王鵬 劉晶 陳舒

乳腺癌是女性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，占女性全部惡性腫瘤發(fā)病構(gòu)成的首位。乳腺癌患者在治療過程中遭受身心各方面的應(yīng)激源，會出現(xiàn)焦慮、抑郁等應(yīng)激相關(guān)障礙［1-2］，再加上乳腺癌患者在長期服用他莫昔芬（TAM）的過程中也會發(fā)生熱潮紅、抑郁等顯著不良反應(yīng)［3］，所以乳腺癌合并抑郁的患者在臨床中普遍存在。他莫昔芬（TAM）作為選擇性雌激素受體拮抗劑，在臨床中廣泛用于預(yù)防和治療雌激素受體或孕激素受體陽性乳腺癌患者腫瘤復(fù)發(fā)。然而，臨床研究表明抗抑郁藥的使用會干擾TAM的臨床療效，進(jìn)而增加乳腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險［4］。美國FDA對TAM聯(lián)用抗抑郁藥也進(jìn)行相關(guān)警告提醒［5］。表明TAM與抗抑郁藥聯(lián)用過程中可能存在藥物相互作用，使得TAM的療效減弱，乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險增加。TAM是前體藥物，主要通過細(xì)胞色素P450 2D6酶（CYP2D6）代謝成具有生物活性的4-羥基-N-去甲基他莫昔芬（Endoxifen）。常用抗抑郁藥物帕羅西汀、度洛西汀、氟伏沙明等對CYP2D6均有不同程度抑制作用［6-7］。此類藥物可能通過抑制CYP2D6活性來減弱TAM的代謝，從而影響抗腫瘤療效。本研究依據(jù)前期研究建立UPLC-MS/MS測定血藥濃度的方法［8］，通過探究抗抑郁藥對TAM在體內(nèi)外代謝的影響，來闡明藥物相互作用的可能機(jī)制，為臨床合理聯(lián)用抗抑郁藥物和TAM提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器 ACQUITY超高效液相色譜儀、Xevo TQD質(zhì)譜儀（沃特世科技有限公司）；WA10005電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司）；XW-80A型渦旋混合器（其林貝爾實驗室儀器有限公司）；TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SHZ-88型往復(fù)式水浴恒溫振蕩器（其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品和試劑 帕羅西汀標(biāo)準(zhǔn)品（批號：ATU717，含量97%），鹽酸度洛西汀標(biāo)準(zhǔn)品（批號：RNA552，含量98%），馬來酸氟伏沙明標(biāo)準(zhǔn)品（批號：ARC681，含量99%），TAM標(biāo)準(zhǔn)品（批號：C10388213，含量99%）均購自上海創(chuàng)賽科技有限公司；N-去甲基他莫昔芬（NDT）標(biāo)準(zhǔn)品（批號：6-SKS-119-2，含量98%）購于加拿大多倫多研究化學(xué)品公司；地西泮標(biāo)準(zhǔn)品（1.0 mg/mL，純度95%～105%）購于西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購于北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈和甲酸為色譜純；鹽酸為分析純；實驗用水為超純水。

1.3 實驗動物 雌性SD大鼠，SPF級，8周齡，體質(zhì)量為240～320 g，購于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號為SCXK（浙）2020-0001。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，自由進(jìn)食飲水，實驗前禁食不禁水12 h。

1.4 方法 （1）液質(zhì)聯(lián)用分析方法［8］。依據(jù)前期研究結(jié)果設(shè)定色譜和質(zhì)譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；柱溫40 ℃；流動相為乙腈和0.1%甲酸，設(shè)置梯度洗脫：初始0～0.5 min乙腈為30%，0.5～1.0 min內(nèi)升至95%，1.0～2.0 min維持95%，2.0～2.5 min降至30%；流速0.4 mL/min；分析時間3 min。電噴霧電離（ESI），采用多離子監(jiān)測模式，掃描正離子。毛細(xì)管電壓為2 kV，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度為500 ℃，錐孔氣流量50 L/Hr，脫溶劑氣流量為1,000 L/Hr。TAM m/z 372.27→72.00，NDT 358.26→58.00和地西泮285.101→93.10。（2）樣本處理方法。將保存于-80 ℃冰箱的樣品取出至室溫下溶解。取50 μL樣品至干凈的1.5 mL離心管中，加入150 μL乙腈沉淀蛋白，加入30 μL 500 ng/mL的地西泮溶液。充分渦旋2 min，設(shè)置轉(zhuǎn)速13,000 r/min，快速離心5 min，并取上清液2 μL進(jìn)樣分析檢測。（3）體內(nèi)實驗方法。取雌性SD大鼠20只，隨機(jī)分為4組，每組各5只，其中A組對照組，B組為帕羅西汀組（6.25 mg/kg）、C組為度洛西汀組（12.5 mg/kg）、D組為氟伏沙明組（12.5 mg/kg）。通過灌胃給予相應(yīng)量抗抑郁藥物，對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液。給藥30 min后再灌胃給予10 mg/kg TAM。于TAM給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24 h采集尾靜脈血液樣本0.3 mL至肝素離心管。低溫13,000 r/min離心10 min獲得血漿樣本，并于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。?）體外實驗方法。以抗抑郁藥物為抑制劑，TAM為底物，建立體外肝微粒體孵育體系。體系包括2 mg/mL的TAM 3.72μL（體系中終濃度為100μmol/L），大鼠肝微粒體10μL（微粒體濃度為3.42 mg/mL），PBS緩沖液174.68 μL，抗抑郁藥物1.6 μL（帕羅西汀、度洛西汀、氟伏沙明藥物濃度為12.5 mmol/L，體系終濃度為100 μmol/L），分別混合后在37 ℃水浴恒溫震蕩器中預(yù)孵育5 min，加入10μL濃度為20 mmol/L的NADPH（體系中終濃度為1 mmol/L）至終體系為200μL，并啟動反應(yīng)孵育30 min。反應(yīng)結(jié)束后立即冷卻至-80 ℃終止反應(yīng)。每個孵育體系都在獨立的EP管中進(jìn)行，一式三份，以實驗組代謝產(chǎn)生的NDT濃度均值與對照組代謝產(chǎn)物濃度均值的比值作為抑制率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Origin 8軟件繪制TAM和NDT的藥物時間曲線；采用DAS 2.0軟件非房室模型分析藥物藥動學(xué)特征并求算藥物動力學(xué)參數(shù)；應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗抑郁藥物對TAM和NDT在體外大鼠肝微粒體代謝的影響 在大鼠肝微粒體體外孵育體系中，當(dāng)帕羅西汀、度洛西汀、氟伏沙明抗抑郁藥物濃度為100μmol/L時，帕羅西汀對NDT體外抑制率為62.00%（P＜0.01），度洛西汀抑制率為69.67%（P＜0.05），氟伏沙明抑制率為79.00%（P＜0.05），結(jié)果顯示三種抗抑郁藥物在大鼠肝微粒體體外對NDT均有明顯的抑制作用。見圖1。

圖1 抗抑郁藥對NDT體外代謝產(chǎn)生的影響（n=3）。

2.2 抗抑郁藥物在大鼠體內(nèi)對TAM及其代謝物的影響 實驗結(jié)果繪制的TAM和NDT的藥物濃度-時間曲線如圖2、3所示，藥代動力學(xué)參數(shù)如表1、2所示。與空白對照組相比，帕羅西汀顯著增加TAM的AUC（P＜0.01），降低Vz/F（P＜0.05）。并顯著增加NDT的AUC（0-t）（P＜0.01）和Cmax（P＜0.05），降低CLz/F（P＜0.05）。與對照組相比，度洛西汀能明顯降低TAM的Vz/F（P＜0.05）。度洛西汀能明顯升高NDT的AUC和Cmax，降低CLz/F，但無顯著差異。氟伏沙明對TAM和NDT的藥動學(xué)參數(shù)均無明顯影響。

表1 4組大鼠血漿中TAM的主要藥動學(xué)參數(shù)（）

表1 4組大鼠血漿中TAM的主要藥動學(xué)參數(shù)（）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

參數(shù)A組B 組C組D組AUC（0-t）［（μg·h）/L］1,022.917±280.7911,882.725±275.744**2,316.229±987.0111,365.281±584.502 AUC（0-∞）［（μg·h）/L］1,043.344±282.1951,949.169±282.807**2,404.262±1,021.8601,456.44±678.471 MRT（0-t）（h）7.868±1.2408.156±0.9128.039±0.5027.518±0.525 MRT（0-∞）（h）8.311±1.2228.900±1.0248.981±0.4437.882±0.541 t1/2z（h）3.789±0.8404.126±0.3974.195±0.5874.879±1.783 Tmax（h）4.800±2.2805.612±1.6735.412±1.3423.611±1.517 CLz/F（L/kg）0.010±0.0030.005±0.0010.005±0.0030.008±0.003 Vz/F，［L/（h·kg）］0.058±0.0280.031±0.005*0.0376±0.016*0.052±0.021 Cmax（μg/L）122.362±21.020222.534±79.404276.425±104.872145.232±50.503

表2 4組大鼠血漿中NDT的藥動學(xué)參數(shù)（）

表2 4組大鼠血漿中NDT的藥動學(xué)參數(shù)（）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

參數(shù)A組B組C組D組AUC（0-t）［（μg·h）/L］193.173±23.122280.657±17.285**319.554±125.193215.687±42.205 AUC（0-∞）［（μg·h）/L］211.054±13.131341.081±74.971590.136±544.038237.609±52.414 MRT（0-t）（h）10.062±1.1879.607±1.7399.86±0.8849.835±1.131 MRT（0-∞）（h）12.209±4.05214.058±6.3538.795±4.11612.380±2.255 t1/2z（h）5.231±3.8577.855±5.0383.595±1.2486.619±2.766 Tmax（h）7.401±4.3366.421±3.5786.432±3.5786.811±3.347 CLz/F（L/kg）0.048±0.0030.030±0.007*0.027±0.0160.044±0.01 Vz/F，［L/（h·kg）］0.354±0.2520.311±0.1380.135±0.0720.403±0.182 Cmax（μg/L）17.044±3.32332.224±7.531*30.464±11.65920.757±5.995

圖2 4組大鼠中TAM的藥時曲線（n=5）

圖3 4組大鼠中NDT的藥時曲線（n=5）

3 討論

實驗體內(nèi)研究結(jié)果顯示帕羅西汀能顯著增加NDT血藥濃度，降低其在體內(nèi)的清除速度。表明帕羅西汀對NDT體內(nèi)代謝有明顯的抑制作用。而NDT在體內(nèi)主要通過CYP2D6酶代謝。所以該代謝過程的抑制作用很可能與帕羅西汀抑制CYP2D6酶有關(guān)。另外，NDT代謝過程的抑制又會直接影響主要活性代謝產(chǎn)物endoxifen的血藥濃度［9］，從而降低抗腫瘤療效發(fā)揮［10-11］。相對而言，帕羅西汀對TAM的體內(nèi)代謝的抑制作用較弱，這是由于TAM在體內(nèi)參與的代謝酶較復(fù)雜，除CYP2D6外還有其他代謝酶通道，所以帕羅西汀單純抑制CYP2D6并不能顯著影響TAM體內(nèi)清除速率。度洛西汀組與空白對照比較，顯示度洛西汀能增加TAM和NDT的血藥濃度，降低兩者的體內(nèi)代謝清除率，但是無顯著性差異。提示度洛西汀對TAM和NDT的體內(nèi)代謝過程有一定程度的抑制作用，但是抑制作用弱于帕羅西汀。氟伏沙明對TAM的體內(nèi)代謝無明顯影響。體外研究與體內(nèi)研究結(jié)果相一致，其顯示帕羅西汀、度洛西汀和氟伏沙明對NDT體外代謝抑制作用逐級降低。

所以本研究中帕羅西汀和度洛西汀均能不同程度的抑制TAM及NDT體內(nèi)外代謝的過程，而此代謝過程很可能通過抑制CYP2D6代謝酶來實現(xiàn)。其中帕羅西汀可能對CYP2D6酶具有更強(qiáng)的抑制作用，對TAM的體內(nèi)外代謝的影響更為顯著。IRARRAZAVAL等［12］的研究結(jié)論與本研究相符，其研究結(jié)果顯示帕羅西汀對CYP2D6酶具有強(qiáng)抑制作用，度洛西汀具有中等抑制作用，在接受TAM治療的乳腺癌患者中需謹(jǐn)慎使用。因此，建議接受TAM治療的乳腺癌患者，合并使用抗抑郁藥物時，謹(jǐn)慎選用帕羅西汀和度洛西汀等CYP2D6抑制作用的藥物作為抗抑郁治療。