢時(shí)6 mL 外周靜脈血，收集血清。（1）炎癥反應(yīng)指標(biāo)：采用粒子增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定CRP 水平，采用ELISA 法測(cè)定IL-6 水平。（2）糖代謝指標(biāo)：采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司AU5800 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)FBG，采用放射免疫法測(cè)定空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS），采用高效液相色譜法測(cè)定糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1C，HbA1C），并根據(jù)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估（homeostasis model assessment，HOMA）計(jì)算HOMAIR＝FBG（mmol/L）×FINS（μU/mL）/22.5。（3）脂代謝指標(biāo)：采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司AU5800 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。（4）其他相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司AU5800 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿酸（uric acid，UA）、ALT、AST 水平，采用ELISA 法測(cè)定新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平。試劑盒均購(gòu)自上海梵態(tài)生物科技有限公司，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別＜10%和＜15%。

1.2.3 踝肱指數(shù)測(cè)量 所有T2DM 患者入院后均測(cè)量踝肱指數(shù)，患者取仰臥位，采用法國(guó)聲科影像公司生產(chǎn)的MACH 40 超聲多普勒血流探測(cè)儀測(cè)定踝部動(dòng)脈收縮壓和同側(cè)肱動(dòng)脈收縮壓，兩者比值即為踝肱指數(shù)。參考《中國(guó)2 型糖尿病防治指南（2017 年版）》將靜息踝肱指數(shù)≤0.90 的患者診斷為L(zhǎng)EAD，或運(yùn)動(dòng)時(shí)下肢不適，靜息踝肱指數(shù)≥0.90，但踏車(chē)平板試驗(yàn)后踝肱指數(shù)下降15%～20%也診斷為L(zhǎng)EAD[13]。根據(jù)是否合并LEAD 將T2DM 組患者分為L(zhǎng)EAD 亞組和非LEAD 亞組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 28.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。Pearson 相關(guān)或Spearman 秩相關(guān)分析血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平與炎癥反應(yīng)、糖代謝及脂代謝指標(biāo)的相關(guān)性；多因素logistic 回歸分析T2DM 合并LEAD 的危險(xiǎn)因素；ROC 曲線分析血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平單獨(dú)與聯(lián)合預(yù)測(cè)T2DM 合并LEAD 的效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組對(duì)象血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平比較 T2DM 組血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平均高于對(duì)照組（均P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 兩組對(duì)象血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平比較

2.2 兩亞組患者一般資料和血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平比較 LEAD 亞組T2DM 病程長(zhǎng)于非LEAD亞組，年齡、吸煙比例和CRP、IL-6、LDL-C、FBG、HbA1C、HOMA-IR、新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平均高于非LEAD 亞組（均P＜0.05），余指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩亞組患者一般資料和血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平比較

2.3 血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平與炎癥反應(yīng)、糖代謝及脂代謝指標(biāo)的相關(guān)性分析 血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平與CRP、IL-6、LDL-C、FBG、HbA1C和HOMA-IR 均呈正相關(guān)（均P＜0.05）；與TC、TG、HDL-C、FINS 均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平與炎癥反應(yīng)、糖代謝及脂代謝指標(biāo)的相關(guān)性

2.4 T2DM 合并LEAD 的多因素logistic 回歸分析 以年齡、T2DM 病程、吸煙（有=1，無(wú)=0）、CRP、IL-6、LDLC、FBG、HbA1C、HOMA-IR、新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1為自變量，建立多因素logistic 回歸模型。結(jié)果顯示，年齡、T2DM 病程、吸煙、CRP、IL-6、LDL-C、HbA1C、HOMA-IR、新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 均為T(mén)2DM 合并LEAD 的危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 T2DM 合并LEAD 的多因素logistic 回歸分析

2.5 血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)T2DM 合并LEAD 的預(yù)測(cè)效能 ROC 曲線顯示，血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)T2DM 合并LEAD 的AUC 大于新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 單獨(dú)檢測(cè)預(yù)測(cè)（Z=4.115、3.540、3.633，均P＜0.01），見(jiàn)表5、圖1。

表5 血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 單獨(dú)與聯(lián)合檢測(cè)對(duì)T2DM合并LEAD 的預(yù)測(cè)效能分析

圖1 血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平單獨(dú)與聯(lián)合預(yù)測(cè)T2DM 合 并LEAD 的ROC 曲線

3 討論

T2DM 合并LEAD 具有病變廣泛的特點(diǎn)，不僅存在中、大動(dòng)脈病變，更多的涉及膝下中、小動(dòng)脈，以血管中膜鈣化、節(jié)段性狹窄或閉塞為主要表現(xiàn)，是糖尿病足潰瘍發(fā)生的最重要機(jī)制，也是T2DM 患者致殘的主要原因之一[14]。數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)＞50 歲T2DM 患者LEAD 發(fā)生率為21.2%，LEAD 導(dǎo)致的足潰瘍復(fù)發(fā)率和截肢率較糖尿病神經(jīng)病變導(dǎo)致的足潰瘍更高[15]。同時(shí)作為全身動(dòng)脈病變的局部表現(xiàn)，LEAD 的存在還會(huì)增加心血管事件發(fā)生率，LEAD 確診1 年后心血管事件發(fā)生率為21.1%，是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[16]。由于T2DM 合并LEAD 具備自身病理和解剖的特點(diǎn)，易合并糖尿病神經(jīng)病變，可掩蓋疼痛，待出現(xiàn)間歇性跛行、動(dòng)脈搏動(dòng)減弱時(shí)已是LEAD 的中晚期，因此早期發(fā)現(xiàn)LEAD 并積極給予治療，對(duì)阻止或延遲截肢的發(fā)生和預(yù)防心血管事件具有重要意義。

AS 是LEAD 發(fā)生的根本病因，而血管內(nèi)皮功能障礙是AS 發(fā)生的始動(dòng)因素，其中炎癥貫穿AS 發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過(guò)程，糖尿病高血糖狀態(tài)下糖化蛋白質(zhì)和核酸等大分子形成晚期糖基化終末產(chǎn)物，增加內(nèi)皮細(xì)胞中促炎細(xì)胞釋放，直接損害內(nèi)皮促進(jìn)AS[4]。新蝶呤是單核來(lái)源的巨噬細(xì)胞在IFN-γ 的作用下活化時(shí)合成和釋放的一種炎癥因子，由于IFN-γ 的釋放與Th 的活化呈因果關(guān)系，因此新蝶呤的產(chǎn)生與免疫細(xì)胞的活化直接相關(guān)[17]。巨噬細(xì)胞的活化參與新蝶呤合成和釋放，同時(shí)作為炎性因子的主要來(lái)源，巨噬細(xì)胞釋放的炎癥因子能參與血管內(nèi)皮功能障礙，促炎型和抗炎型巨噬細(xì)胞的不平衡影響AS 斑塊穩(wěn)定性[18]。本研究結(jié)果顯示，T2DM 患者血清新蝶呤水平升高，分析可能與T2DM 引起免疫細(xì)胞活化導(dǎo)致新蝶呤大量表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，T2DM 合并LEAD 患者血清新蝶呤水平進(jìn)一步升高，是T2DM 合并LEAD 的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明新蝶呤與T2DM 合并LEAD 密切相關(guān)，分析其可能的原因是新蝶呤作為免疫細(xì)胞活化的標(biāo)志，高水平新蝶呤反映炎性因子大量釋放參與AS 進(jìn)展，最終引起LEAD。本研究結(jié)果也顯示，血清新蝶呤與CRP 和IL-6 水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。

豆莢蛋白是半胱氨酸蛋白酶家族一員，巨噬細(xì)胞中表達(dá)最高，在巨噬細(xì)胞活化時(shí)釋放以誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移和聚集，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豆莢蛋白mRNA 表達(dá)隨著小鼠主動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展而增加，與AS 病變中巨噬細(xì)胞釋放的炎癥細(xì)胞積累增加有關(guān)[19]。同時(shí)試驗(yàn)指出，AS 患者血漿和斑塊中豆莢蛋白水平升高[9]。本研究結(jié)果顯示，T2DM 患者血清豆莢蛋白水平升高，分析可能與T2DM 患者高血糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化引起豆莢蛋白大量表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，T2DM 合并LEAD 患者血清豆莢蛋白水平進(jìn)一步升高，是T2DM 合并LEAD 的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明豆莢蛋白與T2DM 合并LEAD 密切相關(guān)，與豆莢蛋白大量表達(dá)反映巨噬細(xì)胞大量活化，釋放炎癥細(xì)胞因子參與AS 有關(guān)。Ozawa 等[20]研究指出，豆莢蛋白基因表達(dá)受促炎細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)節(jié)，豆莢蛋白能增強(qiáng)促炎型巨噬細(xì)胞表型發(fā)展和誘導(dǎo)LDL 氧化，促進(jìn)AS 發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果也顯示，T2DM 合并LEAD 患者血清豆莢蛋白與CRP 和IL-6 水平呈正相關(guān)，說(shuō)明豆莢蛋白可能通過(guò)炎癥反應(yīng)參與LEAD 發(fā)生。

WISP1 作為一種新型的炎癥相關(guān)脂肪因子，在機(jī)體慢性炎癥導(dǎo)致的肥胖、IR 和AS 中發(fā)揮重要作用[21]。實(shí)驗(yàn)顯示，循環(huán)中WISP1 表達(dá)受肥胖調(diào)節(jié)，在高脂喂養(yǎng)的小鼠循環(huán)中WISP1 水平升高，并能通過(guò)Toll 樣受體激活炎癥因子促進(jìn)IR[22]。血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖是AS 過(guò)程中的重要一環(huán)，在培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞中，WISP1 以劑量依賴性方式刺激血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖[23]。這些研究提示，WISP1 可能與糖尿病患者AS 有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，T2DM 患者血清WISP1 水平升高，分析可能與T2DM 患者高血糖引起脂肪代謝紊亂誘導(dǎo)WISP1 大量表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，WISP1 水平升高是T2DM 合并LEAD 的危險(xiǎn)因素，說(shuō)明WISP1 與T2DM 合并LEAD 密切相關(guān)，可能與WISP1 能引起巨噬細(xì)胞大量活化，釋放炎癥因子參與AS 有關(guān)。研究表明，人類脂肪組織中WISP1 mRNA 表達(dá)與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)，體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞被WISP1 刺激后能增加IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 等促炎細(xì)胞因子表達(dá)[24]。本研究結(jié)果也顯示，血清WISP1 與CRP 和IL-6 水平呈正相關(guān)，與上述研究結(jié)論相符。

糖脂代謝紊亂是AS 的促進(jìn)因素，也是T2DM 合并LEAD 的病理特點(diǎn)，其中LDL-C 在血管內(nèi)皮細(xì)胞下的聚集是AS 發(fā)生的必要條件，降低LDL-C 水平能顯著降低T2DM 患者合并LEAD 的風(fēng)險(xiǎn)[25-26]。本研究中LDL-C、HbA1C、HOMA-IR 均為T(mén)2DM 合并LEAD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說(shuō)明糖脂代謝紊亂與T2DM 合并LEAD 獨(dú)立相關(guān)。同時(shí)結(jié)果顯示，血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平與LDL-C、FBG、HbA1C、HOMA-IR 均呈正相關(guān)，說(shuō)明新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平升高可能通過(guò)糖脂代謝紊亂參與LEAD 發(fā)生，糖脂代謝紊亂均能誘發(fā)炎癥，而炎癥也能促進(jìn)脂代謝紊亂和IR。研究表明，炎癥能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的攝取和蓄積導(dǎo)致脂代謝紊亂，同時(shí)也能通過(guò)干擾、損害胰島素信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致IR[27-28]。本研究中FBG 并非T2DM 合并LEAD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，考慮與FBG 影響因素較多有關(guān)。與既往報(bào)道相似，本研究中年齡和吸煙也與T2DM 合并LEAD 相關(guān)[14]。T2DM 患者隨著年齡增大，血管壁硬化指數(shù)越高，同時(shí)年齡越大T2DM 病程越長(zhǎng)，合并吸煙、高血脂等危險(xiǎn)因素越多，因此更容易發(fā)生LEAD。香煙中尼古丁能損傷動(dòng)脈血管壁，并增加循環(huán)中LDL 的氧化修飾，同時(shí)影響凝血和纖溶系統(tǒng)導(dǎo)致AS[29-30]。本研究ROC 曲線分析結(jié)果表明，血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平對(duì)T2DM 合并LEAD 均具有一定的預(yù)測(cè)效能，且聯(lián)合檢測(cè)能提升對(duì)T2DM 合并LEAD 的預(yù)測(cè)效能，更好地指導(dǎo)臨床。

綜上所述，血清新蝶呤、豆莢蛋白、WISP1 水平的升高與T2DM 合并LEAD 存在相關(guān)性，可作為T(mén)2DM 合并LEAD 的輔助預(yù)測(cè)指標(biāo)，但本研究為單中心小樣本研究，可能存在選擇偏倚，還需多中心大樣本研究來(lái)證實(shí)，同時(shí)多數(shù)入選的T2DM 患者并非新發(fā)患者，不能排除降糖藥物和胰島素等因素的影響，在今后的研究中應(yīng)對(duì)上述不足予以改進(jìn)。