張家豪,劉怡文,何珂瑤,張哲源,李若楠,龍情柔,孫 蔚,孔金玉,楊海軍,周福有

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院胸外科 河南新鄉(xiāng) 453003 2)河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院;河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院;河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;河南省微生態(tài)與食管癌防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南洛陽(yáng) 471003 3)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院病理科 河南安陽(yáng) 455000 4)安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院胸外科;河南省食管癌精準(zhǔn)防治醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南安陽(yáng) 455000

食管癌發(fā)病率和死亡率極高,我國(guó)以食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)為主,ESCC病因至今尚未完全明確[1]。作者所在團(tuán)隊(duì)[2-3]已證實(shí),ESCC組織中具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)定植率約為40%,且Fn感染陽(yáng)性的ESCC患者生存期顯著縮短;Fn長(zhǎng)期定植不僅可激活癌細(xì)胞中炎癥相關(guān)信號(hào)通路,還可重塑免疫微環(huán)境,誘導(dǎo)癌細(xì)胞免疫逃逸。

吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)為色氨酸分解代謝的關(guān)鍵限速酶,其過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致色氨酸耗竭,使免疫微環(huán)境中正向調(diào)節(jié)的T細(xì)胞增殖及活化受阻,導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤免疫失能[4-5]。幽門(mén)螺桿菌、乙肝病毒及人乳頭瘤病毒均可通過(guò)激活I(lǐng)DO,抑制具有殺傷功能的CD8+T細(xì)胞的增殖及活化,協(xié)助癌細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視,促進(jìn)胃癌、肝癌及宮頸癌的惡性增殖及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6-8]。

本研究初步分析了Fn感染對(duì)ESCC細(xì)胞中IDO蛋白表達(dá)及CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的影響,并分析Fn感染與ESCC預(yù)后的關(guān)系,為ESCC病因?qū)W研究及臨床防治策略的制定提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器ESCC細(xì)胞系KYSE140、KYSE150及Fn菌株ATCC 25586為作者所在實(shí)驗(yàn)室凍存,健康人外周血來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室志愿者;Ficoll-paque分離液(美國(guó)GE公司),磁珠分選試劑盒、hIL-2、hIL-7-Fc、TexMACS培養(yǎng)基(美國(guó)Miltenyi公司),細(xì)胞內(nèi)固定與透化緩沖液套件、熒光標(biāo)記抗體IDO-PE及羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(美國(guó)eBioscienceTM公司),IDO抑制劑(美國(guó)Selleckchem公司),RNAscope試劑盒及Fn特異性探針(美國(guó)ACD公司),IDO及CD8兔抗人單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司),免疫組化試劑盒(中國(guó)ZSGB-BIO公司),檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、DAB顯色液(中國(guó)Solarbio公司);厭氧工作站(美國(guó)COY公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司)。

1.2 Fn感染后ESCC細(xì)胞中IDO表達(dá)的檢測(cè)厭氧工作站中常規(guī)培養(yǎng)Fn;培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)KYSE140、KYSE150細(xì)胞[2-3]。待ESCC細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%融合度時(shí),收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Fn加入細(xì)胞培養(yǎng)基(感染復(fù)數(shù)MOI=10),分別感染24、48、72 h。設(shè)未感染Fn的細(xì)胞為對(duì)照。采用細(xì)胞內(nèi)固定與透化緩沖液套件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定及破膜后,加IDO-PE孵育30 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中IDO表達(dá)量,以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。采用Summit 5.3軟件分析數(shù)據(jù),具體步驟參考說(shuō)明書(shū)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 與ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)后CD8+T細(xì)胞增殖率的檢測(cè)取健康人外周血于抗凝管,用生理鹽水按體積比1∶1稀釋后,緩慢鋪于適量Ficoll-paque分離液表面。800×g離心20 min,分層后吸取白膜層,800×g離心5 min,沉淀為人外周血單個(gè)核細(xì)胞。采用磁珠分選試劑盒從中分選出CD8+T細(xì)胞,于含hIL-2(50 U/mL)、hIL-7-Fc(70 μg/L)的TexMACS培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)。

常規(guī)培養(yǎng)KYSE140及KYSE150細(xì)胞,待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)70%融合度時(shí),用CFSE(濃度為1 μmol/L)標(biāo)記CD8+T細(xì)胞,并按細(xì)胞數(shù)之比10∶1的比例將標(biāo)記后的CD8+T細(xì)胞加入KYSE140或KYSE150細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)。具體步驟參考說(shuō)明書(shū)及本課題組前期研究[3]。KYSE140及KYSE150共培養(yǎng)體系均分為4組:對(duì)照組、Fn組、IDO抑制劑組及Fn+IDO抑制劑組。按分組感染Fn(感染復(fù)數(shù)MOI=10)、加入IDO抑制劑(濃度為1 μmol/L)[9]分別培養(yǎng)24、48及72 h,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)共培養(yǎng)體系中CD8+T細(xì)胞的增殖情況。采用Summit 5.3軟件分析數(shù)據(jù),CD8+T細(xì)胞增殖率以熒光強(qiáng)度減弱細(xì)胞百分比表示,具體步驟參考說(shuō)明書(shū)及本課題組前期研究[3]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 ESCC組織Fn感染、IDO表達(dá)及CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)情況的檢測(cè)

1.4.1標(biāo)本來(lái)源 選取2015年1月至2017年1月安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的ESCC患者癌組織石蠟包埋標(biāo)本為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)后病理診斷明確為ESCC,未合并其他腫瘤;術(shù)前未接受放、化療和免疫治療;臨床資料齊全。最終納入243例ESCC患者。243例中男166例,女77例;<60歲78例;146例有吸煙史;142例有飲酒史;低分化61例,中高分化182例;侵及外膜187例,未侵及外膜56例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移163例;TNM分期Ⅰ/Ⅱ期92例,Ⅲ/Ⅳ期151例。本研究獲安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2022WZ16K01)。

1.4.2Fn感染的檢測(cè) 取石蠟包埋的ESCC組織病理切片(片厚2 μm),經(jīng)脫蠟及水化后,采用RNAscope試劑盒中的靶標(biāo)修復(fù)液修復(fù)、雙氧水處理及蛋白酶孵育,加Fn特異性探針4 ℃孵育過(guò)夜,用RNAscope顯色劑顯色[3]。結(jié)果判定:細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)紅色顆粒為Fn rRNA陽(yáng)性;單個(gè)細(xì)胞中單獨(dú)的紅色顆?！?個(gè)為Fn陽(yáng)性細(xì)胞;陽(yáng)性細(xì)胞占比≥30%為Fn感染陽(yáng)性樣本。陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及評(píng)分細(xì)則見(jiàn)本課題組前期研究[2-3]。

1.4.3IDO表達(dá)及CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)情況的檢測(cè) 取2張同批常規(guī)石蠟包埋的ESCC組織連續(xù)切片(片厚2.5 μm),經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后,采用免疫組化試劑盒中的過(guò)氧化物酶阻斷劑及山羊血清封閉。分別加入IDO及CD8抗體(按1∶500稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜,經(jīng)山羊抗兔聚合物及SP孵育后,DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判讀:IDO陽(yáng)性細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞為胞質(zhì)及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照本課題組前期研究[3]及參考文獻(xiàn)[10]。

1.5 隨訪(fǎng)從患者確診開(kāi)始隨訪(fǎng),截至2022年1月。患者出院后,安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院隨訪(fǎng)中心每1個(gè)月電話(huà)聯(lián)系一次患者或家屬直至隨訪(fǎng)結(jié)束。以死亡為終點(diǎn)事件。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad 5.0及SPSS 26.0處理數(shù)據(jù)。采用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較Fn感染與未感染ESCC細(xì)胞中IDO表達(dá)的差異及各共培養(yǎng)體系中CD8+T細(xì)胞增殖率的差異。采用Kappa系數(shù)分析ESCC組織中Fn感染與IDO表達(dá)的一致性,采用χ2檢驗(yàn)分析Fn感染及IDO表達(dá)與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)。采用Kaplan-Meier法繪制Fn感染與未感染者的生存曲線(xiàn)并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。采用Cox回歸分析Fn感染對(duì)ESCC患者預(yù)后的影響。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Fn感染對(duì)ESCC細(xì)胞中IDO表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知,Fn感染可誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中IDO高表達(dá),且具有時(shí)間依賴(lài)性。

表1 各組ESCC細(xì)胞中IDO表達(dá)的比較(n=3)

2.2 Fn感染及IDO抑制劑對(duì)共培養(yǎng)體系中CD8+T細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,Fn感染可抑制共培養(yǎng)體系中CD8+T細(xì)胞增殖,IDO抑制劑則促進(jìn)增殖,二者聯(lián)用有拮抗作用,且作用具有時(shí)間依賴(lài)性。

2.3 ESCC組織中Fn感染、IDO表達(dá)及CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)性結(jié)果見(jiàn)圖1,表3、4。ESCC組織中Fn感染及IDO表達(dá)具有一致性,而二者均與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)關(guān)聯(lián)。

上排:陽(yáng)性樣本;下排:陰性樣本;A、D:RNAscope法;B、C、E、F:SP法

表3 ESCC組織中Fn感染與IDO表達(dá)的一致性分析 例

表4 ESCC組織中Fn感染及IDO表達(dá)與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)聯(lián)性分析 例

2.4 Fn感染對(duì)ESCC患者預(yù)后的影響243例隨訪(fǎng)3～60個(gè)月,中位隨訪(fǎng)時(shí)間32個(gè)月;截至2022年1月,仍存活59例。

Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示Fn感染患者預(yù)后較差(χ2=27.500,P<0.001)(圖2)。

圖2 Fn陽(yáng)性組與陰性組ESCC患者的Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)

以性別(女為對(duì)照)、年齡(<60歲為對(duì)照)、吸煙、飲酒為調(diào)整因素,采用Cox回歸分析Fn感染對(duì)ESCC患者生存的影響,結(jié)果(表5)顯示,Fn感染影響ESCC患者的預(yù)后。

表5 Fn感染對(duì)ESCC患者生存影響的Cox回歸分析

3 討論

資料[11]顯示,病原微生物可通過(guò)重塑腫瘤免疫微環(huán)境,削弱機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。作者所在團(tuán)隊(duì)前期研究[2-3]發(fā)現(xiàn),Fn感染與ESCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。IDO是介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵檢查點(diǎn)分子,為色氨酸代謝過(guò)程中的限速酶,其異常激活可引起T細(xì)胞活化增殖所必需的色氨酸分解耗竭,抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),且色氨酸代謝物也可抑制T細(xì)胞及NK細(xì)胞增殖,進(jìn)一步加重機(jī)體的免疫抑制[12]。人乳頭瘤病毒、乙肝病毒及人類(lèi)皰疹病毒均可誘導(dǎo)癌細(xì)胞高表達(dá)IDO,招募調(diào)節(jié)性T細(xì)胞并阻礙CD8+T細(xì)胞增殖及活化,抑制免疫反應(yīng),促進(jìn)宮頸癌、肝癌及口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn),隨Fn感染時(shí)間的延長(zhǎng),ESCC細(xì)胞中IDO表達(dá)逐漸增強(qiáng),表明Fn感染可誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中IDO高表達(dá),且具有時(shí)間依賴(lài)性。我們建立了人CD8+T細(xì)胞與ESCC細(xì)胞共培養(yǎng)體系模擬腫瘤微環(huán)境,結(jié)果表明Fn感染可抑制共培養(yǎng)體系中CD8+T細(xì)胞增殖,IDO抑制劑則可促進(jìn)增殖,而Fn+IDO抑制劑組細(xì)胞增殖率升高,表明抑制IDO的活性可阻斷Fn對(duì)CD8+T細(xì)胞的負(fù)性調(diào)控作用,也提示IDO抑制劑使用的情況下,Fn對(duì)共培養(yǎng)體系中CD8+T細(xì)胞增殖仍有一定抑制作用。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn),243例ESCC組織中Fn感染及IDO表達(dá)具有一致性,而二者均與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)呈負(fù)關(guān)聯(lián)。Fn感染的患者中位生存時(shí)間更短,Fn感染增加了ESCC患者死亡的風(fēng)險(xiǎn),提示有效清除Fn對(duì)延長(zhǎng)ESCC患者生存期具有重要意義。

綜上所述,Fn可能通過(guò)誘導(dǎo)IDO表達(dá),抑制CD8+T細(xì)胞增殖,削弱機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng),促進(jìn)ESCC惡性演變。由于病原微生物感染與腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程,Fn對(duì)ESCC免疫微環(huán)境的重塑機(jī)制仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。