李璇 趙雯鈺 郭毅婷 賀亮 李軍紅 張艷芳

1鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州 450014；2鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，洛陽(yáng) 471099；3鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院甲乳外科，洛陽(yáng) 471099；4鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院病理科，洛陽(yáng) 471099

甲狀腺結(jié)節(jié)非常普遍，約1/3的人中患有甲狀腺結(jié)節(jié)，其中5%～15%為惡性結(jié)節(jié)［1］。近幾十年來(lái)，甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）發(fā)病率在我國(guó)呈快速上升趨勢(shì)，尤其是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）［1-2］。因此，評(píng)估甲狀腺結(jié)節(jié)的性質(zhì)是一個(gè)關(guān)鍵的臨床問(wèn)題。目前，細(xì)針穿刺活檢（fine needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB）是甲狀腺結(jié)節(jié)主要的診斷方法［3］。然而，在20%～30%的病例中，F(xiàn)NAB標(biāo)本的細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)并不確定［4-5］，使甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷陷入困境。對(duì)于無(wú)法明確性質(zhì)的結(jié)節(jié)，因存在惡性風(fēng)險(xiǎn)，患者多數(shù)會(huì)接受手術(shù)治療。據(jù)估計(jì)，高達(dá)50%的甲狀腺結(jié)節(jié)手術(shù)是不必要的［6］。

研究表明，分子、遺傳以及環(huán)境因素等都與TC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［7-8］。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約20個(gè)核苷酸的小型非編碼單鏈RNA，可與特定mRNA的3′-非翻譯區(qū)（3′UTR）結(jié)合，干擾細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和分化［9］。miRNAs在多種文獻(xiàn)中被提出作為癌癥通路的調(diào)控因子，并作為癌癥診斷的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，包括肺癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等［10-12］。miRNA150-5p被報(bào)道可調(diào)控多種癌癥的生物學(xué)和病理學(xué)進(jìn)程，是細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和凋亡的重要介質(zhì)［13-14］。但是，筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA150-5p在PTC中的表達(dá)方式未見(jiàn)報(bào)道。

在本研究中，筆者檢測(cè)了miRNA150-5p在PTC組織、癌旁組織及良性甲狀腺結(jié)節(jié)（benign thyroid nodule，BTN）組織中的表達(dá)水平，并分析miRNA150-5p鑒別診斷甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)的臨床價(jià)值。

資料與方法

1.研究對(duì)象

選擇2021年10月至2022年1月在鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院住院的43例PTC患者和19例BTN患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)術(shù)后病理檢查明確病理類(lèi)型；⑵術(shù)前未接受放療、化療及免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并嚴(yán)重的肝腎功能不全；⑵合并嚴(yán)重的心肺功能不全；⑶合并感染性疾病；⑷合并其他惡性腫瘤。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

2.臨床資料收集

⑴收集患者一般資料，包括年齡、性別。⑵禁食至少8 h后，早晨用真空采血管采集外周靜脈血8 ml，將血液標(biāo)本送至檢驗(yàn)科，由鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科工作人員按標(biāo)準(zhǔn)化流程檢測(cè)游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）、甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）、甲狀腺球蛋白（Tg）、癌胚抗原（CEA）、降鈣素（CT）。⑶甲狀腺超聲檢查由2位具有5年以上經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師進(jìn)行。超聲圖像分析結(jié)果包括：縱橫比（＜1或≥1）、邊界（清晰或不清晰）、包膜（不受侵犯、受侵犯）、回聲（其他回聲、低回聲）、微小鈣化（無(wú)、有）和甲狀腺影像報(bào)告與數(shù)據(jù)系統(tǒng)（TI-RADS）分級(jí)（＜4級(jí)或≥4級(jí)）。

3.RNA提取和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）

將腫瘤組織、癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣約2 cm）和良性組織采集在一個(gè)2.0 ml的Eppendorf管中，并加入1.5 ml RNAlater液（Invitrogen），然后儲(chǔ)存在-80 ℃。根據(jù)制造商的方案，使用RNAiso Plus（Takara）從新鮮組織中提取RNA，并使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（Takara）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。U6作為內(nèi)參基因。將TB Green Advantage RT-qPCR Premix Kit（Takara）用于miRNA150-5p的qRT-PCR。進(jìn)行3次RT-qPCR，并使用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)水平的變化。內(nèi)參基因U6正向引物：GGAACGATACAGAGAAGATTAGC，反向引物TGGAACGCTTCACGAATTTGCG。miRNA150-5p引物序列：TCTCCCAACCCTTGTACCAGTG（生工生物工程公司）。

4.統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 24.0軟件和GraphPad Prism 9.0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩獨(dú)立組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，兩配對(duì)組間比較應(yīng)用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）的形式表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用單因素和多因素logistic回歸模型分析PTC的影響因素。采用受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC）分析miRNA150-5p預(yù)測(cè)PTC的診斷效能，得到ROC下面積（AUC）、靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.PTC組和BTN組的臨床資料

PTC組年齡小于BTN組，PTC組TSH水平明顯高于BTN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩組性別和FT3、FT4、TPOAb、TgAb、Tg、CEA、CT水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。PTC組縱橫比≥1、邊界不清、包膜受侵犯、TI-RADS分級(jí)≥4級(jí)的比例明顯高于BTN組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 PTC組與BTN組臨床資料比較

2.miRNA150-5p在PTC組織的表達(dá)量低于配對(duì)的癌旁組織

miRNA150-5p在PTC組織的表達(dá)水平低于配對(duì)的癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A）。癌癥基因組圖譜（TCGA）RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步支持了這一觀(guān)點(diǎn)：與配對(duì)的癌旁組織相比，PTC組織中miRNA150-5p的表達(dá)量顯著較低（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 A：miRNA150-5p在PTC及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)。B：癌癥基因組圖譜RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNA150-5p在PTC及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)

3.miRNA150-5p在PTC組織中的表達(dá)量低于BTN組織

miRNA150-5p在PTC及BTN組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為2.032（0.173，7.329）和13.17（6.031，93.7）；與良性受試者相比，PTC組織中miRNA150-5p表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2A）。為了進(jìn)一步確定miRNA 150-5p在甲狀腺腫瘤組織中的表達(dá)，使用TCGA RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)研究了514例PTC和59例正常甲狀腺組織中miRNA150-5p的表達(dá)水平；如預(yù)期，miRNA150-5p在PTC組織中的表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）（圖2B）。

圖2 A：miRNA150-5p在PTC及BTN組織中的表達(dá)。B：癌癥基因組圖譜RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNA150-5p在PTC及正常組織中的表達(dá)

4.單因素和多因素logistic回歸模型分析PTC的影響因素

單因素logistic回歸分析顯示，miRNA150-5p表達(dá)量、年齡、TSH水平、縱橫比≥1、邊界不清晰、包膜受侵犯和TI-RADS分級(jí)≥4級(jí)與PTC有關(guān)（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 43例PTC患者影響因素的單因素分析

將甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性作為因變量，納入miRNA150-5p表達(dá)量、年齡、TSH、縱橫比≥1、邊界不清晰、包膜受侵犯和TI-RADS分級(jí)≥4級(jí)構(gòu)建多因素logistic回歸方程，結(jié)果顯示，miRNA150-5p表達(dá)量是PTC的獨(dú)立影響因素，miRNA150-5p表達(dá)量越高，發(fā)生PTC的風(fēng)險(xiǎn)越小，見(jiàn)表3。

表3 43例PTC患者影響因素的多因素分析

5.miRNA150-5p在PTC中的潛在診斷價(jià)值

利用ROC評(píng)估m(xù)iRNA150-5p水平診斷PTC的準(zhǔn)確性。ROC下面積（AUC）為0.797（95%CI=0.689～0.905，P＜0.001）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miRNA150-5p預(yù)測(cè)PTC的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度分別為67.44%、89.47%和74.19%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為93.55%、54.84%。見(jiàn)圖3、表4。

圖3 受試者工作特征曲線(xiàn)分析miRNA150-5p對(duì)43例甲狀腺乳頭狀癌患者的診斷價(jià)值

討論

在本研究中，筆者分析了PTC患者的一些臨床特征，結(jié)果顯示，與BTN患者相比，PTC患者更年輕，TSH水平更高，這與以往的研究一致［15-16］。Zheng等［17］分析56篇研究發(fā)現(xiàn)，PTC患者血清TSH水平明顯高于BTN患者，PTC組血清TSH水平約為BTN組的1.44倍，東亞人為1.39倍，白種人為1.72倍。根據(jù)Golbert L等［18］的研究，較高的血清TSH水平與TC風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，將TSH水平作為甲狀腺惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)分層的輔助診斷指標(biāo)可能有助于確定最佳的治療方法。有研究發(fā)現(xiàn)，TgAb、TPOAb對(duì)惡性甲狀腺結(jié)節(jié)的檢出率分別為63.64%、62.63%［19］。本研究在PTC患者中發(fā)現(xiàn)了較高的TPOAb和TgAb水平，但分析結(jié)果顯示兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這一結(jié)果可能與樣本量的大小及樣本的入選條件有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。根據(jù)《2022年甲狀腺癌診療指南》，TC的腫瘤標(biāo)志物有Tg、CT、CEA。Tg在鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性方面缺乏特異性，但血清Tg變化可作為判別腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。血清中CT和CEA水平變化有助于髓樣癌患者評(píng)估療效以及病情監(jiān)測(cè)。甲狀腺結(jié)節(jié)的超聲惡性征象有縱橫比≥1、邊界不清晰、實(shí)性低回聲結(jié)節(jié)、有微小鈣化、甲狀腺外侵犯等。超聲TI-RADS分級(jí)是術(shù)前篩查及診斷甲狀腺結(jié)節(jié)的重要手段之一，TI-RADS分級(jí)越高，惡性的概率越大。在本研究中，PTC組中縱橫比≥1、邊界不清晰、包膜受侵犯、TI-RADS分級(jí)≥4級(jí)的患者的比例明顯高于BTN組。但是，甲狀腺超聲只能初篩甲狀腺結(jié)節(jié)的良惡性，不能明確診斷，且準(zhǔn)確度受醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)的影響。

miRNA對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有很大的影響，它可以精確地與mRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)［20］。miRNA具有幾個(gè)潛在的優(yōu)勢(shì)，包括易于PCR檢測(cè)、相對(duì)同質(zhì)性和高度特異性的表達(dá)。研究表明，miRNA在人體內(nèi)具有組織特異性，有些癌癥會(huì)高水平表達(dá)miRNA，而有些癌癥則會(huì)低水平表達(dá)。miRNA150-5p在胃癌、宮頸癌、非小細(xì)胞癌中高表達(dá)［21-23］，在頭頸部鱗癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌中低表達(dá)［24-26］。在本研究中，筆者使用qRT-PCR檢測(cè)了PTC組織、癌旁組織及BTN組織標(biāo)本中miRNA150-5p的表達(dá)水平。本研究數(shù)據(jù)顯示，與配對(duì)癌旁組織和BTN組織相比，miRNA150-5p在PTC組織中的表達(dá)明顯降低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，通過(guò)分析從TCGA RNA-Seq數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的514例PTC組織及59例正常甲狀腺組織基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)PTC組織中miRNA150-5p的表達(dá)量顯著低于正常組織。

鑒于miRNA150-5p在PTC中的表達(dá)顯著較低，筆者進(jìn)一步研究了miRNA150-5p表達(dá)與PTC之間的關(guān)系。在多因素logistic回歸方程中納入miRNA150-5p表達(dá)量、年齡、TSH、縱橫比≥1、邊界不清晰、包膜受侵犯和TI-RADS分級(jí)≥4級(jí)等變量，miRNA150-5p表達(dá)量仍是PTC的一個(gè)重要影響因素，miRNA150-5p表達(dá)量越高，發(fā)生PTC的風(fēng)險(xiǎn)越小，表明它可能對(duì)PTC的發(fā)生至關(guān)重要。miRNA150-5p通過(guò)靶向基質(zhì)金屬蛋白酶14（MMP14）抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲［27］。miRNA150-5p通過(guò)抑制TP53抑癌基因促進(jìn)結(jié)腸腺癌增殖［28］。miRNA150-5p在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)靶向SRCIN1促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和癌細(xì)胞的增殖［22］。miRNA150-5p通過(guò)靶向Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖［29］。然而，miRNA150-5p影響PTC發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚，未來(lái)需要更多的研究。

近年來(lái)，遺傳檢測(cè)已成為發(fā)展迅速的方法之一，其診斷用途日益增加。miRNA是一種有前途的診斷工具，將miRNA引入PTC診斷程序?qū)⑻岣吡夹院蜐撛趷盒圆∽兊膮^(qū)分。更詳細(xì)地了解PTC發(fā)生過(guò)程中miRNA的作用機(jī)制可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的潛在醫(yī)學(xué)靶點(diǎn)，這對(duì)于腫瘤的臨床管理尤其重要。筆者利用ROC分析了miRNA150-5p預(yù)測(cè)診斷PTC的價(jià)值：miRNA150-5p的AUC為0.797，特異度、靈敏度和準(zhǔn)確度分別為89.47%、67.44%和74.19%；因此，推測(cè)其可作為PTC潛在的診斷標(biāo)志物。miRNA在甲狀腺結(jié)節(jié)鑒別診斷中的作用已有研究，利用ROC分析miRNA223-5p、miRNA16-2-3p、miRNA152-3p、miRNA34a-5p、miRNA31-5p對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值，其AUC分別為0.720、0.690、0.630、0.604、0.580［30-31］?？梢钥闯?，單個(gè)miRNA的診斷價(jià)值有限；因此，可以將更多的miRNAs聯(lián)合應(yīng)用于PTC的診斷，提高術(shù)前PTC診斷的準(zhǔn)確度。

綜上所述，miRNA150-5p在PTC組織中顯著低表達(dá)，miRNA150-5p在區(qū)分PTC患者和BTN患者方面具有良好的診斷性能，有望成為診斷PTC的潛在生物標(biāo)志物。因此，在臨床實(shí)踐中，miRNA可以被認(rèn)為是一種新的、有前途的、微創(chuàng)的PTC診斷工具。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA在PTC檢測(cè)中的準(zhǔn)確性，未來(lái)還需要對(duì)更大的樣本進(jìn)行更多的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突