張哲源,劉怡文,付 臻,楊海軍,代寧濤,李軍擴,孫 蔚,郭藝博,孔金玉,周福有

1)安陽市腫瘤醫(yī)院;河南科技大學附屬安陽市腫瘤醫(yī)院;河南省食管癌精準防治醫(yī)學重點實驗室 河南安陽 455000 2)河南科技大學臨床醫(yī)學院;河南科技大學第一附屬醫(yī)院;河南省微生態(tài)與食管癌防治重點實驗室;河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室 河南洛陽 471003 3)安陽市腫瘤醫(yī)院影像科 河南安陽 455000 4)安陽市腫瘤醫(yī)院病理科 河南安陽 455000 5)安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科 河南安陽 455000

食管癌發(fā)病率與死亡率極高,早期臨床癥狀不明顯,確診時多發(fā)展至中晚期[1]。中晚期食管癌患者最主要的治療方式之一為化療,其中紫杉醇(pachitaxel,PTX)為最常用的化療藥物,但易產(chǎn)生耐藥[2]。因此,探明PTX的耐藥機制,對于改進食管癌治療方案、改善食管癌患者預后至關重要。本團隊前期研究[3-4]已證實具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)的長期定植,不僅可重塑腫瘤微環(huán)境,削弱機體抗腫瘤免疫反應,還可促進腫瘤細胞葡萄糖代謝,為其惡性增殖提供能量。雖然Fn在食管癌中的致病機制有待進一步探討,但本團隊已證實Fn感染可導致食管癌患者預后不良[1,5]。研究[6]表明,固有免疫系統(tǒng)在機體抵抗病原微生物入侵時發(fā)揮重要作用,而炎癥復合體為機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分;其中,核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)是炎癥復合體中最具特征性的多聚體蛋白復合體[7]。多種病原微生物均可通過活化NLRP3,誘導促炎因子成熟并分泌到胞外,調控免疫應答,引發(fā)炎癥反應,為自身長期定植提供有利條件[8],且NLRP3的活化可使腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)干性增強[9]。有研究[10]顯示,CSCs為腫瘤耐藥、復發(fā)和轉移的根源,對各種治療均具有抗性;且乙醛脫氫酶1(acetaldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)已被證實可作為食管癌優(yōu)選的干細胞標記物。本研究首先建立NLRP3敲降的食管癌細胞系,用Fn分別感染親本與敲降細胞系,探討Fn對食管癌細胞中NLRP3的調控機制;然后通過PTX干預裸鼠皮下荷瘤實驗,研究Fn感染導致PTX化療抵抗的系統(tǒng)機制,為食管癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器人食管癌KYSE150細胞系(上海博谷生物科技有限公司),293T細胞系(中國醫(yī)學科學院),Fn標準菌株(ATCC 25586,美國路易斯維爾大學捐贈);腦心浸液培養(yǎng)基(法國梅里埃公司)、體積分數(shù)5%無菌脫纖維綿羊血、體積分數(shù)1%氯化血紅素和 1 g/L維生素K1(中國索萊寶科技有限公司),胎牛血清(美國Gibco公司),RPMI 1640與DMEM 培養(yǎng)基(美國HyClone公司),NLRP3敲降質粒及慢病毒包裝試劑盒(美國GeneCopeia公司),ALDEFLUORTM試劑盒(加拿大Stemcell technologies公司),SPF級BALB/C雄性裸鼠[中國常州卡文斯實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(蘇)2016-0010],熒光素酶檢測試劑盒(德國Berthold Technologies公司),CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所),PTX(美國Selleck Chemicals公司),NLRP3與ALDH1兔抗人單克隆抗體(美國Abcam公司),GAPDH兔抗人單克隆抗體、山羊抗兔IgG、BCA蛋白定量試劑盒及ECL發(fā)光顯影液(中國康為世紀生物科技有限公司)。凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司),厭氧工作站(美國COY公司),流式細胞儀(美國貝克曼公司),酶標儀及PE小動物活體光學成像系統(tǒng)(美國珀金埃爾默公司)。

1.2 NLRP3敲降食管癌細胞系的構建于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)293T 細胞,待密度為70%時,開始轉染。采用慢病毒包裝試劑盒,將NLRP3敲降質粒(NLRP3-DNA)配制為NLRP3-DNA-EndoFectin混合物,具體步驟參照說明書進行。將混合物加入293T細胞中,48 h后收取病毒上清,0.45 μm濾器過濾,去除細胞碎片。待KYSE150細胞密度至70%時,加入病毒上清進行轉染,嘌呤霉素篩選2周。提取細胞蛋白質,通過Western blot檢測NLRP3敲降效率。將NLRP3敲降后的細胞命名為KYSE150-N。

1.3 食管癌細胞的Fn感染于厭氧工作站(37 ℃,體積分數(shù)85% N2、10% H2和5% CO2)中常規(guī)培養(yǎng)Fn,培養(yǎng)基為含體積分數(shù)5%無菌脫纖維綿羊血、體積分數(shù)1%氯化血紅素和1 g/L維生素K1的腦心浸液培養(yǎng)基。Fn具體培養(yǎng)方法及純度鑒定方法參照本課題組前期研究[5]。待KYSE150及KYSE150-N細胞密度為70%時,將對數(shù)生長期Fn菌液加入細胞培養(yǎng)基(感染復數(shù)MOI=10),感染不同時間(12、24、48和72 h)。將Fn感染72 h后的兩種細胞命名為KYSE150+Fn及KYSE150-N+Fn。

1.4 各組細胞和瘤體組織中NLRP3及ALDH1蛋白表達的檢測提取Fn未感染組和Fn感染組(12、24、48與72 h)KYSE150細胞蛋白以及KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn組細胞及裸鼠瘤體組織蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。樣本(30 μg總蛋白/泳道)于100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,并轉移至PVDF膜。含50 g/L脫脂牛奶液的TBST室溫封閉1 h,NLRP3、ALDH1(按1∶1 000 TBST稀釋)和GAPDH(按1∶2 000 TBST稀釋)抗體4 ℃孵育過夜,山羊抗兔IgG(按1∶2 000 TBST稀釋)孵育2 h,用ECL發(fā)光顯影液于凝膠成像系統(tǒng)中檢測目的蛋白條帶,Image Lab軟件測定蛋白條帶灰度值,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值為最終蛋白相對表達量[11]。實驗重復3次。

1.5 各組細胞PTXIC50的CCK-8檢測采用CCK-8試劑盒檢測:①Fn未感染組及Fn感染組(12、24、48和72 h)KYSE150細胞的PTX 24 h藥物IC50。②KYSE150組、KYSE150-N組、KYSE150+Fn組及KYSE150-N+Fn組細胞的PTX 24 h藥物IC50。每組細胞均于96孔板中配制100 μL細胞懸液(每孔1 000個細胞),至培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h(37 ℃、體積分數(shù)5%CO2)。每組均設置1個對照孔及不同質量濃度的實驗孔(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5……30.0 mg/L),按質量濃度分別加入PTX,培養(yǎng)24 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL,1 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。酶標儀測定OD450 nm,計算IC50[12]。實驗重復3次。

1.6 各組細胞體外增殖能力的平板克隆檢測將KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn組細胞分別接種于6孔板,每孔1 000個細胞,常規(guī)培養(yǎng)1周。當出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng),棄去培養(yǎng)基。經(jīng)PBS沖洗、體積分數(shù)4%甲醛固定、結晶紫染色后,拍照并計數(shù)克隆數(shù)[13]。實驗重復3次。

1.7 各組細胞克隆成球能力的成球實驗檢測將KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn組細胞配制成單細胞懸液,每組取1×105個細胞,于低吸附皿中懸浮培養(yǎng)1周,當出現(xiàn)肉眼可見的克隆球時終止培養(yǎng),對直徑 40 μm的克隆球進行拍照,計數(shù)[14]。實驗重復3次。

1.8 各組細胞中的CSCs百分比檢測將KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn組細胞用ALDEFLUORTM檢測緩沖液調整至1×106個/mL。每組抽取1 mL細胞懸液放入檢測管(DEAB-),并于對照管(DEAB+)加入5 μL二乙氨基苯甲醛(diethylaminobenzaldehyde,DEAB)。于檢測管的細胞懸液中加入5 μL ALDEFLUORTM試劑混勻,并抽取0.5 mL混合物加入對照管。37 ℃孵育30 min后離心棄上清,留取細胞沉淀。用0.5 mL ALDEFLUORTM檢測緩沖液重懸細胞沉淀,并于流式細胞儀上檢測。以檢測管與對照管中CSCs百分比的差值為最終CSCs百分比[14]。實驗重復3次。

1.9 各組細胞成瘤能力的裸鼠皮下荷瘤實驗選擇24只4～6周齡健康SPF級雄性BALB/C裸鼠(約20 g)為實驗對象。于溫度為 (25±2) ℃且濕度為 40%～60%的SPF級鼠籠飼養(yǎng)。自然晝夜照明。裸鼠自由進食、飲水(飼料、飲水均為SPF級)。適應性飼養(yǎng) 1周后,隨機分為4組,每組6只。用熒光素酶標記KYSE150、KYSE150-N、KYSE150+Fn和KYSE150-N+Fn細胞,然后按分組于每只裸鼠右側腋下接種標記后的細胞(5×106個)。接種2周后,待各組裸鼠腫瘤長至直徑約5～10 mm,按10 mg/kg的劑量尾靜脈注射PTX,3 d 1次,共給藥6次[12]。末次給藥3 d后,由PE小動物活體成像儀拍攝并檢測腫瘤大小,然后采用深麻醉下頸椎脫臼法處死小鼠,并將瘤體剝離稱重。稱重后將瘤體研磨,一部分提取新鮮組織蛋白,檢測各組裸鼠瘤體內(nèi)NLRP3及ALDH1蛋白的表達情況;另一部分配制成單細胞懸液,檢測各組裸鼠瘤體內(nèi)CSCs百分比,方法同前。

1.10 統(tǒng)計學處理采用SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)處理。應用兩獨立樣本t檢驗比較KYSE150組細胞與KYSE150-N組細胞中NLRP3蛋白表達量的差異。應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較①Fn未感染組及Fn感染組(12、24、48與72 h)KYSE150細胞的PTX藥物IC50及NLRP3蛋白表達量的差異;②KYSE150組、KYSE150-N組、KYSE150+Fn組及KYSE150-N+Fn組細胞中NLRP3及ALDH1蛋白表達量、CSCs百分比、體外增殖能力、克隆成球能力、PTX 24 h藥物IC50及裸鼠成瘤能力的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 NLRP3敲降的KYSE150細胞系的建立見圖1。結果顯示,與KYSE150細胞(0.39±0.07)相比,KYSE150-N細胞中NLRP3蛋白表達量(0.14±0.03)降低(t=5.568,P=0.005),提示成功建立NLRP3敲降的KYSE150-N細胞系。

2.2 Fn感染對KYSE150細胞的PTX應答效力及NLRP3蛋白表達的影響見圖2、表1。由圖2、表1可知,各Fn感染組細胞的PTXIC50及NLRP3蛋白表達量均高于Fn未感染組,且兩指標隨Fn感染時間的延長而逐漸增高(P均<0.05)。

表1 各組細胞的PTX 24 h IC50及NLRP3蛋白表達的比較(n=3)

1:Fn未感染組;2:Fn感染12 h 組;3:Fn感染24 h組;4:Fn感染48 h組;5:Fn感染72 h組

2.3 Fn感染及NLRP3敲降對KYSE150細胞中NLRP3、ALDH1蛋白表達及CSCs百分比的影響見圖3和表2。與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組細胞的NLRP3、ALDH1蛋白表達量及CSCs百分比均增高(P均<0.05);而KYSE150-N組細胞上述指標均降低(P均<0.05)。與KYSE150+Fn組細胞相比,KYSE150-N+Fn組細胞上述指標均降低(P均<0.05)。

表2 各組細胞中NLRP3、ALDH1蛋白和CSCs百分比比較(n=3)

1:KYSE150組;2:KYSE150-N組;3:KYSE150+Fn組;4:KYSE150-N+Fn組

2.4 Fn感染及NLRP3敲降對KYSE150細胞體外增殖能力、克隆成球能力和PTX應答效力的影響見圖4、圖5和表3。與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組細胞的體外增殖能力、克隆成球能力及PTXIC50均增高(P均<0.05);而KYSE150-N組細胞上述指標均降低(P均<0.05)。與KYSE150+Fn組細胞相比,KYSE150-N+Fn組細胞上述指標均降低(P均<0.05)。

表3 各組細胞體外增殖能力、克隆成球能力和PTX IC50的比較 (n=3)

A:KYSE150組;B:KYSE150-N組;C:KYSE150+Fn組;D:KYSE150-N+Fn組

A:KYSE150組;B:KYSE150-N組;C:KYSE150+Fn組;D:KYSE150-N+Fn組

2.5 Fn感染及NLRP3敲降對裸鼠PTX化療敏感性的影響見表4。由表4可知,與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組裸鼠成瘤能力增強(P<0.05),而KYSE150-N組裸鼠成瘤能力減弱(P<0.05),提示此組裸鼠瘤體對PTX化療敏感性增強。與KYSE150+Fn組相比,KYSE150-N+Fn組裸鼠成瘤能力減弱(P<0.05),提示Fn感染并不能增強KYSE150-N+Fn組裸鼠對PTX化療的抗性。

表4 各組裸鼠腫瘤熒光強度和腫瘤質量比較(n=6)

2.6 各組裸鼠瘤體內(nèi)NLRP3、ALDH1蛋白表達及CSCs百分比的比較結果見圖6、表5。與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組裸鼠瘤體中NLRP3、ALDH1蛋白及CSCs百分比均增加(P均<0.05),而KYSE150-N組裸鼠瘤體中NLRP3、ALDH1蛋白及CSCs百分比減少(P均<0.05);與KYSE150+Fn組相比,KYSE150-N+Fn組裸鼠瘤體中NLRP3、ALDH1蛋白及CSCs百分比減少(P均<0.05)。

表5 各組裸鼠瘤體內(nèi)NLRP3、ALDH1蛋白表達及CSCs百分比的比較(n=6)

1:KYSE150組;2:KYSE150-N組;3:KYSE150+Fn組;4:KYSE150-N+Fn組

3 討論

化療為中晚期食管癌患者最主要的治療方式之一,其中PTX為最常用的一線化療藥物。PTX可促進微管蛋白聚合,使癌細胞生長停滯于有絲分裂期,從而有效抑制其惡性增殖;但多數(shù)患者治療后,均會產(chǎn)生不同程度耐藥,導致后續(xù)治療效果不理想[15]。因此,探明食管癌PTX 耐藥的分子機制對改進食管癌治療方案、提高臨床療效具有極其重要的意義。

研究表明,口腔條件致病菌Fn可通過多種途徑誘導腫瘤細胞化療抵抗,并促進其惡性增殖:Fn可通過激活結腸癌細胞中ANO1,導致結腸癌奧沙利鉑及5-氟尿嘧啶化療抵抗[16];Fn可通過上調Wnt5a介導的NFATc3促進口腔鱗癌細胞順鉑耐藥[17];Fn還可通過引發(fā)ESCC細胞自噬潮降低其對5-氟尿嘧啶、順鉑及紫杉醇的敏感性[18]。本團隊前期研究[1]已證實,Fn感染陽性的食管癌患者術后生存時間顯著縮短,且Fn感染可降低食管癌細胞對PTX的應答效力。本研究發(fā)現(xiàn),隨Fn感染時間的延長,PTXIC50升高,食管癌細胞KYSE150對PTX的應答效力逐漸減弱,提示Fn可誘導食管癌細胞PTX耐藥,但耐藥的具體分子機制尚不完全明確。

宿主抵抗病原微生物入侵的第一道保護屏障為機體的固有免疫系統(tǒng),其主要成分為炎癥復合體。NLRP3炎癥小體是炎癥復合體中最具特征性的多聚體蛋白復合體,可識別多種病原微生物,活化Caspase-1以介導IL-1β和IL-18等促炎因子釋放到胞外,從而調節(jié)免疫應答并引起炎癥反應[19]。病原微生物的持續(xù)感染可激活NLRP3炎癥小體,參與多種腫瘤的惡性演進:牙齦卟啉單胞菌可通過活化造血NLRP3炎癥小體,招募骨髓細胞,重塑促炎性腫瘤微環(huán)境,誘導結直腸癌的發(fā)生發(fā)展[20];EB病毒可介導宿主細胞中NLRP3蛋白與高遷移率族蛋白B1結合,維持自身裂解信號,促進伯基特淋巴瘤的惡性進展[21]。本研究發(fā)現(xiàn),隨Fn感染時間的延長,食管癌細胞KYSE150中NLRP3蛋白表達量逐漸增高,提示Fn可誘導食管癌細胞中NLRP3高表達,且具有時間依賴性。

資料顯示,抑制NLRP3炎癥小體的過度激活可增強多種惡性腫瘤對化療藥物的應答效力:抑制非小細胞肺癌中NLRP3活性,可重新激活順鉑誘導的細胞焦亡,增強癌細胞對順鉑的敏感性[22];阻斷口腔鱗癌中NLRP3信號通路,可減弱5-氟尿嘧啶誘導的干性富集,增強其治療效果[23]。由于CSCs可無限增殖、多向分化,且可抵抗常規(guī)放化療,因此被認為是腫瘤耐藥、復發(fā)和轉移的根源[24]。CSCs的分選已成為腫瘤治療的關鍵。研究[10]已證實,ALDH1是食管癌優(yōu)選的CSCs標志物,參與基因表達、組織分化和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等功能。本研究發(fā)現(xiàn),Fn感染可引起KYSE150+Fn組細胞中ALDH1蛋白及CSCs百分比均顯著增高,提示Fn可誘導食管癌細胞中ALDH1蛋白高表達,引起CSCs大量富集。為探索NLRP3在Fn致病機制中發(fā)揮的作用,本研究建立NLRP3敲降的KYSE150-N細胞系,發(fā)現(xiàn)NLRP3敲降時,KYSE150-N組細胞中ALDH1蛋白及CSCs百分比均隨之減少。而Fn感染NLRP3敲降的KYSE150-N+Fn組細胞時,并不能引起ALDH1蛋白及CSCs百分比增高,提示NLRP3為食管癌細胞中Fn誘導CSCs富集過程中的關鍵調控因子。本研究還發(fā)現(xiàn),Fn感染時,KYSE150+Fn組細胞的體外增殖能力、克隆成球能力及PTXIC50均顯著增高,提示Fn可增強食管癌細胞的干細胞樣特性,并降低其對PTX的敏感性。NLRP3敲降后,KYSE150-N組上述指標均隨之降低,提示食管癌細胞中NLRP3的激活與干細胞樣特性的維持密切相關。而Fn感染NLRP3敲降的KYSE150-N+Fn組細胞時,并不能引起其上述指標增高,提示NLRP3在Fn誘導的食管癌細胞干細胞樣特性增強及PTX化療抵抗過程中發(fā)揮重要作用。

本研究的裸鼠皮下荷瘤實驗結果顯示,與KYSE150組相比,KYSE150+Fn組裸鼠成瘤能力及瘤體內(nèi)NLRP3、ALDH1蛋白與CSCs百分比均增高,提示Fn可通過激活NLRP3誘導食管癌細胞ALDH1高表達,引起CSCs大量富集,導致PTX治療抵抗;而KYSE150-N組裸鼠上述指標均降低,提示NLRP3的敲降可抑制食管癌細胞ALDH1表達,導致CSCs減少,對PTX治療的敏感性增強。與KYSE150+Fn組相比,KYSE150-N+Fn組裸鼠成瘤能力及瘤體內(nèi)NLRP3、ALDH1蛋白與CSCs百分比均減少,提示NLRP3的敲降阻斷了Fn引起的PTX化療抵抗,表明NLRP3為食管癌細胞中Fn感染引起的PTX化療抵抗中的關鍵調控因子。

綜上所述,Fn可通過激活NLRP3誘導食管癌細胞ALDH1高表達,引起CSCs大量富集,導致PTX化療抵抗,最終促進食管癌細胞惡性增殖。有效清除Fn并抑制NLRP3的活性可能為食管癌治療提供新策略和治療手段。