宋潔菲 周迎光

南京中醫(yī)藥大學連云港附屬醫(yī)院骨傷科，連云港 222004

靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）是指血液在靜脈系統(tǒng)內(nèi)不正常凝集的疾病，包括肺動脈栓塞（pulmonary embolism，PE）和深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）［1］。VTE主要臨床表現(xiàn)為患肢腫脹、疼痛，出現(xiàn)不明原因的呼吸困難、胸痛，甚至死亡。中醫(yī)將本病歸于“股腫”，主要病機為氣滯血瘀，水濕泛濫?！督饏T要略·水氣病脈證并治》中有：“血不利則為水，名曰血分”?？梢娧嗷マD(zhuǎn)化，相互影響，臨床上采用“活血利水”能起到較好防治效果［2］。

桃紅四物湯出自清代吳謙《醫(yī)宗金鑒·婦科心法要訣》，五苓散出自漢代張仲景《傷寒論·辨太陽病脈證并治》，分別為活血化瘀、利水滲濕的代表方，兩方合用共奏活血化瘀、行氣利水之效。目前，已有文獻表明桃紅四物湯和五苓散均具有抗血小板、抗炎作用，復方具有預防VTE的功效［3-5］，但桃紅四物湯合五苓散發(fā)揮抗靜脈血栓作用的具體機制仍未被完全闡明。

網(wǎng)絡藥理學是結(jié)合生物學、藥理學、計算機學等所形成的一門新興學科［6］，能夠較全面系統(tǒng)地揭示中藥及其復方的作用機理。本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法探討治桃紅四物湯合五苓散抗靜脈血栓生成的潛在作用機制，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1.桃紅四物湯合五苓散相關靶點篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索關鍵詞“熟地”“白芍”“當歸”“川芎”“桃仁”“紅花”“豬苓”“茯苓”“澤瀉”“白術”“桂枝”，根據(jù)口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18［7］，篩選主要有效成分和靶點。將獲得的靶點去重，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）統(tǒng)一命名。

2.VTE相關靶點篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、Gene數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）、藥物靶標數(shù)據(jù)庫（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）中檢索關鍵詞“venous thromboembolism”。結(jié)果去重獲得VTE相關靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一命名。

3.構(gòu)建藥物-成分-疾病靶點網(wǎng)絡圖

利用Venny2.1.0獲取藥物和疾病的共同靶點，并繪制韋恩圖。利用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建藥物-成分-疾病靶點交互網(wǎng)絡圖。

4.構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡

將篩選得到藥物和疾病共同靶點導入STRING 11.5（https：//string-db.org/）在線數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，設置物種來源為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值為“highest confidence”（＞0.9），其余為默認值。導出結(jié)果并使用Cytoscape3.9.1繪制PPI網(wǎng)絡圖。

5.基因本體（GO）富集分析與京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析

使用Metascape平臺（https：//metascape.org）進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，使用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）可視化。

6.成分-靶點分子對接

選取藥物-成分-疾病靶點網(wǎng)絡中Degree值前5的靶點與有效成分進行分子對接。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB，https：//www.rcsb.org/）中下載靶點的3D結(jié)構(gòu)“.pdb”格式文件，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載3D結(jié)構(gòu)的“.mol2”格式文件。將靶點和有效成分3D結(jié)構(gòu)AutoDock Tools1.5.7，經(jīng)過去水、加氫、分配電荷等處理，保存為“.pdbqt”格式文件。使用AutoDock Vina 1.1.2軟件設置對接口袋，使用qvina-w軟件進行盲對接。用結(jié)合能評價化合物與靶點的對接情況。

結(jié)果

1.桃紅四物湯合五苓散有效成分和靶點

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得桃紅四物湯合五苓散有效成分，共計103個。其中熟地2個，白芍13個，當歸2個，川芎7個，桃仁23個，紅花22個，豬苓11個，茯苓15個，澤瀉10個，白術7個，桂枝7個。中藥共有成分9種（表1）。檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，去重校正后獲得人源靶點213個。

表1 桃紅四物湯合五苓散中9種中藥共有成分

2.VTE相關靶點

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索“venous thromboembolism”，取relevance score≥1，獲得1 984個潛在靶點。在Gene數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫中分別檢索“venous thromboembolism”，與GeneCards數(shù)據(jù)庫的結(jié)果去重，構(gòu)成VTE相關靶點數(shù)據(jù)庫，獲得靶點共1 991個。

3.藥物-成分-疾病靶點網(wǎng)絡

利用Venny2.1.0平臺，將有效成分靶點和疾病靶點取交集，繪制韋恩圖（圖1），獲得68個共同靶點。將共同靶點導入Cytoscape3.9.1，構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡（圖2）。使用NetworkAnalyzer工具分析網(wǎng)絡特征，得到按照Degree排名前20的有效成分及靶點（表2）。

圖1 有效成分靶點與疾病靶點韋恩圖

圖2 藥物-成分-疾病靶點網(wǎng)絡

表2 按照Degree排名前20的關鍵靶點和成分

4.PPI網(wǎng)絡圖

將共同靶點導入STRING11.5，構(gòu)建疾病與藥物關鍵靶點的PPI網(wǎng)絡圖，并通過Cytoscape3.9.1進行可視化，其中顏色越深、圖形越大表示相關性越高（圖3）。去除游離節(jié)點后，該網(wǎng)絡涉及67個節(jié)點，743條邊。使用NetworkAnalyzer工具分析，得到按照Degree排名前20的靶點（圖4），主要為腫瘤壞死因子（TNF）、蛋白激酶B（AKT）1、白細胞介素（IL）1B、內(nèi)皮生長因子（VEGF）A、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）等。

圖3 桃紅四物湯合五苓散-VTE靶點PPI網(wǎng)絡圖

圖4 桃紅四物湯合五苓散治療VTE的關鍵靶點（前20）

5.GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO富集分析生物學過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）3個類別，得到按照P值篩選每個類別排名前10的項目（圖5A）。桃紅四物湯合五苓散干預血栓形成主要涉及BP包括細胞遷移的正調(diào)控、炎性反應、對脂多糖的反應、血液循環(huán)、對氧含量下降的反應；CC包括膜筏、細胞外間質(zhì)、血小板α顆粒腔；參與分子功能包括信號受體調(diào)節(jié)器活性、氧還原酶活性、絲氨酸水解酶活性等。KEGG富集分析在160個交集靶點中富集到相關信號通路有98條，通過P值篩選得到排名前19的通路（圖5B），主要涉及流體剪切應力與動脈粥樣硬化、癌癥通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等信號通路。

圖5 基因本體（GO）富集分析（A）與京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析（B）

6.分子對接驗證

選擇桃紅四物湯合五苓散干預靜脈血栓的中藥復方網(wǎng)絡中Degree值排名前5的有效成分：槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇，與PPI網(wǎng)絡中Degree值排名前5的靶點：TNF、AKT1、IL1B、VEGFA、MMP9，分別進行分子對接并計算結(jié)合能（表3）。一般認為結(jié)合能小于-5 kcal/mol表示化合物與靶點結(jié)合能力較好［8］。所選化合物與靶點的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說明結(jié)合能力較好。其中TNF與山奈酚、木犀草素，ATK1與β-谷甾醇，IL1B與豆甾醇，VEGFA與β-谷甾醇，MMP9與木犀草素結(jié)合能較低。將結(jié)果利用PyMOL軟件進行可視化處理（圖6）。

圖6 分子對接模型（A為TNF與山奈酚，B為TNF與木犀草素，C為ATK1與β-谷甾醇，D為IL1B與豆甾醇，E為VEGFA與β-谷甾醇，F(xiàn)為MMP9與木犀草素）

表3 分子對接結(jié)合能（kcal/mol）

討論

VTE是臨床上最常見的血管疾病，癌癥、手術等多種原因均可導致VTE的發(fā)生［9］，并有可能導致肺動脈栓塞等嚴重后果，是圍手術期非預期死亡的主要原因［10］。如何更安全有效地預防VTE的發(fā)生成為當前亟待解決問題。臨床應用已表明中醫(yī)藥在防治VTE方面療效確切且不良反應較?。?1］，但具體作用機制的研究仍較缺乏。

本研究初步篩選出桃紅四物湯合五苓散有效成分共103個，關鍵靶點68個。其中，主要成分槲皮素、山奈酚和木犀草素均屬于黃酮類化合物，能夠調(diào)控多種信號通路，具有抗炎、抗氧化、改善血流動力學［12-13］等多種生物活性；β-谷甾醇、豆甾醇具有非競爭性抑制凝血酶發(fā)揮抗血小板和溶栓作用［14］。

桃紅四物湯合五苓散干預VTE關鍵靶點主要為TNF、AKT1、IL1B、VEGFA、MMP9等。PPI網(wǎng)絡圖中，TNF是最核心靶點，在炎性反應中具有重要的作用。文獻研究表明，槲皮素可以下調(diào)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子-κB（NF-κB）等信號通路抑制TNF-α、IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生［15-16］。山奈酚可以降低血清中包括TNF-α、IL-1β等多種促炎因子的表達，從而發(fā)揮抗炎作用［17］，保護血管［18］。木犀草素可以抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路，抑制IL-1β誘導NF-κB激活的過程［19］，逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導的Ⅱ型膠原降解［20］。TNF-α與IL-1β是重要的炎癥因子，在細胞免疫反應中有重要的作用，可以與凝血系統(tǒng)的激活相互影響［21-22］，與VTE的發(fā)生具有一定相關性［23］。TNF-α、IL-1β等炎癥因子可以促進炎性發(fā)生與血液高凝狀態(tài)的形成，進一步損傷內(nèi)皮細胞［24］。TNF-α激活后可通過PI3K/AKT等信號傳導通路，最終激活NF-κB，導致IL-1β、IL-8等促炎因子共同激活，引起炎癥的鏈式反應，進一步加重血管損傷。同時，活化的AKT還可增強缺氧誘導因子（HIF）1α活性，激活HIF-1信號通路下游靶基因，如VEGF轉(zhuǎn)錄［25］。VEGF在缺氧狀態(tài)下可以促進一氧化氮產(chǎn)生，使環(huán)狀鳥苷酸增加，也有促進血小板聚集、引起血栓的作用［26］?？寡仔苑磻蛟S可以成為抗血栓形成，治療VTE的新方向。

MMP也是重要靶點之一。槲皮素、木犀草素可以抑制MMP-9的產(chǎn)生［16，27］。MMP具有降解細胞外基質(zhì)的生物活性，具有促進血管生成的作用［28］。在生理狀態(tài)下，它與其生物抑制劑金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）在組織中保持動態(tài)平衡，MMP/TIMP失衡可能是VTE的原因之一［29］。但是，MMP在血栓的形成和再通中具有雙向作用。在血栓形成過程中，MMP的高度表達使細胞外機制過度降解，損傷血管壁，增加血管通透性，與TNF、IL-1等促炎癥因子共同作用，促進血栓的形成；在血栓再通階段，MMP通過降低血管致密性，使血管更易向外擴張，促進新生血管形成，加速血栓的再通［30］。桃紅四物湯合五苓散能否雙向調(diào)節(jié)該通路仍需進一步研究。

GO和KEGG富集分析顯示，桃紅四物湯合五苓散干預血栓形成的靶基因主要涉及的生物過程包括細胞遷移的正調(diào)控、炎性反應、對脂多糖的反應等；細胞組分包括膜筏、細胞外間質(zhì)、血小板α顆粒腔等；參與分子功能包括信號受體調(diào)節(jié)器活性、氧還原酶活性、絲氨酸水解酶活性等；主要涉及流體剪切應力與動脈粥樣硬化、癌癥通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等信號通路，與PPI關鍵靶點結(jié)果相符合。分子對接顯示桃紅四物湯合五苓散的核心成分與關鍵靶點的結(jié)合能力均較好，進一步驗證了網(wǎng)絡藥理學結(jié)果，說明中藥復方可通過多靶點、多通路發(fā)揮作用，反映了中醫(yī)思維的整體觀。

本研究仍存在一定局限性，如：篩選藥物作用僅局限于數(shù)據(jù)庫范圍，未考慮多味中藥有效成分之間的相互作用等，需要進一步實驗驗證。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術，初步揭示桃紅四物湯合五苓散抗靜脈血栓的可能有效成分和作用靶點，并構(gòu)建相關作用網(wǎng)絡，為深入研究其作用機制提供了一定理論基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明宋潔菲：醞釀和設計試驗，實施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計分析；周迎光：醞釀和設計試驗，實施研究，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費，行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻