唐忠林，張佳佳，周國勤，強(qiáng) 俊，徐 跑，徐鋼春，王佩佩，慶 輝

(1.南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，南京 210036；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214000)

目前，國內(nèi)養(yǎng)殖的大口黑鱸(Micropterussalmoides)主要包括優(yōu)鱸1號、優(yōu)鱸3號和未選育的普通鱸，同時研究表明，由于多代選育，國內(nèi)養(yǎng)殖群體的多態(tài)位點比例和遺傳多樣性均有所下降[9]，這使得大口黑鱸種質(zhì)資源弱化，可能會引起病害等相關(guān)的養(yǎng)殖問題，因此有必要通過引進(jìn)其他遺傳多樣性高、遺傳改良潛力大的群體作為補(bǔ)充來改良我國大口黑鱸種質(zhì)。鑒于此，南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所聯(lián)合中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心2019年從美國引進(jìn)大口黑鱸北方亞種原種。有報道稱未進(jìn)行過選擇育種的加州原種可能存在遺傳瓶頸，易導(dǎo)致遺傳多樣性降低[9]，因此要對引進(jìn)種進(jìn)行選育，來保持遺傳多樣性的穩(wěn)定。在開展選育工作之前十分有必要了解加州原種子代對養(yǎng)殖水體環(huán)境的要求，以及對氨氮的耐受能力。因此，本試驗通過探究在急性氨氮脅迫下大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代(簡稱“引進(jìn)種F1代”)一些生物指標(biāo)的變化，旨在綜合分析氨氮對該品種的毒理作用，為苗種生產(chǎn)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚體質(zhì)量(12.51±0.91)g、體長(9.03±0.34)cm，是南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所自2019年從美國引入的北方亞種原種繁育所得。將實驗用魚暫養(yǎng)于有生物過濾水再循環(huán)系統(tǒng)(配備有冷卻和加熱功能，流速為5 L/min，光照時間為14 h)的水族箱中。每天投喂兩次(8：00～9：00和20：00～21：00)江蘇南京帥豐飼料有限公司大口黑鱸配合飼料。整個暫養(yǎng)和實驗期間水中溶氧高于6.5 mg/L，氨氮與亞硝酸鹽低于0.01 mg/L，水溫為27 ℃，實驗前禁食24 h，實驗期間不投喂。

1.2 氨氮脅迫 96 h LC50 實驗

采用96 h靜水式試驗法對北方亞種引進(jìn)種F1代進(jìn)行氨氮毒性預(yù)試驗。用干燥分析純晶體NH4Cl配制不同濃度的氨氮溶液，確定24 h未見死亡的最大氨氮濃度(20 mg/L)和全部死亡的最小氨氮濃度(40 mg/L)。

再根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果以等對數(shù)間距設(shè)置正式試驗的7組氨氮濃度(0、20.98、23.71、26.79、30.27、34.21、38.65 mg/L)，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，每組放入20尾魚苗，分別記錄24、48、72和96 h死亡尾數(shù)，試驗期間24 h換水一次，保持溶氧高于6 mg/L，pH為7.3，水溫為28 ℃。

1.3 氨氮脅迫實驗

依據(jù)氨氮脅迫96 h LC50，設(shè)置對照組(0 mg/L)與實驗組(18 mg/L)，實驗組與對照組設(shè)置3個重復(fù)，選取體質(zhì)量相近、活性良好的幼魚60 尾隨機(jī)放置于3個養(yǎng)殖桶中(80 L)，每桶20尾。分別于脅迫后第0、6、12、24、48和 96 h在每個濃度組中隨機(jī)取樣。每次每個重復(fù)隨機(jī)取2尾魚麻醉后解剖，迅速取出腦、鰓和肝組織置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 組織酶活性檢測

分別于脅迫后第0、6、12、24、48和 96 h在每個濃度組中隨機(jī)取3尾魚，取鰓組織0.1 g加入0.9 mL的生理鹽水，冰水浴勻漿，2 500 r/min 離心10 min取上清液，按照說明書測定蛋白濃度、Na+/K+-ATP酶。試劑盒均采自南京建成生物工程研究所。

1.5 組織RNA的提取與 cDNA的合成

組織RNA的提取采用高純總RNA快速抽提試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，RP1202)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量(電壓120 V，電流165 mA，時間25 min)，用Nanodrop 檢測 RNA 的純度(OD260 nm/260)和濃度。根據(jù)HiScript?Reverse Transcriptase的說明(Vazyme，R123-01)進(jìn)行第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄。

1.6 熒光定量PCR

參考陸健等[10]引物序列(詳見表1)。用SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)試劑盒(Vazyme，Q341-02/03)在ABI熒光定量PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2 μL cDNA模板(5 ng/μL)，4 μL的上、下游引物(10 μmol/L)，10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95 ℃，10 min；40個循環(huán)反應(yīng)(95 ℃，10 s；58 ℃，60 s)。每個樣品重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

非離子氨的計算公式如下：

NH3=TAN/[1+10(pKa-pH)]

pKa=0.090 18+2 729.92/T(T=273+t，T為開氏溫度，t為實驗時水溫)

安全質(zhì)量濃度(SC)=96 h LC50/10

通過SPSS 25.0軟件的分析—回歸—Probit分別計算得出24、48、72和96 h的LC50。實時熒光定量PCR分析后的實驗結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。實驗所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 25.0統(tǒng)計分析。利用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比較檢驗對同一時間不同濃度組間，以及同一濃度不同時間進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和檢驗分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，用Origin 8.6繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮對引進(jìn)種F1代幼魚的急性毒性影響

氨氮對引進(jìn)種F1代幼魚的急性毒性結(jié)果見表2。在相同的氨氮濃度下，幼魚死亡率隨氨氮脅迫時間的延長而升高；在相同的氨氮脅迫時間下，幼魚死亡率隨水體中氨氮濃度的升高而升高。經(jīng)96 h氨氮脅迫后，20.98 mg/L和23.71 mg/L兩組的死亡率低于50%，其余組的死亡率均高于50%，其中34.21 mg/L和38.65 mg/L組的試驗魚全部死亡。

表2 不同氨氮濃度脅迫對大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚死亡率的影響Tab.2 Effects of different ammonia nitrogen concentrations on the mortality for the introduction of M.salmoides F1 juvenile

通過回歸分析得出引進(jìn)種F1代幼魚24、48、72、96 h的半致死濃度分別為33.66、29.86、26.98、25.08 mg/L；非離子氨半致死濃度分別為0.46、0.41、0.37和0.34 mg/L。氨氮安全濃度為2.51 mg/L，非離子氨的安全濃度是0.034 mg/L。

2.2 氨氮脅迫對引進(jìn)種F1代幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶活力的影響

由圖1可知，與對照組相比，氨氮脅迫后鰓組織中Na+/K+-ATP酶呈先降低再升高的變化趨勢，脅迫12 h時達(dá)到最低值，且與對照組差異顯著。隨后開始上升，脅迫48 h時達(dá)到最高值，且與對照組差異顯著，為對照組的2.22倍。脅迫96 h時又恢復(fù)至對照組水平。

圖1 氨氮脅迫對大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶的影響Fig.1 Effects of ammonia-N stress on the Na+/K+-ATPase in gills for the introduction of M.salmoides F1 juvenile不同字母表示不同時間的數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05)；*表示與對照組同一時間數(shù)據(jù)有顯著性差異(*：P<0.05，**：P<0.01)；后同此。

2.3 氨氮脅迫對引進(jìn)種F1代幼魚hsp70基因表達(dá)的影響

由圖2和圖3可知，與對照組相比，氨氮脅迫后肝和鰓組織中hsp70 mRNA表達(dá)量均呈先升高再降低的變化趨勢，都在脅迫6 h時達(dá)到最大值，分別為對照組的2.52和7.48倍，且與對照組差異顯著，隨后開始下降，肝組織hsp70 mRNA表達(dá)量在脅迫24 h時降至對照組水平；而鰓組織在脅迫24 h時仍顯著高于對照組。48～96 h脅迫組肝和鰓組織hsp70 mRNA表達(dá)量均顯著低于對照組。由圖4可知，與對照組相比，氨氮脅迫后腦組織中hsp70 mRNA表達(dá)量在0 h時表達(dá)量最高，并隨著時間的延長持續(xù)下降，在脅迫6 h時就顯著低于對照組，直到脅迫24 h以后無顯著降低。

圖2 氨氮脅迫對大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚肝組織hsp70mRNA相對表達(dá)的影響Fig.2 The effects of ammonia-N stress on the relative expression of hsp70 mRNA in livers for introduction of M.salmoides F1 juvenile

圖3 氨氮脅迫對大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚鰓組織hsp70 mRNA相對表達(dá)的影響Fig.3 The effects of ammonia-N stress on the relative expression of hsp70 mRNA in gills for introduction of M.salmoides F1 juvenile

圖4 氨氮脅迫對大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚腦組織hsp70 mRNA相對表達(dá)的影響Fig.4 The effects of ammonia-N stress on relative expression of hsp70 mRNA in brains for introduction of M.salmoides F1 juvenile

3 討論

3.1 氨氮對引進(jìn)種F1代幼魚的急性毒性影響

目前有關(guān)氨氮對水產(chǎn)魚類毒性作用的研究較多，本試驗結(jié)果顯示，氨氮對大口黑鱸美國原種幼魚的急性毒性與氨氮濃度和脅迫時間呈線性關(guān)系，隨氨氮濃度提升幼魚死亡率急劇上升，死亡時間縮短，這與大多數(shù)魚類的結(jié)果一致[11-13]。在本試驗條件(溶氧>6 mg/L，pH=7.3，水溫28 ℃)下，大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代對氨氮的安全濃度為2.51 mg/L，高于鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)幼魚(0.033 mg/L)[14]、鱖(Sinipercachuatsi)幼魚(0.013 mg/L)[12]、金魚(Carassiusauratus)(0.028 mg/L)[15]，低于草魚(Ctenopharyngodonidella)(0.096 mg/L)[16]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(0.327 mg/L)[17]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)(0.074 mg/L)[18]等大多數(shù)魚類，這表明種類不同的魚對氨氮耐受力有差異。同時，鄭洪武[19]的實驗表明，在水溫 21 ℃、溶解氧 8.0 mg/L、pH 7.9的條件下，體質(zhì)量為20.02 g的大口黑鱸氨氮安全濃度為6.33 mg/L，高于本實驗結(jié)果，與本實驗結(jié)果不同的原因可能是魚體大小不同，也可能是國內(nèi)養(yǎng)殖的大多數(shù)大口黑鱸經(jīng)過長期人工養(yǎng)殖馴化已能適應(yīng)肥沃水質(zhì)，其對氨氮的耐受力明顯增強(qiáng)，而大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代還未經(jīng)過馴化，暫不能適應(yīng)國內(nèi)養(yǎng)殖水體環(huán)境中較高的氨氮濃度[19]。這提示我們在大口黑鱸引進(jìn)種的養(yǎng)殖馴化中要格外關(guān)注水體中氨氮含量。同時研究也表明，水體中氨氮毒性會受到水溫、pH、溶解氧和鹽度等因素的影響，本試驗條件下，水體溫度的增加，水體中有毒的非離子氨所占的比例提高，導(dǎo)致水體氨氮毒性增強(qiáng)，魚體對氨氮的安全濃度降低[20-21]。這也提示廣大養(yǎng)殖戶在高密度養(yǎng)殖的過程中不僅要實時監(jiān)測水體中的氨氮濃度，還要及時監(jiān)測水體 pH，尤其在高溫天氣要及時采取換水降溫、調(diào)節(jié) pH 及曝氣等措施緊急緩解毒性，從而減少經(jīng)濟(jì)損失。

3.2 氨氮脅迫對引進(jìn)種F1代幼魚鰓組織Na+/K+-ATP酶活力的影響

3.3 氨氮脅迫對引進(jìn)種F1代幼魚hsp70基因表達(dá)的影響

熱應(yīng)激蛋白(HSPs)是機(jī)體細(xì)胞受環(huán)境刺激誘導(dǎo)而產(chǎn)生的具有高度保守性的一組重要的非特異性細(xì)胞保護(hù)性蛋白[27]。大量的研究表明HSPs家族基因廣泛參與魚類應(yīng)激調(diào)控機(jī)制，當(dāng)暴露于環(huán)境應(yīng)激中，機(jī)體通過激活熱休克基因合成HSPs[28]。因此，HSPs被作為魚類養(yǎng)殖中檢測應(yīng)激程度、應(yīng)激能力的分子標(biāo)記[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫后大口黑鱸北方亞種F1代幼魚肝和鰓組織中hsp70基因的mRNA表達(dá)量均在6 h后呈現(xiàn)出顯著上升趨勢，且達(dá)到峰值，表明hsp70基因在氨氮脅迫時可以快速做出應(yīng)答，通過增加機(jī)體hsp70基因的表達(dá)水平從而減少H2O2對細(xì)胞膜造成的損傷，以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用[30]。孫麗穎等[31]對急性氨氮脅迫下黃顙魚幼魚HSPs基因表達(dá)變化的檢測中也獲得了類似的結(jié)果。同時，鄭洪武[19]和楊斯琪[32]用28.5 mg/L和38 mg/L濃度的氨氮脅迫普通大口黑鱸，各個組織中T-SOD、T-AOC、CAT、GSH-Px活性在脅迫初期均有顯著升高，印證了氨氮脅迫后會激活體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)來清除體內(nèi)的自由基。但是，本試驗中經(jīng)過氨氮脅迫大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚腦組織中hsp70基因的mRNA表達(dá)量于脅迫發(fā)生后均迅速降低，原因可能是大量的氨氮進(jìn)入體內(nèi)，導(dǎo)致谷氨酰胺在體內(nèi)過量積累，使神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫大，引發(fā)腦水腫對腦組織造成了損傷[33]，影響到hsp70基因的轉(zhuǎn)錄。但隨著脅迫時間的延長，肝、腦、鰓組織中hsp70 mRNA表達(dá)量均呈現(xiàn)出下降趨勢，這可能是氨氮脅迫持續(xù)一定時間，對魚類的機(jī)體造成了氧化損傷和組織損傷，從而破壞了細(xì)胞的功能，致使hsp70修復(fù)受損DNA和蛋白的能力減弱，變性的蛋白在體內(nèi)累積，影響正常細(xì)胞的代謝能力[34]。同樣的，鄭洪武[19]的研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫7 d后，大口黑鱸的肝細(xì)胞大面積壞死，肝組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重；鰓絲毛細(xì)血管破碎，血細(xì)胞漫出，鰓腔內(nèi)充血嚴(yán)重，鰓小片結(jié)構(gòu)消失，這也充分說明機(jī)體對氨氮脅迫的調(diào)節(jié)是有限的。

4 結(jié)論

本研究初步表明，在溶氧>6 mg/L，pH=7.3，水溫28 ℃的試驗條件下，大口黑鱸北方亞種引進(jìn)種F1代幼魚的氨氮安全濃度為2.51 mg/L。18 mg/L的氨氮脅迫會對其造成一定應(yīng)激損傷，在短時間內(nèi)可以進(jìn)行自我調(diào)節(jié)和修復(fù)，脅迫時間過長會造成機(jī)體的氧化損傷和組織損傷，表現(xiàn)在組織中hsp70mRNA 表達(dá)量低于對照組水平。