伍學強

嵌合抗原受體T 細胞免疫療法（Chimeric antigen receptor T-Cell immunotherapy，CAR-T），是抗腫瘤治療最有發(fā)展前景的技術之一，目前已成為治療非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細胞白血病的研究熱點。從T 細胞的發(fā)現(xiàn)到轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展進步，從CAR-T 技術的產(chǎn)生到臨床應用，從在淋巴瘤、急性白血病等血液腫瘤中的應用到實體瘤的治療，CAR-T 技術逐步成熟。本研究通過對CAR-T 技術發(fā)展歷程的回顧，聚焦問題與挑戰(zhàn)，探討CAR-T 進一步發(fā)展的方向，以期造福更多腫瘤患者。

1 T 細胞的認識過程

1.1 T 細胞的發(fā)現(xiàn)1961 年，法裔澳大利亞科學家雅克·米勒（Jacques Miller）[1]領導完成了四項開創(chuàng)性研究，包括T 細胞的鑒定、T 細胞的選擇以及T細胞與其他免疫細胞的相互作用，并確定了胸腺并不是一個退化的器官，而是免疫細胞發(fā)育的關鍵部位，對于機體所需的復雜而微妙的免疫系統(tǒng)而言，胸腺是不可或缺的。1970 年，Cerottini、Nordin 和Brunner[2]等人證明，細胞毒性活性來自于胸腺來源的T 淋巴細胞。進一步研究發(fā)現(xiàn)，T 細胞不僅有細胞毒性活性，更具有免疫記憶，即在獲得性免疫中，機體對同一種抗原的再次出現(xiàn)，反應會更強烈。1971 年，Miller[3]和Gershon[4]研究小組分別通過不同的方法，獨立證明了T 細胞免疫記憶的存在。同時發(fā)現(xiàn)，T 細胞介導免疫反應，具有致病性。至20世紀70 年代，T 細胞被證實對自身免疫性疾病的啟動至關重要。Clagett 和Weigle[5]在一項早期研究中，用小鼠證明了實驗性自身免疫性甲狀腺炎的同種異體轉(zhuǎn)移需要T 細胞的存在。同時，研究者發(fā)現(xiàn)T 細胞在移植免疫和器官排斥反應中具有重要功能，這一發(fā)現(xiàn)是定義T 細胞異體識別途徑的關鍵基石。

1.2 T 細胞的分類

1.2.1 T 細胞亞群 早期研究發(fā)現(xiàn)，整個T 細胞群體可以被分為兩個具有不同功能和表型的亞群，后來被稱為CD4 和CD8 分子，分別標記這兩個主要具有輔助性功能和細胞毒性功能的T 細胞群體。1986 年，研究者[6]進一步發(fā)現(xiàn)CD4+T 細胞群體由一系列不同的亞群組成，并且這些亞群具有多種多樣的重要功能。這一研究證明了輔助性T 細胞（T helper cells，Th）的存在和不同特征，比如Th1 及Th2，這也是Th 細胞譜系異質(zhì)性研究的肇始。2005年發(fā)表的兩篇論文[7，8]，鑒定并描述了一種新的產(chǎn)生IL-17 的CD4+輔助性T 細胞譜系：Th17 細胞。這一發(fā)現(xiàn)及相關研究，澄清了這種獨特T 細胞亞群的分化過程和生物學特征。輔助性T 細胞主要為CD4+T 細胞，初始CD4+T 細胞（Th0）在各種抗原等的刺激下分化成包括Th1、Th2、Th17 在內(nèi)的多種Th。細胞毒性T 淋巴細胞（Cytotoxic lymphocyte，CTL）主要指CD8+T 細胞，主要在受損的體細胞中，通過細胞毒性蛋白觸發(fā)死亡途徑。

調(diào)節(jié)性T 細胞（Regulatory T cell，Treg）是T 細胞的獨特群體，可在抑制免疫反應中起作用。CD4+調(diào)節(jié)性T 細胞主要包括自然調(diào)節(jié)性T 細胞（Naturally occurring regulatory T cell，nTreg）及適應性調(diào)節(jié)性T 細胞（Adaptive regulatory T cell，aTreg），特征為高表 達CD25及轉(zhuǎn)錄因子FoxP3。1995 年，Shimon Sakaguchi[9]等發(fā)現(xiàn)，CD25 作為一種調(diào)節(jié)性T 細胞表面標記物，可以用來分離Treg。此外，Treg 還包括CD8+Treg，也與腫瘤及免疫疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。見圖1。

圖1 T 細胞的分類

1.2.2 T 細胞受體（T cell receptor，TCR）分型 TCR為所有T 細胞的特征性標志，主要包括兩種類型，分別是αβ 鏈受體和γδ 鏈受體。α 亞基和β亞基連結(jié)構(gòu)成αβ 鏈，這一類T 細胞被稱為αβ T 細胞，即我們通常所說的T 細胞，大約占95%。γδ T 細胞中由γ 亞基和δ 亞基連結(jié)成γδ 鏈，與αβ T 細胞不同，它們不僅表達不同的T 細胞受體（TCR），在生物學特性和活化模式方面也各不相同。γδ T 細胞譜系的發(fā)現(xiàn)、其TCR 的檢測和描述、以及對其初始特征的確定，都是T 細胞研究領域非常重要的成就。

1.3 T 細胞作用方式T 細胞受抗原刺激進而分化，發(fā)揮作用，抗原的識別主要通過主要組織相容性復合體（Major histocompatibility complex，MHC）進行，其為主要決定免疫排斥反應的基因簇，分為Ⅰ類和Ⅱ類。1974 年，Doherty 和Zinkernagel[10]首次描述了MHC 限制的現(xiàn)象，他們研究發(fā)現(xiàn)，CTL 只識別病毒感染的靶細胞上的MHC-I 分子，認為T 細胞主要通過TCR 特異性識別和結(jié)合蛋白質(zhì)抗原，其在識別抗原遞呈細胞傳遞的抗原信息時，必須通過先識別遞呈細胞上的分子類型。進一步研究證明，Th細胞識別MHC-Ⅱ類分子。但1994 年研究者發(fā)現(xiàn)恒定自然殺傷T 細胞（invariant natural killer T cells，iNKT）[11]，違背了上述規(guī)則，由非MHC 遞呈非肽抗原給T 細胞，進而研究者對T 細胞如何識別產(chǎn)生了興趣。20 世紀80、90 年代的一系列突破性研究，讓人們得以鑒定、克隆并測序了T 細胞上的抗原結(jié)合受體。T 細胞通過表達的獨特粘附分子和趨化因子受體，“歸巢”到不同的淋巴組織或外周組織。

1986 年，Martin[12]等人和Weiss[13]等人分別獨立發(fā)現(xiàn)了激動型抗體刺激CD28（當時稱為Tp44）會導致T 細胞激活信號的顯著放大，但前提是T 細胞通過TCR 復合物受到了抗原的預先刺激。即T細胞識別抗原之后，仍需要第二個信號才能完全發(fā)揮其效應功能。T 細胞的完全活化依賴TCR 提供的抗原刺激信號和共刺激受體提供的共刺激信號。CD28 是T 細胞的一種表面分子，也是第一個被發(fā)現(xiàn)的T 細胞共刺激受體。T 細胞被抗原激活后會分化為相應的效應T 細胞及記憶T 細胞。效應T 細胞主要合成、表達并分泌各種淋巴因子而發(fā)揮效應，同時少部分被保留成為較長久存在的記憶細胞。

1.4 T 細胞耗竭1998 年，由Rafi Ahmed[14]和Rolf Zinkernagel[15]領導的兩個研究小組研究了T 細胞對小鼠慢性淋巴細胞性脈絡腦膜炎病毒感染的反應。他們使用四聚體染色檢測了病毒特異性CD8+T 細胞，并在慢性感染期間檢測到一群功能無反應的細胞，稱這一現(xiàn)象為T 細胞耗竭。隨后的研究證實，耗竭T 細胞在人的慢性感染中普遍存在，也證實了耗竭T 細胞存在于癌癥中。此后，進一步的研究描述了T 細胞耗竭的免疫生物學特征，有望幫助我們通過逆轉(zhuǎn) T 細胞耗竭來恢復T 細胞的功能。

2 CAR-T 技術的產(chǎn)生及發(fā)展

2.1 嵌合抗原受體（Chimeric antigen receptor，CAR）CAR-T 技術的實現(xiàn)歸因于轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展。CAR 是一種基因編輯后的人工跨膜受體，將多個不同受體的特定結(jié)構(gòu)域合而為一從而可以識別特定的抗原。T 細胞殺傷靶細胞主要依賴于TCR 識別靶細胞上MHC-I 遞呈的特異性多肽。然而，實體腫瘤中MHC-I 大多是下調(diào)的，這就導致T 細胞無法特異性識別腫瘤細胞。由此，識別靶細胞的CAR成為CAR-T 技術的的關鍵之處。根據(jù)CAR 結(jié)構(gòu)域的功能差異，可將CAR 分成三個功能區(qū)域，即：抗原識別區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導區(qū)[16]。

臨床試驗中，研究者從患者外周血中采集、分離出T 細胞，然后在實驗室對它們進行基因修飾，將編碼CAR 的基因?qū)隱17]，從而這些T 細胞可以表達此種受體。對這些經(jīng)過基因修飾的T 細胞增殖后，將其回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，這些T 細胞通過其表達的CAR 受體與靶細胞結(jié)合，從而觸發(fā)一種內(nèi)部信號產(chǎn)生，接著這種內(nèi)部信號強效地激活這些T 細胞，以致使它們快速地摧毀靶細胞。

2.2 CAR-T 臨床應用2008 年Fred Hutchison 腫瘤研究所首次將CAR-T 技術用于治療B 細胞淋巴瘤，雖然療效不明顯，但是證實了CAR-T 技術的安全性。2010 年CAR-T 首次成功使一例B 細胞淋巴瘤患者病情得到控制，證實了其有效性。2011 年，美國Carl June 教授團隊[18]將CAR-T 用于治療B 細胞來源的慢性淋巴細胞白血病，達到CR，此為一大突破。

隨后大量基于CAR-T 細胞的臨床試驗逐步展開。至今CAR-T 經(jīng)歷至少三代的技術迭代，主要差別在于胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的從無到有、從少到多地增加了T 細胞共刺激結(jié)構(gòu)域，增強了T 細胞的殺傷功能和增殖活性，彌補了非MHC-I 依賴性激活時缺少共刺激信號的問題。目前臨床批準的CAR-T 產(chǎn)品以第二代為主，部分三代CAR-T[19]產(chǎn)品已進入臨床試驗。

自2017 年兩款CAR-T 產(chǎn)品獲得FDA 批準用于B 細胞淋巴瘤治療后，相繼已有總計7 款CAR-T產(chǎn)品獲批上市，包括美國的5 款和中國的2 款引進產(chǎn)品。除一例靶向B 細胞成熟抗原（BCMA）外，其余幾乎均以CD19 為靶點。見表1。

2021 年國內(nèi)首款CAR-T 產(chǎn)品，奕凱達（阿基侖賽注射液，代號：FKC876）獲批用于治療復發(fā)或難治性大B 細胞淋巴瘤成人患者，但是CAR-T 療法存在局限性，主要用于血液系統(tǒng)腫瘤，對實體瘤的療效有限。近年來，研究者也在探索CAR-T 免疫療法用于治療實體瘤[20]、自身免疫疾病、HIV 感染[21]和心臟病等疾病，展示了廣闊的應用空間。

2.3 技術問題及迭代CAR-T 在技術上還存在一些問題，其一是CAR-T 細胞只能殺死含有它們經(jīng)基因改造后可識別標志物的腫瘤細胞，然而癌細胞停止制造這種標志物產(chǎn)生腫瘤免疫逃逸（Tumor immune escape）的情況并不少見。第二個問題是存在T 細胞耗竭[22]，甚至最終被腫瘤細胞抑制。最后，現(xiàn)有的CAR-T 細胞只對它們能輕易到達的血液腫瘤有良好的效果，對于肺部或乳腺中的實體瘤，它們大多無能為力。為了克服這些障礙，斯隆-凱特琳研究所的研究者[23]設計出一種全新的作為一種“微型制藥廠”作用的CAR-T 細胞，它可以直接向腫瘤提供有毒的藥物載荷，殺死含或不含此種標志物的腫瘤細胞。更重要的是，CAR-T 細胞即使處于耗竭狀態(tài)時也能產(chǎn)生藥物，而且所產(chǎn)生的藥物不受癌癥抑制。

理論上這些經(jīng)過基因改造的T 細胞會在體內(nèi)永久存在，并可以在腫瘤復發(fā)時重新發(fā)揮作用。但在實踐中，許多患者仍然出現(xiàn)腫瘤復發(fā)。這是因為腫瘤細胞可以產(chǎn)生更多的雌激素受體結(jié)合位點關聯(lián)抗原9（EBAG9）蛋白，在T 細胞中，EBAG9 蛋白抑制了細胞毒性酶的釋放，從而抑制了免疫反應。德國馬克斯-德布呂克分子醫(yī)學中心（MDC）的Armin Rehm 博士和Uta H?pken 博士及其團隊[24]在一項發(fā)表在JCI Insight 雜志期刊上的研究中發(fā)現(xiàn)關閉小鼠體內(nèi)的EBAG9 基因?qū)е聦δ[瘤的免疫反應持續(xù)增加，這些小鼠還產(chǎn)生了更多的記憶T 細胞。記憶T細胞是免疫記憶的一部分，使人體免疫系統(tǒng)在再次遇到相同的腫瘤抗原后能夠做出更好的免疫反應。

在CAR-T 細胞生產(chǎn)中使用病毒也是一個需要應對的問題，因為這種插入、突變，導致產(chǎn)生腫瘤的風險增加。此外，對病毒DNA 的特異性反應往往會阻礙CAR 的表達，而且病毒制備本身經(jīng)常會產(chǎn)生高額費用。盡管一些不使用病毒的嘗試，如使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和mRNA 轉(zhuǎn)導，正在用來產(chǎn)生CAR-T細胞，但隨機整合和CAR 表達中斷導致的CAR-T細胞同質(zhì)性較低也是一個棘手問題。近期，一些研究表明，通過使用腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）載體作為模板，可以應用基因組編輯技術來產(chǎn)生基因座特異性整合的CAR-T 細胞。我國科學家于2002 年開發(fā)出非病毒的基因特異性靶向CAR-T 細胞[25]，并在臨床試驗中證實它們可安全有效地治療復發(fā)/難治性非霍奇金淋巴瘤，是一項重大進展。

3 CAR-T 應用局限

3.1 患者接受度受限由于CAR-T 的以下幾點特性，其在患者中的接受度仍然受限。其一，CAR-T價格過于昂貴，CAR-T 療法的售價普遍超過30萬美元，靶向CD19 的CAR-T 療法Kymriah 和Yescarta 售價分別為47.5 萬美元和37.3 萬美元。昂貴的價格一定程度上限制了CAR-T 療法的普及。由于當前的CAR-T 療法主要是自體CAR-T療法，發(fā)展通用型CAR-T 療法，降低售價使盡可能多的人受益，才是這一抗腫瘤技術的最終發(fā)展目標。其二，CAR-T 適應證較為有限，目前CAR-T療法的適應癥局限于血液腫瘤，無論是CD19，抑或BCMA，均為血液腫瘤的靶點。其三，CAR-T 治療風險較高，由于T 細胞在短期內(nèi)大量被活化，細胞因子的釋放在短期內(nèi)呈爆發(fā)式增長，迅速引發(fā)免疫反應的同時帶來嚴重的細胞因子釋放綜合征（Cytokine release syndrome，CRS）。此外，3 級及以上的神經(jīng)毒性（NT）是另一個重要的風險，臨床表現(xiàn)包括幻視、譫妄等。其四，制備周期較長，目前獲批上市的5 款CAR-T 療法均為自體CAR-T 療法，對于自體CAR-T 療法而言，平均制備周期須2～6 周。

3.2 實體瘤應用受阻雖然CAR-T 在白血病和淋巴瘤等血液系統(tǒng)腫瘤中取得了令人矚目的效果，但其仍有許多技術難題仍待解決，包括CRS、NT、脫靶效應等。而且，CAR-T 在實體腫瘤中效果仍不甚理想。實體瘤中較少表達腫瘤特異性抗原（Tumor specific antigen，TSA），高表達的抗原多屬于腫瘤相關抗原（Tumor-associated antigen，TAA），其在正常組織中也有表達，這就帶來了很高的脫靶風險，使安全性成為關鍵問題。

現(xiàn)實情況是實體瘤存在高度異質(zhì)性和復雜的微環(huán)境，即便有安全的靶點，能否保證療效也是一個不小的挑戰(zhàn)。

第一，在實體瘤中CAR-T 的轉(zhuǎn)運和浸潤受阻。實體瘤具有干擾T 細胞轉(zhuǎn)運進行免疫逃逸的機制。一方面，與血液腫瘤細胞呈分散狀不同，實體瘤往往形成堅實的團狀物，加上豐富的腫瘤相關成纖維細胞（Cancer-associated fibroblasts，CAFs）和血管，形成了一層天然的物理屏障[26]。另一方面，一些實體瘤會抑制某些趨化因子的分泌。趨化因子與其受體的相互作用會促進T 細胞向腫瘤微環(huán)境的遷移。同時，CAR-T 細胞表面也缺乏與實體瘤分泌的趨化因子相匹配的相關受體，造成CAR-T 對腫瘤部位的歸巢能力差。第二，腫瘤微環(huán)境存在免疫抑制。研究發(fā)現(xiàn)，靶向腫瘤微環(huán)境（Targeting tumor microenvironment，TME）中低pH、低氧、高滲透，同時存在免疫抑制機制[27]，極不利于T 細胞的存活和發(fā)揮免疫效力。TME 中存在免疫抑制細胞，如Treg、骨髓源異質(zhì)性細胞（MDSC）和M2 型巨噬細胞。這些免疫抑制細胞[28]在實體瘤內(nèi)會釋放轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）和白細胞介素-10（IL-10）等細胞因子，降低回輸后CAR-T 的抗腫瘤效果。第三，內(nèi)源性T 細胞存在抑制信號。T 細胞的免疫活性存在內(nèi)源性調(diào)節(jié)機制，當T 細胞過度活躍時，PD-1 和細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原-4（CTLA4）等分子發(fā)揮作用，維持免疫平衡。在CAR-T 細胞被抗原激活后，PD-1 和CTLA4 與相關配體相結(jié)合，抑制T細胞的增殖和相關細胞因子的分泌[29]。因此，內(nèi)源性T 細胞抑制信號也會降低CAR-T 的抗腫瘤活性。

4 CAR-T 技術改良進展

4.1 擴大適應證針對適應證有限的瓶頸，目前多家單位相繼開展了針對實體瘤CAR-T 藥物的研發(fā)。處于臨床階段的實體瘤靶點主要包括磷脂酰肌酵蛋白聚糖-3（GPC3）[30]、Claudin 18.2[31]等，這些靶點普遍具有僅在特定細胞表面表達的特點，如Claudin 18.2 僅在人胃上皮短壽細胞表面表達?？茲帢I(yè)的CT041 為一款針對胃及胃食管部位腫瘤的自體靶向Claudin 18.2 的CAR-T 產(chǎn)品，目前處于Ⅰ期臨床?？紤]到實體瘤腫瘤微環(huán)境更為復雜，研究者在預處理上，推出環(huán)磷酰胺+氟達拉濱+白蛋白紫杉醇的FNC 方案，有望進一步改變腫瘤微環(huán)境，提高藥物在實體瘤組織中的滲透性和持久性。

此外，在CAR-T 細胞上增加表達特定抗腫瘤的細胞因子（如IL-12）[32]，可吸引NK 細胞和巨噬細胞浸潤到實體瘤部位，有望進一步增強CAR-T細胞的有效性。與免疫檢查點抑制劑的聯(lián)用方案是另一個重要的發(fā)展方向，可進一步規(guī)避實體瘤的免疫逃逸。

4.2 控制治療毒性CAR-T 細胞治療顯示的毒性和副作用表明，需要制定一些控制程序來調(diào)節(jié)CARs的活性。大量的方法已經(jīng)被用來控制CAR-T 細胞的安全性，其中包括通過安裝自殺開關快速清除注入的細胞，這種開關可以由小分子或抗體控制。常用的自殺開關[33]包括誘導型caspase-9（iCasp9）、單純皰疹病毒中的胸苷激酶（HSV-TK）和自殺表位。然而，這樣的自殺開關清除了所有的治療CAR-T 細胞，從而降低了抗腫瘤反應。因此，不清除CAR-T細胞的非細胞毒性可逆系統(tǒng)正在開發(fā)中，并具有保持細胞毒性和控制毒性反應之間平衡的潛力。

對此，研究者做出了以下努力：第一，探索使用全人源的CAR 片段[34]代替?zhèn)鹘y(tǒng)人鼠嵌合片段，提升藥物安全性，如科濟藥業(yè)的CT053 憑借全人源CAR 結(jié)構(gòu)，三級及以上CRS 和NT 風險較小；第二，探索在胞內(nèi)共刺激結(jié)構(gòu)域的選擇上，盡量使用4-1BB 而非CD28[35]，畢竟早期Juno 的JCAR015 的失敗部分源于CD28 共刺激域的使用，T 細胞短期內(nèi)大量的擴增提升了藥物的風險；第三，探索采用創(chuàng)新型的技術如在CAR-T 細胞中引入自毀機制[36]，當CAR-T 細胞接觸特定配體后發(fā)生細胞凋亡，或在CAR-T 細胞表面表達腫瘤抗原及給患者接種單克隆抗體消滅過量的CAR-T 細胞。

4.3 縮短制備周期針對制備周期較長的問題，異體（通用型）CAR-T 細胞是其中的一個解決方案[37]。但對于異體CAR-T 細胞而言，移植物抗宿主病（Graft versus host disease，GVHD）是不得不面對的風險。針對GVHD，可通過CD52 單抗聯(lián)合化療清除人體淋巴細胞，或通過CRISPR 技術敲除內(nèi)源性TCR 和MHC[38]，降低GVHD 的風險。此外，許多單位也在探索縮短CAR-T 細胞產(chǎn)品制備周期的方法，如亙喜生物的FasTCAR 平臺可將三條主要的制備路徑（激活、轉(zhuǎn)導、擴增）合并為一條可同時發(fā)生的激活-轉(zhuǎn)導路徑，將2～6 周的制備周期縮短至隔天生產(chǎn)。

4.4 開發(fā)新靶點實體瘤中常見的TAA 靶點包括CEA、HER2、GPC3、EpCAM 等，TSA 靶點較少，嚴重限制了CAR-T 在實體瘤中的應用。除了繼續(xù)尋找和開發(fā)針對TSA 靶點的CAR-T 療法，還可以對CAR-T 細胞進行改造，提高對腫瘤抗原的識別能力。2021 年，WendellLim[39]教授團隊在CAR-T 細胞中植入了synNotch 系統(tǒng)，在synNotch 的調(diào)控下，識別相關TAA 的CAR 只會在遷移到腫瘤中的T細胞上表達，而不會攻擊正常組織中的細胞，大大提高了CAR-T 識別抗原的特異性。Carl H.June 團隊和Andy J.Minn 團隊植入RNARN7SL1 和外來抗原到腫瘤細胞中，構(gòu)建多裝甲CAR-T，從而提高對腫瘤細胞特異性[40]。此外，除了對CAR-T 細胞本身進行改造，科學家還利用外界條件提高CAR-T對腫瘤細胞的特異性識別。Nature Biomedical Engineering[41]上發(fā)表的一篇研究進展顯示將超聲波與CAR-T 細胞療法相結(jié)合，可以在保護正常組織的同時摧毀腫瘤組織，大大提高了CAR-T 療法的安全性。

目前針對兩個靶點的雙特異性CAR-T 已在血液腫瘤領域得到應用，可以提高CAR-T 對抗原的識別能力，增加療效和安全性，降低腫瘤逃逸的風險。靶向兩種或者多種不同TAA 的CAR-T 療法也是治療實體瘤的重要方向。比如設計針對多個TAAs 的雙特異性CAR-T[42]是可以采用的，利用特異性和廣泛靶向性，提高CAR-T 細胞的適應度，包括活化潛能、增殖能力和生存能力，延長CAR-T 細胞在患者體內(nèi)的生存時間。最近，Nature Cancer 上發(fā)表了一篇針對神經(jīng)母細胞瘤（Neuroblastoma，NB）模型的雙靶點CAR-T 研究進展[43]，該研究靶向GD2 和B7-H3 兩種NB 相關抗原，并提供CD28 和4-1BB 共刺激，在小鼠中實現(xiàn)了快速和持續(xù)的抗腫瘤作用，并能防止因抗原密度較低而產(chǎn)生的腫瘤免疫逃逸。

4.5 促進T 細胞浸潤治療血液腫瘤時CAR-T 通常采用靜脈回輸，在實體瘤中，為改善CAR-T 的浸潤和轉(zhuǎn)運難題，可采用瘤內(nèi)給藥的方式。瘤內(nèi)給藥方式在胸膜惡性間皮瘤、頭頸癌和惡性膠質(zhì)瘤的研究中都得到了較好的效果。

近年來針對趨化因子的研究給增強CAR-T 對實體瘤的浸潤帶來了新希望，趨化因子對于T 細胞浸潤發(fā)揮著重要作用。2021 年，廣州百暨基因研發(fā)團隊[44]首次研發(fā)出經(jīng)過CXCR5 修飾的CAR-T細胞，其體內(nèi)示蹤實驗結(jié)果顯示可以更好地定向遷移和滲透至腫瘤病灶處，極大減輕了潛在的腫瘤外毒性。此外，也有一些研究靶向腫瘤基質(zhì)細胞中表達的成纖維細胞活化蛋白（Fibroblast activation protein，F(xiàn)AP），可阻斷基質(zhì)的形成。

TME 中的免疫抑制作用是影響CAR-T 在實體瘤中發(fā)揮效力的關鍵因素之一。TME 產(chǎn)生免疫抑制作用的主要原因是免疫抑制細胞因子、免疫抑制細胞的存在和免疫激活因子的缺乏。研究者通過修飾CAR-T 細胞，使其過度表達促進炎癥的細胞因子（如IL-12、IL-15 和IL-18），此為被稱為“裝甲”CAR-T 細胞（armoured CAR-T cells）的第四代CAR-T 細胞，具有調(diào)節(jié)局部微環(huán)境的作用。研究證實，在卵巢癌中，IL-12[45]可以提高T 細胞的增殖和存活能力，抵抗凋亡和PD-1 誘導的功能抑制。此外，對分泌IL-18 的CAR T 細胞的相關研究表明[46]，這些細胞增殖和浸潤能力提高，并能募集內(nèi)源性免疫細胞以調(diào)節(jié)TME。除了TME 中的免疫抑制作用，T 細胞還存在內(nèi)源性免疫抑制機制，目前主要使用基因沉默、PD-1 開關受體以及與PD-1 抑制劑聯(lián)用等手段來避免內(nèi)源性抑制信號[47]。

4.6 聯(lián)合傳統(tǒng)治療CAR-T 治療血液腫瘤，已獲較高緩解率，但是患者往往會出現(xiàn)疾病復發(fā)的現(xiàn)象。CAR-T 對抗腫瘤的療效受到T 細胞在體內(nèi)的激活和擴增、殺傷效果和持久性等多種因素的影響，也與腫瘤類型和患者個體差異息息相關。面對高度復雜的實體瘤，想要通過單一的CAR-T 療法來平衡這些因素顯得舉步維艱。除了強化CAR-T 本身對腫瘤細胞的殺傷作用，還應努力探索應對CAR-T擴增和持久性等難題的策略[48]。CAR-T 聯(lián)合傳統(tǒng)的放化療、免疫檢查點抑制劑、疫苗和溶瘤病毒等手段顯示出廣闊的應用前景，有望通過直接增強T細胞功能、招募內(nèi)源性免疫細胞和重塑TME 等途徑實現(xiàn)治療實體瘤的效果。

5 CAR 的發(fā)展和展望

NK 細胞及巨噬細胞也是重要的免疫細胞類型。隨著對其進一步研究發(fā)現(xiàn)，與T 細胞類似，他們也可以轉(zhuǎn)導表達CARs。CAR-NK 細胞往往直接采用CAR-T 細胞的設計，由于NK 的細胞毒性是由“缺失自我”的識別引發(fā)的，因此NK 細胞尤其具有殺死MHC 下調(diào)的腫瘤細胞的能力。有臨床前研究提示，以PSCA 為靶點的CAR-NK 細胞針對前列腺腫瘤細胞的裂解率顯著提高[49]。

許多實體腫瘤中富含M2 樣抑炎性的巨噬細胞，表明巨噬細胞對實體腫瘤具有天然的募集特性。研究者用CAR 修飾巨噬細胞，制成CAR-M，使巨噬細胞獲得M1 樣促炎性表型，而后不僅能吞噬殺傷腫瘤細胞，還能逆轉(zhuǎn)實體腫瘤的免疫抑制微環(huán)境[50]。有研究者利用Ad5f35 型腺病毒載體感染人外周血來源的單核巨噬細胞，構(gòu)建靶向Her2 的CAR-M，然后靜脈轉(zhuǎn)輸?shù)饺橄侔┖吐殉舶┑男∈竽Ｐ椭?。結(jié)果顯示，CAR-M 不僅可以直接吞噬、殺傷腫瘤細胞，還能逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境，并且還可以遞呈腫瘤抗原給T 細胞，增強T 細胞的抗腫瘤能力。

此外，最新研究表明利用CTLA-4 細胞質(zhì)尾部的內(nèi)吞特性重新編碼CAR，構(gòu)成單體、雙鏈或三鏈CTLA-4 胞質(zhì)尾部（CCTs），可以增強其抗腫瘤功效[51]。

CAR 的發(fā)展需要控制成本、合理定價，價格問題是患者最為關注的。多家單位正探索門診用藥的可能性，目前，傳奇生物的JNJ-4528 的CARTITUDE 試驗[52]納入了1 名門診用藥的患者，探索門診用藥的可能性，以期降低治療費用。

許多研究者正在開展對通用型CAR-T 的探索。由于當前的CAR-T 療法主要采用患者自己的T 細胞，相當于定制藥范疇，因此價格高昂，通用型CAR-T 的探索對于其普及非常重要。

另外監(jiān)管方面要完善監(jiān)管機制，目前對CAR-T細胞治療汲取國外經(jīng)驗作為藥品進行監(jiān)管，需完善并進行臨床試驗審批的流程，推動CAR 的規(guī)范化、流程化。相信在不遠的將來，CAR 在腫瘤的治療中將起到越來越重要的作用，必將為人類對抗腫瘤做出重要的貢獻。