雷 偉，李智偉，郭玉娟，擺文麗，芮東升，王 奎

（1.石河子大學醫(yī)學院，新疆 石河子 832000；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢測中心，新疆 烏魯木齊 830001）

流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種能夠?qū)腋〉募毎蛭⒘＿M行快速而精確地分析和分選的檢測技術(shù)，被廣泛應用于生物學研究及臨床診斷中[1-3]。FCM 應用過程中會產(chǎn)生高維數(shù)據(jù)，傳統(tǒng)數(shù)據(jù)分析是基于設門的方法，通常分析者會在FlowJo 等可視化軟件中根據(jù)經(jīng)驗選擇測量通道繪制能夠代表細胞抗原表達水平的散點圖，在散點圖中圈出門以區(qū)分出不同的細胞亞群，以此得到疾病的相關(guān)信息。目前FCM 向多參數(shù)方向發(fā)展，給數(shù)據(jù)分析帶來巨大挑戰(zhàn)，基于人工設門的細胞分群方法的局限性日益顯著。首先，人工分群缺乏客觀性，由于沒有可量化的標準，不同分析者得到的結(jié)果可能存在差異；其次，人工分群過程繁瑣，重復性工作耗費大量時間導致效率低下；此外，人工分群要求分析者有一定的專業(yè)知識，能夠根據(jù)經(jīng)驗準確設門和識別亞群，這可能是一般使用者不具備的[4-7]。因此，提出自動分群方法，并已成為近年來國內(nèi)外研究熱點[8-11]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡（artificial neural network，ANN）是一種受到人腦神經(jīng)元的啟發(fā)而產(chǎn)生的多參數(shù)非線性計算模型，其具備了機器學習的能力，常被用于解決數(shù)據(jù)分析問題[12，13]。本研究旨在通過構(gòu)建ANN 模型實現(xiàn)在FCM 數(shù)據(jù)上的細胞自動分群，并且同其他方法進行比較，探究該方法應用的可行性。

1 資料與方法

1.1 資料來源 數(shù)據(jù)來源于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢測中心2016-2017 年流式檢測存檔數(shù)據(jù)，包括10 名健康志愿者的骨髓標本FCM 數(shù)據(jù)。納入標準：①人員無發(fā)熱、咳嗽或其他不適；②血常規(guī)和生化檢測結(jié)果正常；③近期未使用過影響免疫功能的藥物；④體檢未發(fā)現(xiàn)免疫性疾??；⑤肝腎功能檢查正常。排除標準：①患有急性病毒感染性疾病、先天性免疫缺乏癥、獲得性免疫缺陷綜合征、霍奇金病、白血病、惡性腫瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥等疾??；②處于外科手術(shù)恢復和腫瘤化療期間從事輻射接觸工作、使用淄醇類藥物及免疫抑制劑的人員；③實驗室血清學檢測確診乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒者；④近期有飲酒情況（如酗酒）的對象；⑤近期獻血的對象。本項目已通過當?shù)貍惱砦瘑T會批準，所有參與者均簽署知情同意書。檢測儀器為BD 公司的FACS Canto Ⅱ雙激光八色流式細胞儀，標本中加入CD45 標記分子與骨髓細胞結(jié)合，細胞在激光光源的照射下發(fā)射出代表細胞體積大小及粒度的散射光信號及代表細胞生化性質(zhì)的特異性熒光信號。提取前向散射光高度（FSC-H）、前向散射光面積（FSC-A）、側(cè)向散射光面積（SSC-A）及CD45 熒光強度。單個細胞被激發(fā)后產(chǎn)生的散射光和熒光信號以單個事件的形式被記錄下來，所有的事件匯聚成被測細胞群完整的FCM 數(shù)據(jù)，以FCS 格式存儲。

1.2 人工設門分析方法 在FlowJo 分析軟件中打開FCS 文件，以FSC 和SSC 為坐標繪制散點圖，其中FSC 反映細胞粒徑，SSC 反映細胞復雜度，結(jié)合兩者可以排除凋亡細胞和細胞碎片，得到有核細胞群體。在有核細胞群體中單細胞的FSC-H 和FSC-A 呈線性相關(guān)，故可在散點圖中用直線劃定范圍區(qū)分單細胞和黏連細胞。在單細胞群中繪制以CD45 和SSC為坐標的散點圖，根據(jù)細胞聚類特征并結(jié)合經(jīng)驗圈出不同亞群的邊界，通常包括淋巴細胞、單核細胞、有核紅細胞、粒細胞和幼稚細胞等。在臨床檢驗中，對CD45 和SSC 的設門是許多血液疾病診斷的初始策略，為區(qū)分主要的造血細胞群體提供一個有用的起點，可以結(jié)合其他標記物進行下一步診斷[14]。

1.3 ANN 分群模型

1.3.1 數(shù)據(jù)集準備 采用R 4.0 中Bioconducter-flowcore 軟件包讀取數(shù)據(jù)[15]，對SSC 和CD45 分別使用對數(shù)轉(zhuǎn)化和雙指數(shù)轉(zhuǎn)化進行去偏態(tài)化。采用Python 3.7 中sklearn 軟件包的MinMaxScaler 函數(shù)對納入的變量進行歸一化，使變量范圍在[0，1]之間。以人工分群結(jié)果作為金標準，賦予數(shù)據(jù)標簽（0：淋巴細胞；1：單核細胞；2：幼稚細胞；3：嗜酸性粒細胞；4：中性粒細胞；5：有核紅細胞）。

1.3.2 模型架構(gòu)及運算 采用Python 3.7 中keras 軟件包搭建ANN 模型，由輸入層、2 個隱含層、輸出層和分類器組成。輸入層有2 個節(jié)點，分別用于輸入CD45 和SSC，每個隱含層包括10 個神經(jīng)元，各層之間采用tanh 激活函數(shù)；輸出層有6 個節(jié)點，對應6個細胞亞群，在輸出層后加入softmax 函數(shù)作為分類器，用來計算多分類概率。設置初始學習率為0.01，迭代次數(shù)為20，優(yōu)化器為隨機梯度下降法（SGD）。訓練時，訓練樣本在各層的神經(jīng)元間傳遞，向前傳播得到輸出值，網(wǎng)絡通過計算損失函數(shù)得到實際輸出與期望輸出間的殘差，再將殘差反向傳播回網(wǎng)絡中，逐層更新網(wǎng)絡中各層神經(jīng)元的權(quán)重和偏置，在迭代過程中損失函數(shù)逐漸下降，網(wǎng)絡參數(shù)趨于穩(wěn)定，訓練結(jié)束后將模型以h5 文件存儲。

1.3.3 模型驗證 采用交叉驗證的方式，每個樣本依次作為測試集，未被選中的樣本合并后作為訓練集。分別在各訓練集進行模型訓練，計算模型在各測試集上的準確率，計算平均準確率和置信區(qū)間，并繪制混淆矩陣，并計算各亞群的F1 值，計算方法為：

式中，P 代表精度，R 代表召回率，F(xiàn)1 值是綜合評價模型識別能力的指標，值越接近1 代表模型識別效果越好。

1.4 其他分群方法 決策樹和K-means 分別作為有監(jiān)督和無監(jiān)督機器學習的代表算法之一，被用于亞群分群中[7，8]。

1.4.1 決策樹分類算法 決策樹算法是一種逼近離散函數(shù)值的方法，可以在已知各種情況發(fā)生概率的基礎上對未知情況做出評價。每個決策樹都表述了一種樹型結(jié)構(gòu)，由它的分支來對該類型的對象依靠屬性進行分類。每個決策樹可以依靠對源數(shù)據(jù)庫的分割進行數(shù)據(jù)測試，這個過程可以遞歸式的對樹進行修剪，當不能再進行分割或一個單獨的類可以被應用于某一分支時，則完成了遞歸過程，訓練好的決策樹可以直接用于對新樣本的分類。

1.4.2 K-means 聚類算法 K-means 算法是一種基于迭代求解原理的聚類算法，其通過距離作為聚類參照的指標，首先隨機選取數(shù)據(jù)中的若干對象作為聚類中心，然后計算其他每個對象和這些聚類中心的距離，并把每個對象分配給最近的聚類中心，每分配一個對象時，聚類中心則被重新計算，直到最后一個對象被分。為盡可能將亞群區(qū)分，研究中設置簇個數(shù)為10，略大于目標亞群數(shù)，聚類后人工合并和識別亞群，給予相應標簽。

2 結(jié)果

2.1 ANN 模型訓練過程 訓練時，損失函數(shù)在迭代過程中逐漸下降，表明模型能夠從訓練集中學習到有用的特征。同時，準確率隨之提高并趨于穩(wěn)定，逐漸接近于1，說明模型在訓練集上擬合良好，見圖1。

圖1 ANN 模型訓練中準確率和損失函數(shù)變化圖

2.2 ANN 模型分群結(jié)果 以SSC-A 和CD45 為坐標繪制散點圖，可知ANN 模型能夠區(qū)分細胞亞群，在亞群輪廓上與人工設門結(jié)果基本一致，見圖2；混淆矩陣顯示，ANN 模型對于各類細胞亞群均有較高的識別精度，見圖3。

圖2 人工分群方法和ANN 分群結(jié)果比較

圖3 混淆矩陣

2.3 三種自動分群方法比較 以人工設門結(jié)果作為金標準，對ANN 模型、K-means 模型和決策樹模型自動分群方法進行相同的交叉驗證，計算各亞群的F1 值和總體分群準確率，結(jié)果顯示ANN 和決策樹準確率及在各亞群上F1 值均優(yōu)于K-means 模型，見表1。

表1 三種自動分群方法分群結(jié)果

3 討論

隨著FCM 的廣泛應用，目前最先進的流式細胞儀可以檢測超過30 個參數(shù)[16]。檢測能力提升的同時也給基于人工設門的FCM 數(shù)據(jù)分析帶來挑戰(zhàn)，不斷有自動分析方法被提出。Cheung M 等[17]對現(xiàn)有自動分析方法進行調(diào)查后指出，雖然一些方法已經(jīng)被證明在FCM 數(shù)據(jù)分析中有不錯的效果，并已發(fā)布相關(guān)軟件包，但軟件的跨平臺使用問題依然難以解決。目前多數(shù)方法采用無監(jiān)督的機器學習實現(xiàn)亞群聚類，這種方法得到的分群結(jié)果需要分析者進行人工識別，難以實現(xiàn)完全自動化。因此，進一步探究新方法在FCM 數(shù)據(jù)分析中的應用是十分必要的。

ANN 是一種受到人腦神經(jīng)元處理信息方式的啟發(fā)而產(chǎn)生的多參數(shù)非線性計算模型，其具備了機器學習和模式識別的能力，針對復雜的非線性關(guān)系問題，只需要預先給予正確的訓練數(shù)據(jù)，神經(jīng)網(wǎng)絡就可以快速找到其中隱含的規(guī)律，從而得到最優(yōu)模型。目前，ANN 被廣泛的應用于醫(yī)學領域，在輔助診斷、預測疾病預后等方面表現(xiàn)良好，為解決許多臨床問題提供了新思路[18-20]。本研究提出了一種基于ANN的細胞亞群分群方法，作為一種有監(jiān)督的機器學習，模型能夠自動區(qū)分并識別細胞類型，避免了分析者的主觀性，具有客觀高效的特點。且經(jīng)過測試，ANN模型可以很好的復現(xiàn)人工設門的結(jié)果，對于設門中處于亞群交界處未被納入的細胞，ANN 模型也能將其合理分配，在聚類輪廓上與設門結(jié)果基本一致，可以作為人工設門的補充和替代。此外，本研究以人工設門結(jié)果作為金標準，對ANN 模型、K-means 模型和決策樹模型自動分群方法進行相同的交叉驗證，計算各亞群的F1 值和總體分群準確率，結(jié)果顯示三者總體分群準確率分別為0.970、0.972 和0.899，且ANN 和決策樹在各亞群上F1 值均優(yōu)于K-means 模型。同時需要指出，在有監(jiān)督機器學習方法中，當訓練數(shù)據(jù)較少的情況下，ANN 模型表現(xiàn)一般低于或接近其他方法，但隨著數(shù)據(jù)量的增加，ANN模型明顯優(yōu)于其他方法，具有更大潛力[21]。另外，由于本研究中僅通過少量骨髓樣本產(chǎn)生的FCM 數(shù)據(jù)作為訓練集，因此未能充分展現(xiàn)出ANN 模型的大數(shù)據(jù)優(yōu)勢。并且在本研究中僅以健康個體作為對象，如需驗證模型在特定疾病上的表現(xiàn)，還需要收集更多患者的FCM 數(shù)據(jù)，以進一步探究ANN 在FCM 數(shù)據(jù)自動分析中的價值。

綜上所述，基于ANN 模型的FCM 數(shù)據(jù)細胞分群方法實現(xiàn)了對骨髓細胞的自動分群，證明了將ANN 應用于FCM 數(shù)據(jù)分析中的可行性，可以為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。