王雪麗 張昱 郝榮榮 胡英男 王建偉 張威

結(jié)直腸癌（CRC）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居全球新發(fā)癌癥的第三位，約為10.2%，死亡率位列全球第二，約為9.2%［1］。近年，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率還在逐年上升，且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題［2］。研發(fā)新型治療藥物有望使我國(guó)CRC患者在臨床治療中有更大獲益，并且減輕醫(yī)療和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。人白細(xì)胞抗原F位點(diǎn)相鄰轉(zhuǎn)錄本10（FAT10）是一種類(lèi)泛素樣蛋白，其功能類(lèi)似于泛素化蛋白，是蛋白酶體靶向的標(biāo)簽［3］。有研究表明FAT10在多種腫瘤中高表達(dá)，例如膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、乳腺癌、胰腺癌和胃腸道癌，表明其可能參與癌癥發(fā)展的途徑［4-5］。然而，F(xiàn)AT10與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展之間的聯(lián)系尚未確定。雷公藤紅素（Cel）是一種從雷公藤植物中分離的一種活性成分，具有廣泛的生物學(xué)特性，如抗腫瘤、免疫抑制和減肥活性［6-7］?！禖ell》雜志曾將Cel評(píng)價(jià)為最有可能開(kāi)發(fā)為現(xiàn)代藥物的天然化合物之一［8］。然而，Cel對(duì)FAT10表達(dá)的影響并未報(bào)道，本文旨在研究Cel在結(jié)直腸癌中的作用，尤其是對(duì)FAT10的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料 人源結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、HCT116，購(gòu)買(mǎi)自武漢普諾賽生命科技有限公司；Cel，批號(hào)（HC020128），純度＞98%，購(gòu)買(mǎi)自辰光生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶，全購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胎牛血清購(gòu)自以色列Biolnd公司；FAT10一抗、GAPDH一抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔二抗，購(gòu)自中國(guó)杭州華安生物公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF），購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒，購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混試劑盒和SYBR Green qPCR試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自弗德生物科技有限公司。

1.2 方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：SW480和HCT116細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)介質(zhì)中，細(xì)胞傳代后放置在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。（2）Cel溶液配制：精確稱(chēng)取Cel約45.0609 mg溶于精密移取的1 mL DMSO溶液中配置成100 mM的母液，分裝凍存于-20℃。（3）細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：將狀態(tài)良好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480、HCT116細(xì)胞消化后鋪在96孔板中（5,000個(gè)/孔），細(xì)胞貼壁后用梯度稀釋法配制不同濃度的Cel（0、0.315、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）處理，Cel作用24 h后，吸除舊培養(yǎng)基，每孔添加90 μL新鮮DMEM和10 μL CCK8溶液，37℃避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度（A）值。細(xì)胞活力（%）=［A（加藥組）-A（空白組）］/［A（對(duì)照組）-A（空白組）］×100%。（4）細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將細(xì)胞培養(yǎng)于12孔板，加入不同濃度的Cel和不含藥物組，待藥物作用24 h后，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)用Annexin V-FITC/PI染色，然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。（5）實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測(cè)FAT10的表達(dá)：采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，之后按照說(shuō)明書(shū)步驟用逆轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液合成cDNA。以該cDNA為模板，使用SYBR Green進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算FAT10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。FAT10引物：正向序列為 5′-CTTGTGGAGTCAGGTGATG-3’，反向序列為5′-CCATTGCAAGTCACAATCTG-3’。GAPDH引物：正向序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，反向序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。（6）Western Blot實(shí)驗(yàn)：采用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白并BCA定量。10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白樣品，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別用相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，F(xiàn)AT10單抗（18 kDa；1∶1,000）、GAPDH抗體（36 kDa；1∶10,000）。室溫下與HRP結(jié)合的二級(jí)抗體孵育1 h。TBST洗滌3次后，用ECL發(fā)光液檢測(cè)，并使用Bio-Rad圖像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每種實(shí)驗(yàn)均重復(fù)≥3次，并采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAT10在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá) 在mRNA水平上檢測(cè)了正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460和5個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中FAT10的表達(dá)。FAT10 mRNA在這些細(xì)胞系中表達(dá)不同，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（P＜0.01，見(jiàn)圖1）。結(jié)果表明，F(xiàn)AT10基因在結(jié)直腸癌中高表達(dá)并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 RT-qPCR分析腸上皮細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞中FAT10 mRNA的表達(dá)（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 Cel對(duì)SW480和HCT116細(xì)胞增殖的影響 用不同濃度Cel（0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）分別作用SW480、HCT116細(xì)胞24 h后，相對(duì)于對(duì)照組的0 μmol/L，隨著藥物濃度增加細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05，見(jiàn)圖2）。根據(jù)Cel對(duì)SW480和HCT116細(xì)胞的毒性影響，當(dāng)藥物濃度＞10 μmol/L時(shí)，其抑制作用可以到達(dá)90%以上。計(jì)算IC50各自為3.03、1.63 μmol/L。后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物劑量根據(jù)IC50做參考，SW480選用0、1.25、5 μmol/L而HCT116選用0、1.25、2.5 μmol/L。

圖2 不同濃度的Cel對(duì)SW480和HCT116細(xì)胞增殖的影響（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 Cel對(duì)SW480和HCT116細(xì)胞凋亡的影響 用貝克曼流式細(xì)胞儀，檢測(cè)1.25、5 μmol/L Cel處理SW480和1.25、2.5 μmol/L Cel處理HCT116細(xì)胞24 h后的凋亡情況，SW480細(xì)胞與對(duì)照組的晚期凋亡率5.35%相比，給藥組的晚期凋亡率分別為25.2%、75%（P＜0.01，見(jiàn)圖3A、B），HCT116細(xì)胞的凋亡占比也隨著Cel濃度的增高而增大（P＜0.01，見(jiàn)圖3A、C）。說(shuō)明Cel能顯著誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。

圖3 不同濃度的Cel對(duì)SW480和HCT116細(xì)胞凋亡的影響（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 Cel對(duì)FAT10表達(dá)的影響 有研究發(fā)現(xiàn)FAT10在幾種癌癥中呈高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可能是一種潛在的癌癥治療手段。因此，在本研究中作者檢測(cè)了Cel是否對(duì)FAT10表達(dá)產(chǎn)生影響。以SW480和HCT116細(xì)胞為研究對(duì)象，RT-qPCR結(jié)果表明，與Cel未處理的細(xì)胞相比，F(xiàn)AT10 mRNA在Cel處理的細(xì)胞中表達(dá)下降，而當(dāng)Cel濃度為1.25 μmol/L時(shí)，F(xiàn)AT10 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05，見(jiàn)圖4A、B）。為了進(jìn)一步研究Cel是否會(huì)對(duì)FAT10產(chǎn)生作用，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其蛋白的表達(dá)情況。圖4C、D的Western blot條帶顯示隨著藥物濃度升高，F(xiàn)AT10條帶的灰度值隨之下降，說(shuō)明Cel對(duì)FAT10蛋白有抑制作用。這與FAT10 mRNA表達(dá)的趨勢(shì)是一致的。以上研究結(jié)果提示Cel可能通過(guò)觸發(fā)FAT10的下調(diào)導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。

圖4 不同濃度的Cel對(duì)FAT10表達(dá)的影響（注：*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

研究表明，泛素樣修飾劑FAT10直接參與調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展途徑［9-10］。最近報(bào)道，F(xiàn)AT10在胰腺癌中的表達(dá)增加與TNM晚期和總生存期降低有關(guān)，并通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)FAT10的表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤化療的耐藥性［11］。此外，F(xiàn)AT10是癌癥和炎癥研究和治療的重要靶標(biāo)，涉及FAT10對(duì)炎癥誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生的潛在作用。由于FAT10與炎癥信號(hào)通路之間的聯(lián)系，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)展［12］。REN等［13］發(fā)現(xiàn)，TNF-α激活NF-κB通路，該通路導(dǎo)致細(xì)胞中的FAT10基因表達(dá)并導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。沉默F(xiàn)AT10顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力［14］。這些研究強(qiáng)烈表明FAT10可用作腫瘤疾病的預(yù)后標(biāo)志物，并且是潛在的治療靶點(diǎn)。值得注意的是，F(xiàn)AT10可以通過(guò)改變凋亡途徑在促生存途徑中發(fā)揮作用。DONG等［15］報(bào)道了FAT10直接結(jié)合并穩(wěn)定Survivin蛋白，從而通過(guò)抑制泛素介導(dǎo)的降解來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，揭示了FAT10通過(guò)直接穩(wěn)定膀胱癌中的Survivin蛋白來(lái)促進(jìn)腫瘤增殖的新機(jī)制。同時(shí)，F(xiàn)AT10在染色體穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，F(xiàn)AT10表達(dá)的失調(diào)將導(dǎo)致G2/M細(xì)胞周期階段控制的失調(diào)，從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂過(guò)程中染色體的異常分布，增強(qiáng)癌細(xì)胞的存活、增殖及轉(zhuǎn)移［16］。

目前，可以有效治療CRC的潛在藥物正在不斷探索中。有文獻(xiàn)記載的古代草藥的有用性使得藥用植物成為藥物發(fā)現(xiàn)的潛在來(lái)源。許多由植物分離物制備的重要化療藥物已被用于治療各種類(lèi)型的癌癥。因此，草藥植物提取物可能是開(kāi)發(fā)抗癌藥物的一個(gè)有前途的來(lái)源。此前已經(jīng)證明，Cel對(duì)多種癌癥產(chǎn)生有益作用，表明可能使用其來(lái)開(kāi)發(fā)潛在的抗癌治療方法［17］。在各種腫瘤模型中，Cel已被證明通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡和抑制血管生成來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)。CHEN等［18］研究發(fā)現(xiàn)Cel對(duì)過(guò)氧化還原酶-2（PRDX2）的抑制增加了細(xì)胞活性氧（ROS）水平，并導(dǎo)致ROS依賴(lài)性?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，線粒體功能障礙和胃癌細(xì)胞凋亡。LIU等［19］報(bào)道了Cel通過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的ROS/JNK和AKT/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)自噬和凋亡。ZHANG等［20］報(bào)道了Cel增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）介導(dǎo)的自噬和溶酶體生物發(fā)生，改善了微管相關(guān)蛋白tau病理學(xué)，表明Cel是治療阿爾茨海默病有前途的候選藥物。此外，Cel可以通過(guò)靶向過(guò)氧化還原酶-1（PRDX1）抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，PRDX1的抑制導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS升高以及細(xì)胞周期停滯和凋亡增加［21］。然而，關(guān)于Cel在CRC中的潛在抗癌作用及其作用機(jī)制仍存在許多尚不明確的問(wèn)題。先前揭示的靶點(diǎn)和機(jī)制表明，Cel通過(guò)不同癌細(xì)胞中的不同靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤功效，但是Cel對(duì)FAT10表達(dá)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究旨在評(píng)估Cel對(duì)CRC的治療作用，重點(diǎn)是對(duì)FAT10的調(diào)控。

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)Cel對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，而且還能明顯促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的凋亡。值得注意的是，進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cel能夠下調(diào)FAT10的表達(dá)。本研究證實(shí)了雷公藤素能夠抑制CRC的發(fā)展，這可能是通過(guò)抑制FAT10基因表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)的。雖然這項(xiàng)研究取得了有價(jià)值的結(jié)果，但仍存在不足和局限性。本研究結(jié)論主要是基于對(duì)CRC細(xì)胞分子水平的研究，需要更多體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合來(lái)探究FAT10蛋白發(fā)揮的獨(dú)特功能和機(jī)制。

總之，本研究證明了FAT10在CRC細(xì)胞中的表達(dá)水平升高，Cel能夠抑制CRC細(xì)胞的增殖促進(jìn)凋亡，其作用的機(jī)制可能與下調(diào)FAT10表達(dá)有關(guān)，這是以前在文獻(xiàn)中未報(bào)道過(guò)的。深入探索FAT10與Cel作用之間的關(guān)系，了解Cel誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，將為開(kāi)發(fā)Cel作為治療CRC的潛在候選藥物提供了新的見(jiàn)解?？傊?，本研究為FAT10抑制作用對(duì)Cel誘導(dǎo)的CRC細(xì)胞活性抑制的發(fā)生提供了初步證據(jù)，并且表明Cel可能作為開(kāi)發(fā)FAT10抑制劑的先導(dǎo)化合物。