許玉珍,王嘉陽,胡 英,龍啟福,繆增強,永 勝

(青海大學醫(yī)學部,青海 西寧 810016)

氧對哺乳動物有氧代謝至關重要[1]。高原地區(qū)氧含量的下降會削弱有氧代謝,引起機體循環(huán)功能下降,導致組織、器官的營養(yǎng)和能量減少,造成不同程度的氧化損傷,誘導高原肺水腫[2]和高原腦水腫[3]等高原病的發(fā)生。因此,研究高原病的發(fā)病機制成為近年來高原醫(yī)學備受關注的課題。有研究表明,低氧會影響免疫細胞的新陳代謝和功能,且與高原病的發(fā)生發(fā)展有密切關系,且高原低氧(HST)環(huán)境可以調節(jié)免疫基因的表達、影響機體免疫功能、誘導炎癥反應發(fā)生等[4]。此外,KIANI等[5]研究發(fā)現(xiàn),在低氧環(huán)境下,磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)和核因子κB(NF-κB)共同調控T、B細胞受體活化信號,在固有和適應性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。然而,HST刺激如何調控機體免疫功能的研究仍然有限,因此深入了解低壓低氧刺激如何調控機體的免疫應答過程,進而適應低氧脅迫是亟待解決的重要科學問題。

眾所周知,脾臟是機體最大的免疫器官,含有大量的淋巴細胞,在細胞免疫和體液免疫應答過程中都發(fā)揮著不可或缺的作用。據(jù)報道,HST脅迫下,低氧誘導因子-1α(HIF-1α)通過抑制雷帕霉素復合物1(mTORC1)介導的骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物(Myc)相關通路調節(jié)Tfh與Th1細胞的發(fā)育,促進生發(fā)中心B細胞的增殖[6]。此外,LI等[7]研究發(fā)現(xiàn),HIF-1α是前B細胞中miR-582的靶點,敲除miR-582后,激活mTORC2,增強HIF-1α的表達和Akt磷酸化,促進前B細胞增殖,調節(jié)早期B細胞的分化發(fā)育。進一步研究發(fā)現(xiàn),新型冠狀病毒感染患者B細胞中出現(xiàn)低氧有關的轉錄變化,引起B(yǎng)細胞發(fā)育異常,包括B細胞減少、抗體類別的轉換和親和力成熟等,誘導炎癥反應加劇和自身免疫反應的發(fā)生,提示在新型冠狀病毒感染中,適當?shù)脑缙谘醑煏纳泼庖叻磻?利于疾病的恢復[8]。上述研究提示低氧與T、B細胞分化發(fā)育密切相關,探究T、B細胞響應低氧應激的分子機制為臨床免疫療法提供新思路。

隨著測序技術的發(fā)展,高通量測序技術成為了解低氧脅迫影響免疫反應及其通路和基因表達的有力工具。RNA測序(RNA-seq)的轉錄組分析技術可以從大量轉錄信息中識別差異表達基因(DEGs),分析核心調控通路,成為探究低氧脅迫機體各個組織系統(tǒng)響應免疫應答機制不可或缺的工具[9]。有研究發(fā)現(xiàn),低壓低氧環(huán)境下大鼠腸道模型中PPAR信號通路、礦物質吸收、甘油三酯代謝、脂肪消化和吸收等消化相關代謝途徑在京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路分析中顯著富集,為大鼠在低氧環(huán)境下胃腸道調節(jié)的潛在分子機制提供新的理論依據(jù)[10]。ZHOU等[11]研究發(fā)現(xiàn),低壓低氧暴露的幼年鳙魚心臟模型中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號、細胞凋亡和腎上腺素信號等相關代謝途徑在KEGG通路分析中得到了高度富集,為幼年鳙魚在低氧環(huán)境下的應激分子機制提供線索。這些研究提示,轉錄組測序技術在探究低氧脅迫適應的分子機制中發(fā)揮著重要作用。

因此,本實驗采用轉錄組測序技術研究HST脅迫對小鼠脾臟T、B細胞的影響,挖掘與T、B細胞受體相關通路和關鍵基因,明確其在HST條件下T、B細胞的調控機制,為揭示低氧脅迫下免疫細胞調控機制的相關研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡的SPF級C57BL/6小鼠,購自西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心,動物許可證號:SYXK 2020-005,飼養(yǎng)于溫度為18～22 ℃、濕度為45%～55%的實驗動物房中,自由飲水、進食,保持環(huán)境衛(wèi)生。待小鼠適應周圍環(huán)境后,將小鼠隨機分成2組,每組5只。對照組即平原常氧組(PSC組),在西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心(海拔400 m)飼養(yǎng)30 d;實驗組即HST組,在青海省果洛藏族自治州瑪多縣人民醫(yī)院實驗動物房(海拔4 200 m)。30 d后無菌采集小鼠脾臟組織置于液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑 逆轉錄聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒(TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus,RR820A,Takara,日本);逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser,RR047A,Takara,日本);Trizol裂解液(美國Invitrogen公司)。

1.3方法

1.3.1總RNA提取和Illumina測序 從各組小鼠脾臟中提取總RNA(常規(guī)Trizol法),將總RNA中純化的mRNA打斷并逆轉錄成cDNA,經(jīng)末端修復、PCR擴增等過程制備mRNA-Seq文庫進行Illumina測序。

1.3.2RNA-Seq質量評估和序列比對 為了保證數(shù)據(jù)分析的質量及可靠性,對高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)(raw reads)進行過濾,主要包括去除原始數(shù)據(jù)中有測序接頭(adapter)的reads或測序質量較低的reads,對clean data 進行后續(xù)高質量分析。使用 HISAT2軟件構建索引,將配對末端 clean reads 與參照基因組比對,采用皮爾遜相關性檢測對樣本的基因表達水平進行精確分析。

1.3.3DEGs分析 對PSC組和HST組通過DESeq2統(tǒng)計軟件,基于負二項式分布模型進行差異基因表達數(shù)據(jù)分析。用FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)對基因長度和深度校正其表達水平。以|log2FC|≥0作為顯著差異表達的閾值。

1.3.4基因本體(GO)注釋、KEGG分析和基因富集分析 采用clusterProfiler (3.4.4)富集分析,找出DEGs顯著富集的GO條目并計算P值。GO(http://www.geneontology.org/)即基因本體數(shù)據(jù)庫,包括生物過程(BP)、細胞組成(CC)和分子功能(MF)3個部分。

KEGG(http://www.kegg.jp/)是分子水平的數(shù)據(jù)庫資源,通過高通量數(shù)據(jù)庫,了解細胞、生物體和生態(tài)系統(tǒng)的高級功能和效用。采用 clusterProfiler(3.4.4)軟件分析計算KEGG通路中DEGs即P<0.05視為顯著富集?；蚣患治鯣SEA(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp):從基因集富集分析的角度出發(fā),針對有重要生物學意義但差異表達較小的基因進行功能富集分析,作為KEGG數(shù)據(jù)集的補充工具。

1.3.5實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)驗證 將RNA逆轉錄為DNA,cDNA合成是按照制造商的說明使用PrimeScriptTMRT試劑盒進行。以β-actin作為內參,檢測PD-1、CTLA4、CD45、CD4、CD8a、CD8b1、CD3e、ICOS、CD28、CD40L、PIR-B、CD22、CD72、Igα、Igβ、FcgRIIB、LEU13、CD81、CD19、CD21、SHP1、GRB2、SOS、Ras、Raf、MEK1/2、p38、NFAT、PI3K、Akt、GSK-3β、NIK、IKKα、NF-κB、IκB、TNF-α、IFN-γ的mRNA表達量,引物序列詳見表1。

表1 RT-qPCR引物信息

2 結 果

2.1PSC組和HST組脾臟DEGs 30 d的HST處理后,以|log2FC|≥0和P-校正<0.05為篩選條件,共鑒定出4 213個DEGs,其中1 947個基因表達上調,2 266個基因表達下調(圖1)。為了研究PSC和HST下脾臟轉錄組數(shù)據(jù)之間的樣本異質性,對各組樣品進行Pearson相關系數(shù)分析(圖2),結果表明各樣本間基因表達量的相關系數(shù)R2>0.95,提示生物學重復樣本間基因表達情況較為一致,實驗數(shù)據(jù)可靠,且小鼠脾臟組織在不同海拔高度下對低氧誘導反應有差異。

圖1 DEGs柱

圖2 Pearson相關性系數(shù)分析

2.2DEGs的GO富集分析 通過GO富集分析對DEGs進行BP、CC、MF富集(圖3)。主要參與B細胞激活、適應性免疫應答、淋巴細胞激活的正向調節(jié)信號通路等GO生物過程;并在免疫球蛋白復合體和免疫球蛋白復合體循環(huán)等細胞組分的構成方面起作用;參與抗原結合和免疫球蛋白受體結合等分子功能。提示免疫系統(tǒng)在HST脅迫下發(fā)生了重要變化。

圖3 DEGs的GO注釋圖

2.3DEGs的KEGG富集分析 在HST脅迫下得到DEGs進行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),主要參與T、B細胞受體,PI3K-Akt,MAPK,NF-κB等多個免疫炎癥相關信號通路調控,見圖4。

圖4 DEGs的KEGG通路富集

2.4RT-qPCR驗證結果 對T、B細胞受體信號通路中的DEGs及相關炎癥因子進行了mRNA表達量的檢測,結果發(fā)現(xiàn),T細胞表面膜分子:PD-1、CTLA4、CD45、CD4、CD8a、CD8b1、CD3e、ICOS、CD28、CD40L在PSC組與HST組之間均表現(xiàn)出顯著上調差異表達;B細胞表面膜分子:PIR-B、CD22、CD72、Igα、Igβ、FcgRIIB、LEU13、CD81、CD19、CD21均表現(xiàn)出顯著差異變化;T、B細胞受體信號通路共有基因:PI3K-Akt途徑中PI3K、Akt、GSK-3β、NIK、IKKα基因,p38 MAPK和NF-κB途徑中SHP1、GRB2、SOS、Ras、Raf、MEK1/2、p38、NF-κB、IκB基因均出現(xiàn)差異表達。此外,相比于PSC組,HST組的INF-γ和TNF-α等炎性細胞因子出現(xiàn)顯著上調差異表達。因此,上述結果提示,在HST脅迫下通過影響T、B細胞受體信號通路介導炎癥反應發(fā)生。見圖5。

注:A.T細胞表面膜分子;B.B細胞表面膜分子;C.T、B細胞受體信號通路共有基因。與PSC組相比,aP<0.000 1,bP<0.05,cP<0.001,dP<0.01。

3 討 論

經(jīng)過30 d HST暴露后,發(fā)現(xiàn)HST組相較于PSC組小鼠脾臟組織多個基因發(fā)生了顯著差異表達。有研究發(fā)現(xiàn),缺氧抑制白細胞介素-2誘導的T細胞增殖過程,同時抑制抗原誘導的細胞毒性T細胞中促炎性細胞因子的產(chǎn)生[12]。據(jù)報道,低氧暴露會引起機體對傷害性刺激做出防御性反應,在免疫應答過程中,免疫細胞被激活、分裂和分化,通過誘導炎癥消除危險信號以保護機體免受傷害[13]。本研究通過比較暴露于不同海拔的小鼠脾臟組織轉錄組譜,探討低氧對小鼠T、B細胞信號通路的影響機制。

為了解HST脅迫對小鼠脾臟T細胞膜受體激活機制,本實驗對T細胞膜受體的10個基因進行RT-qPCR實驗驗證,結果發(fā)現(xiàn)基因均出現(xiàn)了顯著性上調變化(圖5),提示TCR識別活化信號后,經(jīng)CD3和共受體CD4或CD8傳遞T細胞活化的第一信號,啟動T細胞激活,其次CD28、ICOS、CD40L共刺激分子相互作用下提供第二信號誘導T細胞完全活化,共抑制分子PD-1和CTLA4基因表達也顯著上調,提示機體同時啟動免疫抑制信號,下調或中止了免疫應答。

此外,HST脅迫對小鼠脾臟B細胞膜受體的激活與T細胞相似,也需要雙信號活化。BURROWS等[14]研究發(fā)現(xiàn)小鼠B細胞中HIF-1α激活后,BCR編輯減少和未成熟B細胞的發(fā)育停止,導致外周B細胞數(shù)量減少,HIF-1α的動態(tài)調節(jié)對正常的B細胞發(fā)育至關重要。本研究結果發(fā)現(xiàn),B細胞膜受體中的Igα、Igβ、CD19、CD21、CD81基因顯著下調,提示激活BCR后,與Igα/β胞內區(qū)相關聯(lián)的酪氨酸激酶LYN活化,使Igα/β、CD19/CD21/CD81胞內段的ITAM酪氨酸殘基被磷酸化后發(fā)生負調節(jié),隨后募集并活化SYK,進而啟動B細胞內信號轉導的級聯(lián)反應。

T、B細胞受體信號通路參與免疫應答、炎癥反應及細胞生長、凋亡等生物事件的發(fā)生。為了進一步明確HST脅迫對小鼠脾臟T、B細胞內信號通路影響的機制,對T、B細胞受體信號通路中的DEGs進行了分析,提示低氧激活T、B細胞,啟動信號級聯(lián)反應將活化信號轉入T、B細胞內,一方面活化信號激活PI3K后,催化PIP2的3位羥基磷酸化生成PIP3為第二信使,招募PDK1和Akt到質膜上,磷酸化Akt蛋白的第308號蘇氨酸,導致Akt活化,進一步激活下游GSK-3β和IKKα。Akt磷酸化GSK3β后,導致β-catenin在胞漿內大量聚集,進入細胞核激活T、B細胞分裂、生長調控及炎癥相關基因(如IFN-γ、TNF-α等);IKKα被Akt磷酸化激活后,IKKα進一步磷酸化能夠抑制NF-κB途徑的轉錄因子IκB。以上結果提示,HST脅迫引起PI3K-Akt信號軸激活,導致免疫調節(jié)和炎癥因子的產(chǎn)生(如IFN-γ、TNF-α等)。有研究表明,PI3K-Akt是各種細胞表面受體激活的脂質激酶家族,PI3K-Akt可以控制T、B細胞從淋巴結的進出,以及炎癥組織中T、B細胞的招募和擴增[15]。據(jù)報道,HST暴露的大鼠腦組織中HIF、血管內皮生長因子(VEGF)、PI3K和Akt的磷酸化顯著增強,激活大鼠腦組織中PI3K-Akt信號通路,參與腦組織炎癥損傷和凋亡[16]。有研究發(fā)現(xiàn),PI3K-Akt和HIF-1α通路是介導小鼠卵巢癌的關鍵致癌通路,其中,鹽誘導激酶2(SIK2)可以激活PI3K-Akt、HIF-1α和線粒體動力相關蛋白1(Drp1)磷酸化引起線粒體裂變,導致免疫平衡失調,進而誘發(fā)癌癥[17]。此外,有研究報道,IFN-γ刺激促炎巨噬細胞的活化,抑制腫瘤組織中的血管生成,誘導調節(jié)性T細胞凋亡,進而克服腫瘤的進展[18]。同時,慢性炎癥與TNF-α的過度激活密切相關,并最終可能導致自身免疫性疾病[19]。結合以上研究結果,HST脅迫通過激活T、B細胞受體信號通路內PI3K-Akt信號途徑,促進炎性細胞因子的成熟和分泌,從而發(fā)揮炎癥和免疫效應。

另一方面活化信號轉入T、B細胞內,通過抑制性共受體(PIR-B、CD22、CD72)向免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)招募磷酶來負調節(jié)BCR信號傳導,抑制SHP1基因表達,進一步磷酸化SOS和Ras,導致MEK1/2、p38、NFKB基因顯著下調,抑制p38 MAPK和NF-κB信號通路,對免疫應答產(chǎn)生抑制作用,從而在清除抗原的同時保持機體的免疫平衡。如,ZHU等[20]研究發(fā)現(xiàn),通過抑制缺血缺氧性腦損傷(HIBI)模型大鼠的p38 MAPK信號通路,減少海馬組織中的神經(jīng)元凋亡,從而提高HIBI大鼠的學習記憶能力和運動功能。KAUPPINEN等[21]研究還發(fā)現(xiàn),NF-κB信號傳導在固有免疫防御中起著重要作用,通過激活沉默信息調節(jié)因子(SIRT1)可抑制NF-κB信號傳導,發(fā)揮抗炎、抗氧化和抗損傷,維持內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。此外,有報道稱,異丙酚通過抑制p38 MAPK和NF-κB信號通路來減少炎癥因子的釋放并緩解腸道水腫,從而減輕和治療大鼠的腸道缺血/再灌注損傷[22]。?；撬嵬ㄟ^下調p38 MAPK和NF-κB信號通路,抑制炎癥反應和氧化應激,從而緩解肺損傷,恢復呼吸功能并降低炎癥因子水平[23]。結合上述研究提示,30 d HST暴露小鼠通過抑制p38 MAPK和NF-κB信號途徑,引起T、B細胞受體信號通路有效地執(zhí)行宿主防御響應的分子機制[24-25]。

T、B細胞受體信號通路是復雜的細胞內網(wǎng)絡。因此,本研究基于轉錄組測序結果對T、B細胞受體信號通路相關基因進行分析和RT-qPCR的驗證。本實驗發(fā)現(xiàn),T、B細胞受體信號通路中顯著性DEGs在PI3K-Akt、p38 MAPK和NF-κB通路中。結果提示,HST脅迫通過激活PI3K-Akt通路,抑制p38 MAPK和NF-κB通路,誘導脾臟組織T、B細胞受體信號通路發(fā)生改變,致使機體內部免疫調節(jié)和炎癥反應的發(fā)生。因此,這一結果將為研究HST對小鼠T、B淋巴細胞的調控機制提供新的見解,也為高原醫(yī)學在醫(yī)學免疫學領域的發(fā)展提供新的理論依據(jù)。