張小博 趙華山 馬鵬飛

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是由感染乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）造成的肝臟疾病，其主要病理基礎(chǔ)是肝纖維化，隨著病情的發(fā)展可進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌，具有較高的致死率，對家庭及醫(yī)療系統(tǒng)均造成了一定的負(fù)擔(dān)[1]。在肝纖維化發(fā)生初期，及時(shí)采取有效的治療措施能一定程度逆轉(zhuǎn)肝纖維化，因此在乙型肝炎患者抗病毒治療的過程中，明確早期肝纖維化的影響因素，并及早做出有效診斷以采取干預(yù)措施逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展，對于改善預(yù)后有重要意義[2]。目前臨床診斷肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”是肝組織活檢，該方式屬于有創(chuàng)操作，難以廣泛開展，而常用的透明質(zhì)酸、四型膠原、Ⅲ型前膠原肽、層黏連蛋白等血液肝纖維化指標(biāo)對早期肝纖維化診斷的特異性較差[3，4]。故尋求更為有效地反映肝纖維化早期的無創(chuàng)指標(biāo)具有重要意義。miRNAs 作為廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的非編碼單鏈RNA 分子，在細(xì)胞增殖、凋亡、脂肪代謝等方面發(fā)揮一系列的調(diào)控作用，成為近年來各種臨床疾病診療、發(fā)病機(jī)制、預(yù)后預(yù)測的研究熱點(diǎn)。國內(nèi)外學(xué)者通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、高通量芯片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)多種miRNAs 在人與動(dòng)物的各種疾病中差異表達(dá)，其中miR-143、miR-21 被證實(shí)在HBV 相關(guān)性肝病中異常表達(dá)[5，6]。但關(guān)于二者對肝纖維化早期診斷價(jià)值的相關(guān)研究較少。故本研究以2019 年6 月～2020 年6 月收治的89 例CHB 患者為研究對象，分析血清miR-143、miR-21 對HBV 相關(guān)性肝纖維化的早期診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2019 年6 月～2020 年6 月在我院就診的CHB 患者89 例作為疾病組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015 年更新版）》[7]診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)皮肝組織活檢確定肝纖維化分期≤S1 期；②入院前6 個(gè)月內(nèi)未接受相關(guān)治療；③年齡≥18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除存在非HBV 造成的其他肝病毒感染者；②存在肝癌、酒精性肝炎、藥物性肝炎、自身免疫性肝炎、脂肪肝等其他肝臟炎癥者；③伴有肝血管瘤、血吸蟲肝病者。另選取年齡、性別相匹配的健康體檢者90 例作為對照組。疾病組中男50 例，女39 例，年齡19～65 歲，平均（35.52±10.23）歲；對照組中男47 例，女43 例，年齡18～65 歲，平均（35.60±12.12）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究開展前受試者均知情同意且簽署知情同意書，研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》倫理道德標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-143、miR-21 檢測收集患者檢驗(yàn)室剩余血液，分離血清后以RNA 提取試劑盒提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，按照試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系（試劑盒均購于廣州賽百純生物科技有限公司），反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min，95℃變性20s，58℃退火20s，72℃延伸28s，重復(fù)35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，以U6 為內(nèi)參，2-△△Ct為目的基因的相對表達(dá)量，引物序列miR-143：5'-TAGCTATCGATGACGATACGCGCT-3'（F），5'-G TGTATATCAGCGTAACGATCCA-3'（R）；miR-21：5'-ACTCTACTGTATAAGCTCTGA-3'（F），5'-CAGC TATGCATCTACTACGGC-3'（R）；U6：5'-TCCCATC GATTACGTAGCCGAGCT-3'（F），5'-GGCAATCAGA ATACCTGTGTATC-3'（R）。

1.2.2 其他血清生化指標(biāo)檢測 收集患者檢驗(yàn)室剩余血液4mL，以BC-5000 全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）檢測天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、白蛋白（Albumin，ALB）、總膽紅素（Total bilirubin，TBil）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glu-tamyltranspeptidase，γ-GT）、凝血酶原時(shí)間（Prothrombin time，PT）、白細(xì)胞（White blood cells，WBC）、血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）、血小板（Platelet，PLT）；熒光定量PCR 檢測HBV-DNA復(fù)制水平，雅培i2000SR 化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑檢測乙肝五項(xiàng)[乙肝表面抗原（Hepatitis B

surface antigen，HBsAg）、乙肝表面抗體（Hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙肝e 抗原（Hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙肝e 抗體（Hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙肝核心抗體（Hepatitis B core antibody，HBcAb）]，相關(guān)儀器試劑購于美國雅培有限公司（中國）。

1.2.3 肝組織病理學(xué)檢查 疾病組患者實(shí)施肝組織病理學(xué)檢查，在B 超引導(dǎo)下進(jìn)行肝臟穿刺獲取肝組織標(biāo)本，至少獲得6 個(gè)匯管區(qū)標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋，由2 名工作經(jīng)驗(yàn)5 年以上病理科醫(yī)師對肝臟標(biāo)本組織進(jìn)行診斷，按照國際Scheuer 系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)[8]，肝纖維化程度分為S0 期：無纖維化；S1 期：匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大；S2 期：匯管區(qū)周圍纖維化/纖維間隔形成；S3 期：纖維化伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂；S4 期：肝硬化。其中S1 期為肝纖維化早期。

1.2.4 觀察指標(biāo) 包括性別、年齡、飲酒史、吸煙史、乙肝家族史、肝硬化家族史、肝癌家族史、血清生化指標(biāo)等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以四分位數(shù)間距[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用Z檢驗(yàn)；多因素Logistic 回歸分析影響早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的危險(xiǎn)因素；建立受試者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲線，分析血清miR-143、miR-21 對早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的診斷價(jià)值，計(jì)算ROC 曲線下面積（Area under curve，AUC）。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組肝功能指標(biāo)比較與對照組比較，疾病組ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil 水平更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；兩組PT、ALB 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組肝功能指標(biāo)比較（）

表1 兩組肝功能指標(biāo)比較（）

2.2 兩組血清miR-143、miR-21 水平比較與對照組比較，疾病組S0 期、S1 期miR-143、miR-21 相對表達(dá)量更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；與S0期比較，S1 期miR-143、miR-21 相對表達(dá)量更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見圖1。

圖1 血清miR-143、miR-21 表達(dá)水平箱型圖

2.3 疾病組早期肝纖維化與無肝纖維化患者血清miR-143、miR-21 表達(dá)水平及其他因素差異疾病組病理結(jié)果顯示42 例S1 期（早期纖維化），47 例S0 期（無纖維化）。早期肝纖維化患者AST、ALP、miR-143、miR-21 水平及HBV-DNA 病毒載量>1×107copy/mL 占比均高于無纖維化患者，ALB 水平低于無纖維化患者（P<0.05）；兩組性別、年齡、飲酒史、吸煙史、乙肝家族史、肝硬化家族史、肝癌家族史、ALT、TBil、γ-GT、PT、Hb、WBC、PLT 水平及HBeAg、HBeAb、HBcAb 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 兩組血清miR-143、miR-21 表達(dá)水平及其他因素比較

2.4 影響早期HBV 相關(guān)性肝纖維化發(fā)生的多因素Logistic 回歸分析將單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的自變量納入多因素Logistic 回歸分析，采用向前似然比法，引入變量標(biāo)準(zhǔn)α入=0.05，剔除標(biāo)準(zhǔn)α出=0.10，以CHB 患者是否存在早期肝纖維化（無纖維化=0，有早期纖維化=1）為因變量，進(jìn)入Logistic回歸分析模型，結(jié)果顯示：miR-21、miR-143、HBVDNA 病毒載量>1×107copy/mL、ALP 是影響早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表3。

表3 影響HBV 相關(guān)性肝纖維化早期發(fā)生的多因素Logistic 回歸分析

2.5 血清miR-143、miR-21 對早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的診斷價(jià)值ROC 曲線顯示：血清miR-143 聯(lián)合miR-21 診斷早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的靈敏度、約登指數(shù)、AUC 均大于血清miR-143 與miR-21 單獨(dú)診斷。見表4、圖3。

圖3 血清miR-143、miR-21 診斷早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的ROC 曲線

表4 血清miR-143、miR-21 對早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的診斷效能

3 討論

CHB 是我國常見肝臟傳染性疾病，目前尚無有效根治措施。資料顯示[9]，我國2005～2016 年全國CHB 報(bào)告發(fā)病率從27.01/10 萬上升至60.08/10 萬，且≥20 歲人群CHB 報(bào)告發(fā)病率上升趨勢更為明顯，對居民健康造成了嚴(yán)重威脅。當(dāng)機(jī)體感染HBV后，進(jìn)入慢性乙肝期，肝臟的自我損傷修復(fù)導(dǎo)致肝纖維化，隨著纖維化的持續(xù)發(fā)展，肝臟修復(fù)過程失調(diào)，逐漸轉(zhuǎn)化為肝硬化及肝癌，進(jìn)而危及患者生命[10]。在肝臟纖維化發(fā)展的過程中，去除影響肝臟損傷的相關(guān)因素，并進(jìn)行有效地保肝治療可延緩纖維化進(jìn)展甚至逆轉(zhuǎn)這一過程，降低肝硬化及肝癌等嚴(yán)重肝臟病變風(fēng)險(xiǎn)[11]。因此，在肝纖維化早期明確肝纖維化進(jìn)程的影響因素并及時(shí)進(jìn)行有效的診斷，監(jiān)測病情進(jìn)展，以采取針對性的治療方案是改善預(yù)后的關(guān)鍵。

近年來miRNAs 的表達(dá)差異逐漸成為各種疾病的相關(guān)研究熱點(diǎn)，并成為早期診斷及病情監(jiān)測的有效預(yù)警性標(biāo)志。miRNAs 能特異性地與靶mRNA 的3'端非翻譯區(qū)結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與胚胎的發(fā)育、感染與防御，細(xì)胞的增殖、凋亡、脂肪的代謝等生命活動(dòng)[12]。miR-143 與miR-21 是miRNAs 成員，均參與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。Zhang 等[13]采用TaqMan 低密度陣列和實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)，在HBV 肝硬化、正常肝臟和肝細(xì)胞癌組織中篩選了差異表達(dá)的miRNA，認(rèn)為miR-143 可用于HBV 早期診斷、肝硬化及總生存期預(yù)測。朱錦宏等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-143 在HBV 相關(guān)肝病患者中有異常表達(dá)，其在健康對照者、慢性乙肝、乙肝肝硬化、乙肝肝癌患者中的表達(dá)量逐漸升高，提示miR-143 與乙肝相關(guān)肝病患者病情進(jìn)展有關(guān)。另有研究[15]發(fā)現(xiàn)，miR-143 啟動(dòng)子中rs4705342 多態(tài)性可通過改變HBV 誘導(dǎo)的核因子κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，從而引起HBV 感染，并促進(jìn)乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生。Dundar 等[16]發(fā)現(xiàn)miR-21 的過表達(dá)與HBV 介導(dǎo)的肝細(xì)胞癌肝移植患者復(fù)發(fā)有關(guān)。Jiang 等[17]認(rèn)為miR-21 水平與肝臟代償失調(diào)的程度密切相關(guān)，可用于評估肝硬化嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果中，疾病組ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil 水平及miR-143 與miR-21 相對表達(dá)量均高于對照組，證實(shí)miR-143、miR-21 在CHB 患者中異常表達(dá)。

本研究通過單因素分析發(fā)現(xiàn)疾病組發(fā)生早期肝纖維化患者的AST、ALP、miR-143、miR-21 水平及HBV-DNA 病毒載量>1×107copy/mL 占比均高于無纖維化患者，ALB 水平低于無纖維化患者。進(jìn)一步行多因素Logistic 回歸分析顯示miR-21、miR-143、HBV-DNA 病毒載量>1×107copy/mL、ALP 是影響早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的危險(xiǎn)因素，說明miR-21、miR-143 的異常表達(dá)可增加早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。HBV 相關(guān)性肝纖維化的病理變化表現(xiàn)為HBV 感染后在肝臟進(jìn)行大量的復(fù)制，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)的病毒清除機(jī)制，引發(fā)免疫炎性損傷，導(dǎo)致肝細(xì)胞的損害，隨之肝臟組織進(jìn)行自我修復(fù)，這一過程導(dǎo)致肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生，進(jìn)而發(fā)生肝纖維化[18]。而miR-143、miR-21 均可通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，參與肝纖維化的發(fā)展，因此其表達(dá)水平的異常可導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控失衡，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。此外本研究中ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-143 與miR-21 聯(lián)合診斷早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的靈敏度、約登指數(shù)與AUC 均大于單獨(dú)診斷，提示miR-143 聯(lián)合miR-21 對早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的診斷效能較好。miRNAs 在血液中的穩(wěn)定性較好，具有重復(fù)性和特異性高的特點(diǎn)，可考慮將miR-143 與miR-21 作為監(jiān)測早期HBV 相關(guān)性肝纖維化發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，血清miR-143、miR-21 在CHB 患者中異常表達(dá)，且二者均是影響早期HBV 相關(guān)性肝纖維化發(fā)生的相關(guān)因素，對早期HBV 相關(guān)性肝纖維化有較高的診斷價(jià)值，可考慮作為診斷早期HBV 相關(guān)性肝纖維化的生物學(xué)標(biāo)志物。