鐘世順 梁瑋 許炎欽 劉進(jìn)生

腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在男性和女性中均居前五位[1]。隨著治療技術(shù)的發(fā)展，腸癌患者5 年生存率在過去20 年中逐漸提高[2]，但死亡率仍然較高。因此，挖掘腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物標(biāo)志物具有重要意義。

乳酸是糖無(wú)氧酵解代謝的終產(chǎn)物，以前被認(rèn)為是癌癥進(jìn)展中的無(wú)用代謝物。最近的研究表明，乳酸是癌癥發(fā)展、維持腫瘤微環(huán)境和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)劑[3]。在乳腺癌中，乳酸相關(guān)基因GPR81 表達(dá)上調(diào)并通過從腫瘤細(xì)胞中釋放乳酸來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[4]；有研究表明，乳酸脫氫酶A 是腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后標(biāo)志物[5]。乳酸/BDNF/TrkB 信號(hào)可介導(dǎo)上皮-間質(zhì)相互作用并導(dǎo)致胃癌細(xì)胞對(duì)安羅替尼產(chǎn)生耐藥性[6]。有研究表明，乳酸與腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)，乳酸水平升高是腫瘤微環(huán)境酸中毒的主要原因，其抑制CD8+和CD4+效應(yīng)T 細(xì)胞功能，并有利于免疫抑制性Treg 細(xì)胞的發(fā)育[7]。

乳酸在癌癥進(jìn)展、預(yù)后和免疫微環(huán)境中具有重要價(jià)值。然而，乳酸相關(guān)基因在腸癌中尚未得到很好的研究。本研究開發(fā)并驗(yàn)證了一種乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型來(lái)預(yù)測(cè)腸癌患者的預(yù)后及免疫浸潤(rùn)，可能為腸癌患者預(yù)后評(píng)估提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集本研究利用TCGA 及GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得腸癌患者癌組織及癌旁組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，TCGA 腸癌數(shù)據(jù)集包含456 例腸癌患者癌組織及41 例癌旁組織，GSE39582 數(shù)據(jù)集包含585 例腸癌患者組織及臨床數(shù)據(jù)。通過“乳酸”作為搜索關(guān)鍵詞查詢Molecular Signatures Database（MSigDB）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了284 個(gè)乳酸相關(guān)基因。

1.2 鑒定腸癌中差異表達(dá)的乳酸相關(guān)基因利用“ limma”R 包分析TCGA 數(shù)據(jù)集中腸癌組織和癌旁組織的差異表達(dá)中乳酸相關(guān)基因。將|log2FC|≥0.585 且FDR<0.05 的基因定義為差異表達(dá)基因。

1.3 腸癌乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型的構(gòu)建和驗(yàn)證利用單變量Cox 回歸分析確定了具有預(yù)后價(jià)值的乳酸相關(guān)基因，然后使用“glmnet”R 包對(duì)單變量Cox回歸分析獲得的具有預(yù)后價(jià)值的基因進(jìn)行LASSO回歸分析。在LASSO 分析中，先通過10 倍交叉驗(yàn)證檢測(cè)獲得最佳調(diào)諧參數(shù)lambda（λ），根據(jù)最佳λ 值獲得具有系數(shù)的預(yù)后基因列表。乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型Risk Score 的得分為每個(gè)基因的系數(shù)×相應(yīng)基因的表達(dá)值的總和。Kaplan-Meier 生存分析對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行預(yù)后評(píng)估。此外，按照年齡、性別及stage 對(duì)腸癌患者進(jìn)行亞組分層，評(píng)估預(yù)后模型在不同亞組中的臨床價(jià)值。

1.4 評(píng)估兩個(gè)Risk score 組的免疫浸潤(rùn)基于TCGA 腸癌數(shù)據(jù)，并通過CIBERSORT 算法評(píng)估每個(gè)腸癌組織中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的比例，分析不同風(fēng)險(xiǎn)組的免疫浸潤(rùn)差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Student't檢驗(yàn)計(jì)算差異性表達(dá)。通過Kaplan-Meier 方法計(jì)算總生存率，并通過log-rank test 檢驗(yàn)分析各組之間的差異。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鑒定腸癌患者組織中差異表達(dá)的乳酸相關(guān)基因基于TCGA 數(shù)據(jù)集，我們分析了284 個(gè)乳酸相關(guān)基因在腸癌患者組織及癌旁組織中的差異表達(dá)。結(jié)果顯示與癌旁組織相比，腸癌組織中有36 個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，42 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)（見圖1），其中表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最高的前5 個(gè)基因分別是HS6ST2、CA5A、PUS1、TWNK 和PNPT1；下調(diào)倍數(shù)最高的前5 個(gè)基因分別是COX6A2、PCK1、LDHD、LDHAL6B 和SLC3A1。

圖1 基于TCGA 數(shù)據(jù)分析腸癌患者組織中差異表達(dá)的乳酸相關(guān)基因

2.2 乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型的開發(fā)與評(píng)估通過單變量Cox 回歸分析78 個(gè)差異表達(dá)基因?qū)δc癌患者預(yù)后的影響。結(jié)果顯示TPK1 及MPC1 是腸癌患者的預(yù)后影響因素（見圖2A）。利用LASSO 回歸分析建立乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型。結(jié)果顯示當(dāng)LASSO 模型中的調(diào)諧參數(shù)（λ）=0.0017 時(shí)，模型可以達(dá)到最佳擬合（見圖2B）。此時(shí)，TPK1 和MPC1基因的LASSO 系數(shù)分別是-0.307 和-0.309（見圖2C）。因此，乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型Risk Score=（-0.307×TPK1 表達(dá)量）+（-0.309×MPC1 表達(dá)量）。隨后，我們?cè)u(píng)估了乳酸相關(guān)基因預(yù)后評(píng)估模型在腸癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)中的能力。Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果表明Risk Score 高（高風(fēng)險(xiǎn)組）的患者生存期顯著短于Risk Score 低（低風(fēng)險(xiǎn)組）的腸癌患者（見圖2D）。圖2E 展示了Risk Score 相關(guān)基因、Risk Score 及腸癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性。從圖中可看出TPK1 和MPC1 基因的表達(dá)越低，則Risk Score越高；Risk score 越高，則腸癌患者預(yù)后越差。

圖2 乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型的構(gòu)建

為了評(píng)估乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型的穩(wěn)定性，我們將腸癌患者進(jìn)行分層及Kaplan-Meier 生存分析，以進(jìn)一步探討該預(yù)后模型是否適用于不同的臨床亞組。在女性腸癌患者（見圖3A）及男性腸癌患者（見圖3B）的亞組中，高風(fēng)險(xiǎn)組的患者整體生存顯著差于低風(fēng)險(xiǎn)組。在患者年齡≤60 歲（見圖3C）、患者年齡>60 歲（見圖3D）、患者Stage=1&2（見圖3E）及患者Stage=3&4（見圖3F）的亞組中，高風(fēng)險(xiǎn)組腸癌患者整體生存也是顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組。

圖3 預(yù)后模型的不同臨床亞組驗(yàn)證

2.3 乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型的驗(yàn)證為了進(jìn)一步評(píng)估該預(yù)后模型的有效性，我們使用了GSE39582腸癌數(shù)據(jù)集作為驗(yàn)證集。生存分析結(jié)果顯示，在GSE39582 數(shù)據(jù)集中，高風(fēng)險(xiǎn)組的腸癌患者整體生存顯著差于低風(fēng)險(xiǎn)組（見圖4）。

圖4 預(yù)后模型的驗(yàn)證

2.4 乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型與免疫浸潤(rùn)為了進(jìn)一步研究?jī)蓚€(gè)風(fēng)險(xiǎn)組間的免疫浸潤(rùn)差異，利用CIBERSORT 分析兩組之間的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果表明在低風(fēng)險(xiǎn)組中，T cells CD4 memory resting免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況顯著低于高風(fēng)險(xiǎn)組（見圖5）。

圖5 高風(fēng)險(xiǎn)組及低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫浸潤(rùn)分析

2.5 Nomogram 的構(gòu)建和評(píng)估為了使我們的模型更好地輔助臨床決策，我們構(gòu)建了一個(gè)列線圖來(lái)預(yù)測(cè)1 年、3 年和5 年的生存率（見圖6A），校準(zhǔn)曲線證明我們的預(yù)后列線圖可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)生存率（見圖6B）。

圖6 Nomogram 的構(gòu)建與評(píng)估

3 討論

腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其特征在于腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的腫瘤異質(zhì)性會(huì)使腸癌的治療復(fù)雜化[8，9]。最近的研究揭示了乳酸在腫瘤免疫微環(huán)境中的不同作用。盡管癌細(xì)胞有足夠的氧氣供應(yīng)，但仍然會(huì)消耗葡萄糖并過度產(chǎn)生乳酸，這可能會(huì)導(dǎo)致酸中毒、血管生成和免疫抑制[10]。在多種腫瘤中，乳酸對(duì)于預(yù)測(cè)預(yù)后和腫瘤微環(huán)境至關(guān)重要[11]。然而，乳酸在腸癌中的預(yù)后價(jià)值在很大程度上仍然未知。本研究分析了乳酸相關(guān)基因在腸癌的預(yù)后預(yù)測(cè)及免疫微環(huán)境中的作用。

本研究先確定了78 個(gè)差異表達(dá)的乳酸相關(guān)基因，接著利用Cox 回歸分析、LASSO 分析構(gòu)建腸癌乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型，該模型包含TPK1 和MPC1 兩個(gè)基因。研究表明，TPK1 可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[12]。TPK1 在腸癌中的作用還未得到充分研究，目前的研究主要集中在肝癌、胰腺癌和宮頸癌等其他類型的腫瘤上。研究顯示，TPK1 可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的代謝和增殖，增強(qiáng)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13～15]。但是，TPK1 在腸癌發(fā)生、發(fā)展、治療等方面的具體作用還需進(jìn)一步研究。MPC1 是一種介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)丙酮酸轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)[16，17]。一些研究表明，MPC1 可以調(diào)節(jié)腸癌細(xì)胞的代謝和增殖，從而影響腸癌的發(fā)生和發(fā)展。具體來(lái)說(shuō)，MPC1 在腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平通常會(huì)升高，高表達(dá)的MPC1 會(huì)增加腸癌細(xì)胞對(duì)外源性丙酮酸的攝取和利用，從而增加腸癌細(xì)胞的代謝和增殖能力[18]。此外，MPC1 在腸癌細(xì)胞的生存和細(xì)胞內(nèi)ATP 生成中也發(fā)揮著重要作用。

進(jìn)一步的生存分析驗(yàn)證了腸癌乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型的可靠性。臨床亞組分層分析結(jié)果表明，該預(yù)后模型適用于不同的腸癌臨床亞組。考慮到免疫細(xì)胞在腫瘤免疫浸潤(rùn)中的重要性，我們進(jìn)一步評(píng)估了每個(gè)結(jié)腸癌標(biāo)本中免疫細(xì)胞的相對(duì)比例。有證據(jù)表明，腫瘤和微環(huán)境之間的相互作用在結(jié)腸癌的進(jìn)展和對(duì)免疫療法的反應(yīng)率中起至關(guān)重要的作用[19，20]。本研究發(fā)現(xiàn)低風(fēng)險(xiǎn)組中，T cells CD4 memory resting 免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況顯著低于高風(fēng)險(xiǎn)組。有研究發(fā)現(xiàn)T cells CD4 memory resting 浸潤(rùn)程度高與腸癌預(yù)后較差相關(guān)[8]。因此，乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型評(píng)估腸癌的預(yù)后價(jià)值可能與T cells CD4 memory resting 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度相關(guān)。此外，Nomogram 的構(gòu)建為臨床醫(yī)生做出決策提供參考。

本研究結(jié)果表明乳酸相關(guān)基因與腸癌患者預(yù)后密切相關(guān)，說(shuō)明乳酸可能與腸癌具有一定的關(guān)聯(lián)，但是同樣值得注意的是，除了人體器官會(huì)產(chǎn)生乳酸，雙歧桿菌等微生物也會(huì)產(chǎn)生乳酸。雙歧桿菌可以發(fā)酵腸道中的不可消化的多糖等物質(zhì)，產(chǎn)生乳酸和其他短鏈脂肪酸，為腸道細(xì)胞提供能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還可以降低腸道內(nèi)的pH 值，影響病原微生物的生長(zhǎng)[22]。相比于其他器官，腸道內(nèi)乳酸的來(lái)源相對(duì)復(fù)雜，有待進(jìn)一步深入挖掘乳酸在腸癌中的作用。

本研究存在一些局限性：首先，需要更多的臨床樣本來(lái)驗(yàn)證該預(yù)后模型；其次，需要進(jìn)一步研究乳酸與腸癌免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性。

綜上，本研究探討了乳酸相關(guān)基因與腸癌之間的關(guān)聯(lián)，通過建立乳酸相關(guān)基因預(yù)后模型以預(yù)測(cè)腸癌患者的存活率，可能為腸癌臨床診治提供一定的幫助。