高 燦，趙曉彤，程 江，2

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832008；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 石河子 832008）

結(jié)核病（TB）是一種由結(jié)核分枝桿菌（M.tb）引起的傳染性疾病[1，2]。目前，結(jié)核病的感染控制主要靠接種減毒牛分枝桿菌卡介苗（BCG）來(lái)實(shí)現(xiàn)，但BCG并不能對(duì)各個(gè)年齡組都起到有效的防護(hù)作用[3]。分枝桿菌的耐藥性仍在不斷出現(xiàn)不斷增加，全球健康遭到了耐藥結(jié)核菌株的嚴(yán)重威脅，將促使開(kāi)發(fā)替代治療方法。Rv0288（esxH）是分枝桿菌蛋白大家族ESAT-6 家族（ESAT6，ESX）的一名成員，編碼分泌蛋白TB10.4 蛋白[4]。研究發(fā)現(xiàn)[5]，該基因的表達(dá)可以改變INH 和RIF 存在下分枝桿菌的生長(zhǎng)，與結(jié)核病耐藥性存在潛在關(guān)聯(lián)。除此之外，TB10.4 蛋白有可能參與鐵/鋅攝取，這一過(guò)程在是結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)代謝中起重要作用[6，7]。另有研究發(fā)現(xiàn)[8]，Rv0288 基因中的編碼蛋白TB10.4 能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，具有一定的免疫原性，使結(jié)核病人的免疫系統(tǒng)被識(shí)別。因此TB10.4 蛋白有可能成為候選抗原和候選疫苗，用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷[9，10]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌TB10.4 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，以探索TB10.4 蛋白的結(jié)核耐藥性機(jī)制，尋找其在結(jié)核病的藥物新靶點(diǎn)及預(yù)防方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 TB10.4 蛋白氨基酸序列來(lái)自NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站。在GenBank 中檢索關(guān)鍵詞Rv0288，以獲取H37Rv 全基因組信息。RV0288 基因位于MTB 全基因組的區(qū)域，基因ID為 886603；它的編碼蛋白為TB10.4 蛋白（別名Cfp7，Low molecular weight protein antigen 7 EsxH,ESAT-6-Like protein EsxH）,屬于分泌蛋白，在蛋白質(zhì)庫(kù)中的登錄號(hào)為CCP43018.1，在UniProt 中的登錄號(hào)為P9WNK3。通過(guò)NCBI 網(wǎng)站查詢，TB10.4 蛋白由96 個(gè)氨基酸序列組成，檢索的氨基酸序列如下：MSQIMYNYPAMLGHAGDMAGYAGTLQSLGAEIAV EQAALQSAWQGDTGITYQAWQAQWNQAMEDLVR AYHAMSSTHEANTMAMMARDTAEAAKWGG。

1.2 方法 使用NCBI 網(wǎng)址中的OFR Finder 軟件分析基因Rv0288 的開(kāi)放閱讀框架；應(yīng)用在線軟件ProtParam、ProtScale 對(duì)TB10.4 蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)及親疏水性分析。運(yùn)用在線軟件SOSUI 及Signal IP 預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白的信號(hào)肽和跨膜區(qū)，在線軟件TMHMM、NerNGlyc、NetPhos 對(duì)TB10.4 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、糖基化及磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。運(yùn)用PSORT、WoLF PSORT、CELLO 三個(gè)軟件分析TB10.4蛋白的亞細(xì)胞定位，在線軟件SOPMA 預(yù)測(cè)TB10.4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行同源建模。運(yùn)用IEDB 軟件對(duì)TB10.4 抗原蛋白的B 細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)蛋白的可塑性、線性表位、表面可及性、親疏水性、β-轉(zhuǎn)角、抗原性6 個(gè)方面并篩選的B 細(xì)胞表位；運(yùn)用SYFPEITHI、RANKPEP 預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白的輔助性T 細(xì)胞（Th）表位，SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC預(yù)測(cè)蛋白的CTL 細(xì)胞表位并進(jìn)行綜合分析；并使用STRING 預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白的相互作用蛋白預(yù)測(cè)及富集分析。所用軟件具體網(wǎng)址見(jiàn)表1。

表1 使用的基因分析軟件及蛋白預(yù)測(cè)網(wǎng)站

2 結(jié)果

2.1 Rv0288 基因開(kāi)放閱讀框架 Rv0288 基因（ID：886603）位于MTB 全基因組的351848-352138 區(qū)域，全長(zhǎng)291 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG，見(jiàn)圖1。

圖1 Rv0288 基因開(kāi)放閱讀框

2.2 理化性質(zhì)及親疏水性 TB10.4 蛋白的理論等電點(diǎn)pI 為4.58，相對(duì)分子質(zhì)量為10 390.6；該蛋白由96 個(gè)氨基酸組成，含有18 種氨基酸，其中不含吡咯賴氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸，而以丙氨酸（20.8%）、甘氨酸（9.4%）、谷氨酰胺（9.4%）、蘇氨酸（6.2%）4 種氨基酸的比例較高。其中有3 個(gè)殘基（Arg+Lys）帶正電荷，9 個(gè)殘基（ASP+GLU）帶負(fù)電荷。TB10.4 蛋白的分子式為C448H677N125O143S9，原子總數(shù)為1402，消光系數(shù)為29 450，280 nm 處的吸光度為2.834。當(dāng)TB10.4蛋白的N 端殘基為Met 時(shí)，它在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中的半壽期為30 h，在大腸埃希菌體內(nèi)的半衰期大于10 h。TB10.4 蛋白為非穩(wěn)定蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)為50.36，脂肪族氨基酸指數(shù)為59.38，平均疏水性為-0.266。使用在線軟件ProtScale 分析TB10.4 蛋白為疏水性蛋白，第56 位氨基酸親水性得分最高為-1.744；第30、31 氨基酸疏水性得分最高為0.878，見(jiàn)圖2。

圖2 TB10.4 蛋白的親（疏）水性分析

2.3 信號(hào)肽、跨膜區(qū) 軟件顯示，TB10.4 蛋白是不含信號(hào)肽、沒(méi)有跨膜區(qū)域的可溶性蛋白；Signal IP 軟件顯示，該蛋白max.C 值為0.121，max.Y 值為0.150，max.S 值為0.263，mean S 值為0.170，其中mean S值＜0.45，預(yù)測(cè)無(wú)信號(hào)肽，見(jiàn)圖3。

圖3 TB10.4 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 糖基化和磷酸化位點(diǎn) TMHMM 軟件顯示TB10.4 蛋白無(wú)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4；NerNGlyc 軟件顯示該蛋白無(wú)糖化位點(diǎn)，見(jiàn)圖5；NetPhos 軟件顯示該蛋白有8 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中磷酸化絲氨酸位點(diǎn)有5 個(gè)，分別位于2、27、41、73、74 位氨基酸；磷酸化蘇氨酸位點(diǎn)有2 個(gè)，分別位于氨基酸的24 位與88 位；磷酸化酪氨酸位點(diǎn)有1 個(gè)，位于氨基酸21位，見(jiàn)圖6。

圖4 TMHMM Server2.0 預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白的跨膜螺旋

圖5 TB10.4 蛋白亞基糖基化位點(diǎn)分析

圖6 TB10.4 蛋白磷酸化位點(diǎn)分析

2.5 亞細(xì)胞定位 結(jié)果顯示，該蛋白的亞細(xì)胞被定位在細(xì)胞核內(nèi)。軟件PSORT 分析cyto-nucl:14，cyto:11，extr:6；軟件WoLF PSORT 分析extr:17，cyto:11，cyto_nucl:8.5，nucl:4；CELLO 分析此種蛋白位于細(xì)胞外。故TB10.4 蛋白可能定位于細(xì)胞外。

2.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu) 運(yùn)用在線軟件SOPMA 預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，α-螺旋（Hh）83 個(gè)，占86.46%；β-轉(zhuǎn)角（Tt）3 個(gè)，占3.12%；β-折疊（Ee）3個(gè)，占3.12%；7 個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲（Cc），占7.29%，TB10.4 蛋白為不穩(wěn)定性蛋白，見(jiàn)圖7。

圖7 TB10.4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.7 三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模 運(yùn)用在線軟件SWISSMODEL 軟件預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行同源建模，見(jiàn)圖8，SWISS-MODEL 軟件中，運(yùn)用GMQE和QMEAN 評(píng)分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。GMQE 評(píng)分分?jǐn)?shù)范圍是0～1 分，數(shù)字越接近1 分的質(zhì)量就越高；QMEAN 評(píng)分表示預(yù)測(cè)模型與期望值的一致程度，是基于對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的不同幾何特性的復(fù)合評(píng)估，評(píng)分范圍為0～4 分，待測(cè)蛋白越接近數(shù)字0 與模板蛋白就有更高匹配度。三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源建模，見(jiàn)圖7。該模型的GMQE 評(píng)分為0.71，QMEAN 評(píng)分為（0.6±0.09）分，與模板2kg7.1.B 氨基酸序列一致性為100%。

圖8 TB10.4 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.8 B 細(xì)胞表位預(yù)測(cè)結(jié)果 運(yùn)用IEDB 軟件對(duì)TB10.4抗原蛋白的B 細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，以1.0 作為柔韌性的參數(shù)基線。最終篩選出3 個(gè)B 細(xì)胞表位，見(jiàn)表2。

2.9 TB10.4 蛋白Th 表位、CTL 表位的預(yù)測(cè)分析結(jié)果

2.9.1 Th 表位 運(yùn)用SYFPEITHI 和RANKPEP 在線軟件，選擇HLA-DR1*0101、HLA-DR1*0401、HLA-DR1*0701 和HLA-DR1*1101 作為HLA 亞型代表，得到5 條共同的強(qiáng)結(jié)合Th 抗原表位肽段，見(jiàn)表3。

表3 TB10.4 蛋白輔助性T 細(xì)胞表位分析結(jié)果

2.9.2 CTL 表位 運(yùn)用RANKPEP 軟件對(duì)TB10.4蛋白進(jìn)行分析，分值較高的CTL 細(xì)胞抗原表位，見(jiàn)表4。CTL 表位分別為QAQWNQAME（55-63）、PAMMLGHAGD（9 -18），運(yùn) 用 SYFPEITHI、RANKPEP、NetMHC 三種生物信息學(xué)軟件對(duì)TB10.4 蛋白進(jìn)行綜合分析，分值較高的CTL 細(xì)胞抗原表位，見(jiàn)表5。綜合分析得出的TB10.4 蛋白的CTL 表位數(shù)量主要集中分簇于HLA-A2 限制性T細(xì)胞表位，少部分位于HLA-A3，無(wú)多肽序列分布在HLA-B7 限制性T 細(xì)胞表位，推測(cè)其最佳候選CTL 表位可能位于IMYNYPAML（4-12）等aa 區(qū)段，見(jiàn)表6。

表4 RANKPEP 軟件預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白CTL 表位

表5 不同軟件預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白CTL 表位

表6 TB10.4 蛋白CTL 表位綜合分析

2.10 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 采用STRING 預(yù)測(cè)與TB10.4 相互作用的蛋白質(zhì)，顯示其與等蛋白形成相互作用網(wǎng)絡(luò)，有esxS、esxB、esxH、esxG、PPE4、PPE18、PE5、eccD3、eccC3、espG3，見(jiàn)圖9。

圖9 MTB H37Rv 相互作用蛋白

3 討論

結(jié)核病作為一種肺部疾病，具有播散性傳播的潛力[11]。一直以來(lái)，對(duì)結(jié)核病的治療由于藥品副作用發(fā)生以及患者的依從性差，治療效果往往不佳[12]，多重和廣泛耐藥（MDR 和XDR）結(jié)核分枝桿菌（MTB）對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[2，13]。因此，探索新的分枝桿菌藥物靶點(diǎn)對(duì)于在不久的將來(lái)有效解決抗結(jié)核藥物耐藥性和改善一般結(jié)核病控制至關(guān)重要[2]。接種BCG 疫苗可預(yù)防播散性嚴(yán)重的兒童肺結(jié)核，但在有效性和持久性上卻有著天壤之別[14]。研究表明[15]，BCG 可能在所有試驗(yàn)的早期可提供了高水平的保護(hù)，但在結(jié)核病持續(xù)高傳播的環(huán)境中，BCG可能提供很少（甚至為零）的長(zhǎng)期保護(hù)。因此需要一種新疫苗來(lái)提供針對(duì)兒童和成人結(jié)核病的一致和持久的保護(hù)性免疫力[16]。ESAT6 由結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)編碼，是Mt 重要的毒力因子，也被認(rèn)為是現(xiàn)有的TB 疫苗卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）減毒的重要原因[17]。作為Mtb 分泌的細(xì)胞外蛋白，ESAT6 是保護(hù)性抗原的重要來(lái)源[18]，對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用，研究報(bào)道，ESAT6 能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，且ESAT6 融合蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)的Mtb 生存會(huì)產(chǎn)生顯著影響[19]。Rv0288（EsxH）屬于分枝桿菌蛋白大家族ESAT-6 家族（Esx）[20]，大小約為100 個(gè)殘基，存在一個(gè)保守的中心WXG 基序，是分枝桿菌內(nèi)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)的基因?qū)Γ幋a分泌蛋白TB10.4 蛋白。

為了較為全面地預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)，本研究運(yùn)用了多種生物信息學(xué)軟件對(duì)該蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。該研究通過(guò)生物信息學(xué)手段分析TB10.4 蛋白，結(jié)果顯示該蛋白理論等電點(diǎn)pI 為4.58，且?guī)ж?fù)電荷氨基酸的殘基數(shù)多于帶正電荷氨基殘基數(shù)，所以TB10.4 蛋白整體帶負(fù)電荷，與血漿白蛋白電性相同，提示該蛋白可能是通過(guò)入血從而發(fā)揮它的作用。TB10.4 蛋白脂肪族氨基酸如丙氨酸（20.8%）、甘氨酸（9.4%）、谷氨酰胺（9.4%）、蘇氨酸（6.2%）在氨基酸組成中所占比例較高，提示該蛋白可能和脂質(zhì)的運(yùn)輸相關(guān)。TB10.4 蛋白在細(xì)胞中半壽期長(zhǎng)達(dá)30 h，在細(xì)菌體內(nèi)半衰期大于10 h，提示該蛋白可能作為免疫抗原分子在體內(nèi)發(fā)揮持久作用。生物信息學(xué)分析顯示TB10.4 蛋白為疏水性蛋白，定位預(yù)測(cè)該蛋白可能位于細(xì)胞外，此外，該蛋白為不含信號(hào)肽的非跨膜蛋白，提示該蛋白可能于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中合成從而運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞器中起作用。TB10.4 蛋白有8 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，提示它可能參與細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示TB10.4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占86.46%，α-螺旋占比較高的蛋白大多為高度保守蛋白，表明該蛋白可能具有一定的功能。有研究表明，TB10.4 是結(jié)核分枝桿菌（Mtb）的一個(gè)重要的毒力蛋白抗原[21]，CFP10-TB10.4（CT）融合蛋白與甘露聚糖和洛索里賓的結(jié)合物（CT-man-lox）能顯著增強(qiáng)小鼠的CFP10-TB10.4 融合蛋白特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，CT-man-lox 有可能成為一種有效的抗結(jié)核分枝桿菌蛋白疫苗[22]。預(yù)測(cè)分析顯示該蛋白與esxS、esxB、esxH、esxG、PPE4、PPE 18、PE5、eccD3、eccC3、espG3 等多種蛋白相互作用，提示該蛋白參與多種生物學(xué)過(guò)程。表位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TB10.4 蛋白具有3 條B 細(xì)胞表位肽段，分別為QGDTGI、E、AA，同時(shí)，該蛋白具有多條與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的肽段，但它的具體功能還有待于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)TB10.4 蛋白具有多個(gè)B 細(xì)胞及T 細(xì)胞抗原表位，表明該蛋白可能具有抗原性，提示該蛋白在今后有可能作為抗結(jié)核疫苗的候選疫苗。