鄒俊 李俊杰 程芳芳 汪浙炯

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性炎癥性疾病，在亞洲的發(fā)病率高于克羅恩?。╟rohn’sdisease，CD），不斷增加的發(fā)病率給衛(wèi)生保健系統(tǒng)帶來重大挑戰(zhàn)［1］。腸道菌群紊亂、短鏈脂肪酸（SCFAs）等代謝產(chǎn)物異常，以及免疫系統(tǒng)障礙等的相互作用影響UC的發(fā)生和發(fā)展［2］。30%～50%的UC患者疾病局限于直腸或乙狀結(jié)腸（遠(yuǎn)端結(jié)腸炎），20%～30%為左側(cè)結(jié)腸炎，20%為全結(jié)腸炎。在遠(yuǎn)端結(jié)腸炎患者中，25%～50%隨著時間的推移發(fā)展為更廣泛的疾病形式，甚至結(jié)直腸癌［3］。目前UC的臨床治療藥物使用存在易耐藥及復(fù)發(fā)等問題［4］，需尋找安全有效的藥物。姜黃素是一種廣泛存在于天然草藥中的多酚，具有抗炎、抗痛、抗氧化和抗腫瘤的作用［5-6］。臨床研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對輕度至中度UC治療具有良好的安全性［7］。姜黃素經(jīng)過腸道內(nèi)細(xì)菌酶的修飾，重塑腸道微生物結(jié)構(gòu)組成，影響炎性細(xì)胞因子的表達(dá)［8］，促進(jìn)黏膜損傷修復(fù)［9］。本研究通過觀察小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)、腸道微生物組成和多樣性、糞便代謝組學(xué)以及結(jié)腸內(nèi)促炎因子和抑炎因子的表達(dá)量變化及進(jìn)行相關(guān)性分析，探索姜黃素是否通過重塑腸道微生物環(huán)境治療UC小鼠的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡雄性C57BL/6小鼠30只，購買及飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心，環(huán)境溫度24℃±2℃、濕度55%±10%、光照/黑暗周期為12 h，小鼠自由飲用食物和水。

1.2 主要試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉（DSS，36,000～50,000 Da，MP Biomedicals，美國）；姜黃素（Sigma-Aldrich，美國）；糞便基因組RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］；Bruker 600-MHz AVANCE Ⅲ核磁共振檢測儀（Bruker，德國）；ELISA試劑盒購自上海泛柯實業(yè)有限公司。

1.3 UC模型建立及姜黃素干預(yù) 適養(yǎng)1周后，小鼠隨機(jī)分為三組（n=10/組）：空白對照組（CON）、DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎組（DSS）和姜黃素治療組（DSS+CUR）。DSS組和DSS+CUR組小鼠連續(xù)8 d自由飲用2%的DSS溶液，DSS+CUR組小鼠灌胃姜黃素劑量為100 mg/（kg·d），DSS組給予等劑量磷酸鹽緩沖液。

1.4 疾病活動指數(shù)（Disease activity index，DAI）評估 每天根據(jù)小鼠體質(zhì)量、糞便粘稠度和有無血便，計算DAI。評分標(biāo)準(zhǔn)：0=無體質(zhì)量減輕，糞便中無隱血，糞便稠度正常；1=體質(zhì)量減輕為總體質(zhì)量的1%～5%；2=體質(zhì)量減輕為總體質(zhì)量的＞5%～10%，糞便隱血陽性，糞便稀?。?=體質(zhì)量減輕為總體質(zhì)量的＞10%～20%；4=體質(zhì)量減輕＞總體質(zhì)量的20%，嚴(yán)重出血和腹瀉。

1.5 結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（colonic mucosa damageindex，CMDI）評估 肉眼觀察結(jié)腸病變組織腸黏膜形態(tài)，并參考文獻(xiàn)進(jìn)行結(jié)腸黏膜大體形態(tài)損傷指數(shù)評分［10］。

1.6 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 小鼠結(jié)腸組織用4%多聚甲醛固定，酒精梯度脫水、石蠟包埋，用蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色結(jié)腸組織切片，通過光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)腸組織形態(tài)。

1.7 16S rDNA 擴(kuò)增子測序和分析 使用E.Z.N.A.?StoolDNAKit（TIANGEN，中國）提取糞便的DNA。原始數(shù)據(jù)由Cutadapt1.9過濾及FLASH1.2.8處理。使用DADA2和QIIME2構(gòu)建操作分類單位（OTU）并進(jìn)行去噪處理。通過SILVA和NT-16S數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋和分析。

1.8 1H-NMR代謝組學(xué)檢測和分析 解凍100 mg糞便，與0.8 mL的PBS（內(nèi)含的重水99.8%和0.05 mM的3-三甲基硅基丙酸鈉-d4）混合，裂解、離心后收集500μL上清液用Bruker600-MHzAVANCEⅢ核磁共振檢測儀進(jìn)行分析。用MestReNova14.2（MestrelabResearchSL，西班牙）以TSP的化學(xué)位移δ0.00為標(biāo)準(zhǔn)對譜圖進(jìn)行校正并進(jìn)行相位、基線調(diào)整。模型驗證使用SIMCA14.2。

1.9 小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞因子表達(dá)水平檢測 用ELISA檢測試劑盒測定結(jié)腸組織中IL-10、IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)水平，檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行。計量資料以（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗。Wilcoxon和Kruskal-Wallis秩和檢驗用于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對于UC小鼠疾病活動指數(shù)的影響 如圖1所示，DSS組小鼠的DAI評分從第4天開始明顯高于CON組（P＜0.0001）。姜黃素干預(yù)第4天開始，DSS+CUR小鼠的腹瀉、血便癥狀及體質(zhì)量下降情況較DSS組明顯改善（P＜0.05）。但整體DAI評分較CON組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 姜黃素對于UC小鼠疾病活動指數(shù)的影響。與DSS模型組比較，****P＜0.0001；與姜黃素治療組比較，#P＜0.05，####P＜0.0001

2.2 小鼠結(jié)腸長度變化和結(jié)腸組織大體形態(tài)損傷指數(shù) DSS組小鼠的結(jié)腸長度較CON組明顯縮短（P＜0.0001），姜黃素治療后小鼠的結(jié)腸長度顯著長于DSS組（P＜0.05）。DSS組小鼠結(jié)腸壁顯著變薄，部分黏膜脫落，多發(fā)糜爛、潰瘍和出血點。DSS+CUR組小鼠的結(jié)腸少許糜爛、潰瘍灶，結(jié)腸大體形態(tài)較DSS組明顯改善，CMDI較DSS顯著下降（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠結(jié)腸長度及CMDI評分［（），分］

表1 各組小鼠結(jié)腸長度及CMDI評分［（），分］

注：與DSS組比較，*P＜0.0001；與DSS+CUR組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別結(jié)腸長度CMDI CON組9.00±0.48*0.25±0.46*DSS組5.90±0.48#3.37±0.74##DSS+CUR組6.90±0.602.35±0.70

2.3 姜黃素治療對于UC小鼠結(jié)腸黏膜損傷修復(fù)作用 CON組小鼠結(jié)腸各層結(jié)構(gòu)清晰。DSS組小鼠的黏膜變薄，腺管數(shù)量變少，腺體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，隱窩消失，固有層內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯。姜黃素改善了小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)和炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)了黏膜損傷的修復(fù)（圖2）。

圖2 各組小鼠的結(jié)腸HE染色（×20）

2.4 姜黃素治療調(diào)節(jié)小鼠腸道微生物群的組成 在屬水平，DSS+CUR組小鼠腸道的Muribaculaceae_unclassified、Muribaculum和阿克曼菌（Akkermansia）的相對豐度較DSS組顯著上調(diào)（P＜0.05），Lachnospiraceae_NK4A136_ group、擬桿菌屬（Bacteroides）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）等菌屬相對豐度有所上升（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組腸道菌群屬水平相對豐度

2.5 姜黃素對小鼠糞便代謝產(chǎn)物的影響 查閱HMDB數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)鑒定出小鼠糞便代謝產(chǎn)物一共有45種。PLS-DA散點圖顯示三組之間有明顯的分離（圖4），DSS組與CON組的距離差異較大，而DSS+CUR組與CON組距離較近，表明DSS+CUR組的代謝產(chǎn)物較DSS組更接近于CON組。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建預(yù)測模型，CONVS. DSS：R2=0.961，Q2=0.857；DSSVS. DSS + CUR：R2=0.957，Q2=0.727，表明該模型可用于進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。通過PLS-DA結(jié)合多變量統(tǒng)計分析中VIP＞1及對其峰面積進(jìn)行獨立樣本t檢驗來鑒定差異性代謝產(chǎn)物。在CON組VS. DSS組與DSSVS. DSS + CUR組之間鑒定出8種共同調(diào)控的代謝物，丙酸鹽、丁酸鹽、色氨酸和甜菜堿含量經(jīng)姜黃素治療后顯著上調(diào)，而β-葡萄糖、3-羥基苯乙酸鹽、天冬門氨酸和?；撬釀t顯著下降（圖5）。

圖4 PLS-DA散點圖

圖5 三組間共同調(diào)控代謝產(chǎn)物。注：與DSS組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001；與DSS+CUR組比較，#P＜0.05，####P＜0.0001

2.6 姜黃素對于小鼠結(jié)腸IL-10、IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)的影響 與CON組相比，DSS組結(jié)腸促炎因子IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)水平升高（P＜0.0001），抑炎因子IL-10表達(dá)降低（P＜0.0001）。經(jīng)姜黃素治療后結(jié)腸組織中IL-6、IL-17和IL-23表達(dá)量下降（P＜0.05），IL-10表達(dá)升高（P＜0.0001）（見表2）。

表2 各組小鼠結(jié)腸IL-10、IL-6、IL-17和IL-23的表達(dá)［（），pg/mL］

表2 各組小鼠結(jié)腸IL-10、IL-6、IL-17和IL-23的表達(dá)［（），pg/mL］

注：與DSS組比較，*P＜0.001，**P＜0.0001；與DSS+CUR組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.0001；與CON組比較，▲P＜0.001，▲▲P＜0.0001

組別IL-10IL-6IL-17IL-23 CON組180.10±12.80**66.75±11.93**15.23±4.09*12.25±2.19**DSS組49.20±9.32###274.90±15.63###24.29±6.28##33.10±8.45#DSS+CUR組125.30±6.21▲▲137.10±9.33▲▲17.25±4.1324.63±4.78▲

3 討論

腸道微生物群及其代謝產(chǎn)物、免疫因素所構(gòu)成的微生態(tài)環(huán)境可能是UC治療機(jī)制的基本要素。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素干預(yù)后阿克曼菌相對豐度增加。阿克曼菌是一種降解粘液的細(xì)菌，可以維持粘液層的生理厚度，保護(hù)其免受有毒物質(zhì)和病原菌的侵害。阿克曼菌從粘液中產(chǎn)生乙酸，促進(jìn)其他產(chǎn)SCFAs菌屬的生長［11］。姜黃素對腸道糖酵解/葡萄糖生成途徑的富集，可能得益于阿克曼菌改善和保持糖耐量穩(wěn)定的作用。人類腸道微生物中阿克曼菌屬比例豐富，意味著姜黃素提高其豐度的有益效果也可能適用于人類IBD患者。SCFAs是由不可消化的碳水化合物經(jīng)腸道菌群發(fā)酵而成，主要由乙酸、丙酸和丁酸組成，不僅為腸道上皮細(xì)胞提供了豐富的能量，還作為肝細(xì)胞的能量底物，可能誘發(fā)整體有益的代謝效應(yīng)［12］。一項生理模擬研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs可能進(jìn)一步加劇T細(xì)胞介導(dǎo)的急性炎癥，導(dǎo)致肝功能衰竭和腸道屏障破壞，其治療作用主要取決于CD4+T細(xì)胞的激活狀態(tài)［13］。但整體上，SCFA對IBD小鼠的代謝和能量平衡產(chǎn)生了有益的影響。

此外，腸道內(nèi)氨基酸代謝濃度的增加和其代謝途徑的富集與維持細(xì)胞形態(tài)和功能相關(guān)。色氨酸有助于保護(hù)腸黏膜上皮的完整性，可作為治療潰瘍性結(jié)腸炎的一種有前途的預(yù)防劑［14］。甜菜堿對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的緩解是其抗炎作用的關(guān)鍵，在IBD小鼠中抑制了促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)了腸黏膜屏障功能［15］。

改善Treg/Th17細(xì)胞失衡是治療UC潛在策略。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17A、IL-17F等細(xì)胞因子。IL-6可通過STAT3磷酸化，促使CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，分泌IL-17，進(jìn)一步觸發(fā)T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子、細(xì)胞粘附分子和其他細(xì)胞因子，導(dǎo)致腸道免疫系統(tǒng)持續(xù)活化。而Treg細(xì)胞則抑制免疫反應(yīng)，主要分泌IL-10，具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，可以對抗IL-2、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ等促炎因子，平衡炎癥反應(yīng)，IL-10表達(dá)缺陷與IBD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［16］。姜黃素可能通過調(diào)節(jié)Treg/Th17途徑的平衡來改善DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。

綜上所述，姜黃素對UC小鼠的治療作用機(jī)制可能通過重塑和穩(wěn)定的腸道微生態(tài)環(huán)境，包括調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群的組成，尤其增加了如阿克曼菌、Muribaculaceae_unclassified和Muribaculum這些益生菌的相對豐度；增加了SCFAs、色氨酸和甜菜堿等代謝產(chǎn)物的濃度；以及調(diào)節(jié)腸道內(nèi)促炎因子和抑炎因子的免疫失衡，從而改善UC小鼠的腸黏膜損傷而發(fā)揮治療作用。