楊晨，李欣憶，梁藍(lán)兮，劉紫韞，關(guān)自寬，秦東澤，汪建明*

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.優(yōu)滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

水凝膠是通過物理或化學(xué)交聯(lián)方法制備的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的親水聚合物，可以包埋水、風(fēng)味化合物、脂質(zhì)和其他成分。水凝膠在改善食品質(zhì)地和口感、作為脂肪替代品以及通過3D 打印設(shè)計(jì)復(fù)雜的食物形狀[1]等食品工業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。根據(jù)水凝膠的形成機(jī)理一般可分為熱致凝膠和冷致凝膠兩大類。熱致凝膠由蛋白質(zhì)在高溫下聚集形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通常需要較高的蛋白質(zhì)濃度并且不適于包埋熱敏性物質(zhì)。然而，冷致凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是在室溫下由可溶性熱聚集體與合適的凝固劑形成，包括自由基交聯(lián)[2]、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)[3]、葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯酸誘導(dǎo)交聯(lián)[4]以及鹽離子交聯(lián)[5]。其中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG） 可以通過谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基團(tuán)和賴氨酸殘基的ε-氨基之間發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)催化形成分子間和分子內(nèi)的共價(jià)鍵，從而在溫和的條件下形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)[3]。目前，TG 已被廣泛用于動(dòng)物和植物蛋白中，以形成具有良好質(zhì)地的凝膠狀食品，并且更適合作為生物活性物質(zhì)的遞送載體[6]。葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯（glucono-δ-lactone，GDL）是一種弱酸，在水中被水解成葡萄糖酸，緩慢解離成氫離子。當(dāng)體系的pH 值降低至等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力達(dá)到最小，蛋白質(zhì)分子聚集形成凝膠[4]。由于GDL 凝膠形成的條件溫和且易于控制，因此被廣泛應(yīng)用于制備蛋白質(zhì)凝膠，例如大豆蛋白凝膠[7]、燕麥蛋白凝膠[8]和豬血漿蛋白凝膠[9]等。

球蛋白因其優(yōu)異的性能常被用作開發(fā)水凝膠體系的良好材料[2]。而在各種蛋白質(zhì)來(lái)源中，豌豆分離蛋白（pea protein isolate，PPI）與大豆蛋白、棉籽蛋白和菜籽蛋白等相比所含的毒性物質(zhì)較少，且不被列為過敏原，因此豌豆分離蛋白越來(lái)越多地被用作大豆蛋白的替代品。雖然豌豆分離蛋白中球蛋白占70%～80%，但每個(gè)亞基都通過多種相互作用吸引并緊密結(jié)合，導(dǎo)致其具有較高的變性溫度，需要在相對(duì)較高的溫度下才能形成凝膠。此外，由于豌豆分離蛋白的溶解度和半胱氨酸含量都較低，導(dǎo)致其凝膠能力相對(duì)較弱且缺乏彈性，極大地限制了其在食品工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用[10]。因此，通過適當(dāng)修飾來(lái)改變豌豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)以提高其膠凝能力具有重要的研究?jī)r(jià)值。

目前已經(jīng)有許多研究通過物理、化學(xué)、酶預(yù)處理或組合方法來(lái)改變蛋白質(zhì)分子量、空間結(jié)構(gòu)、表面疏水性和靜電荷等，從而改善豌豆分離蛋白的溶解性和凝膠性。Xu 等[11]通過超聲改善豌豆分離蛋白的凝膠性質(zhì)，所制備的凝膠樣品表現(xiàn)出良好的咀嚼和吞咽特性；Chen 等[12]通過歐姆加熱改性豌豆分離蛋白，形成的凝膠具有較好的持水性和均勻的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在眾多改性方法中，pH 值偏移是一種簡(jiǎn)單有效的化學(xué)改性方法[13]。Zhang 等[14]通過常壓冷等離子體結(jié)合pH 值偏移改善豌豆分離蛋白的凝膠特性，改性后的豌豆分離蛋白可以形成具有良好機(jī)械性能的熱致凝膠。在其他研究中，花生蛋白[15]、黑豆蛋白[16]以及肌球蛋白[17]的凝膠特性均在pH 值偏移處理后得到改善。然而，目前關(guān)于pH 值偏移改性豌豆分離蛋白對(duì)TG 凝膠和GDL凝膠性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響研究較少。

因此，為了將pH 值偏移改性豌豆分離蛋白作為添加劑更好地應(yīng)用于食品工業(yè)中，本研究用pH 值偏移改性豌豆分離蛋白分別制備兩種冷致凝膠（TG 凝膠和GDL 凝膠），并通過宏觀特性對(duì)比兩種凝膠性質(zhì)的差異，再進(jìn)一步通過紅外光譜和微觀結(jié)構(gòu)闡明pH 值偏移對(duì)豌豆分離蛋白冷致凝膠結(jié)構(gòu)的影響，以期為植物蛋白基凝膠體系在食品、生物醫(yī)學(xué)和其他領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆分離蛋白[蛋白質(zhì)含量為（90.61±1.90）%]：陜西百川康澤生物科技有限公司；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（酶活力100 U/g）：上海鑫泰實(shí)業(yè)有限公司；葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；尿素、叔丁醇：上海麥克林生化科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液、三（羥甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]：北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甘氨酸（glycine，Gly）、考馬斯亮藍(lán)、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis （2-nitrobenzoic acid），DTNB]：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇、NaOH、HCl、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

三溫三控水浴鍋（DK-8D）：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電子天平（JA200）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；pH 計(jì)（FE28）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；磁力攪拌器（HJ-1）：金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；真空冷凍干燥機(jī)（FD-1A-50）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；低溫冷凍離心機(jī)（TGL-16M）：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；質(zhì)構(gòu)儀（TA.XT Plus）：英國(guó)Stable Micro Systems 公司；傅里葉變換紅外光譜儀（NICOLET IS50）：美國(guó)Thermo Scientific 公司；掃描電子顯微鏡（SU1510）：日本Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 豌豆分離蛋白的pH 值偏移處理

將PPI 溶于蒸餾水中室溫下磁力攪拌12 h（初始pH7.8），充分水合后使用1 mol/L NaOH 或0.5 mol/L HCl 將PPI 溶液分別調(diào)至pH7、pH10、pH11、pH12 并保持2 h，然后在室溫下用0.5 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH 緩慢滴定至pH7，同時(shí)攪拌并定容為7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）PPI 分散體。之后將PPI 分散體置于90 ℃水浴中加熱30 min 得到改性PPI 分散體，樣品分別記為pH7-7、pH10-7、pH11-7、pH12-7。（注：預(yù)試驗(yàn)中觀察到NaCl 不能使PPI 形成凝膠，因此本研究中由pH 值偏移產(chǎn)生的NaCl 對(duì)凝膠性質(zhì)的影響可以忽略不計(jì)）。

1.3.2 豌豆分離蛋白冷致凝膠的制備

TG 凝膠：7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）改性PPI 分散體中分別加入不同量的TG，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)選擇TG 添加量為30、50、70 U/g。渦旋混勻后立即轉(zhuǎn)移至定制的直徑為20 mm、高度為40 mm 的中空?qǐng)A柱形塑料管中，45 ℃水浴1 h形成凝膠，之后將樣品冰浴冷卻至室溫。在分析之前，凝膠樣品在4 ℃下儲(chǔ)存12 h。

GDL 凝膠：7%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）改性PPI 分散體中分別加入不同量的GDL，為了使凝膠的最終pH 值達(dá)到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)附近，選擇GDL 添加量為8.5%、12.5%、15.0%（基于蛋白質(zhì)干重的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。渦旋混勻后立即轉(zhuǎn)移至定制的直徑為20 mm、高度為40 mm 的中空?qǐng)A柱形塑料管中，4 ℃靜置12 h 制成凝膠。此時(shí)測(cè)定凝膠的最終pH 值分別為5.02、4.54、4.07。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

采用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析。將凝膠恢復(fù)至室溫后切成圓柱形（直徑20 mm、高度20 mm），使用P/100探頭在室溫下測(cè)量，設(shè)置探頭測(cè)試前速度為5 mm/s、測(cè)試中以及測(cè)試后速度均為1 mm/s，觸發(fā)力為5 g，壓縮比為50%[18]。

1.3.4 持水性的測(cè)定

根據(jù)離心法測(cè)定凝膠的持水性（water holding capacity，WHC）。將凝膠恢復(fù)至室溫后取5 g 置于50 mL離心管中，并精確記錄初始質(zhì)量。然后在室溫下8 000 r/min 離心20 min，除去釋放的水后用濾紙小心擦拭樣品表面，再次稱量凝膠的質(zhì)量。WHC 按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算。

式中：R 為WHC，%；W1為50 mL 離心管的質(zhì)量，g；W2為離心前凝膠和離心管的質(zhì)量，g；W3為離心后凝膠和離心管的質(zhì)量，g。

1.3.5 非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量的測(cè)定

參考Ge 等[19]的方法并略作修改，將1 g 凝膠切成薄片裝入含有40 mL 蒸餾水的50 mL 離心管中。然后，將含有凝膠樣品的離心管置于25 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，以使凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)外的蛋白質(zhì)達(dá)到平衡狀態(tài)。最后，將含有凝膠樣品的離心管在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，并通過Bradford 法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。凝膠中非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量按照公式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：Rnon為非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量，%；Cnon為上清液中的蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；Vwater為蒸餾水的體積，mL；Cp為凝膠化前分散體的蛋白質(zhì)濃度，mg/g；mgel為凝膠的質(zhì)量，g。

1.3.6 游離巰基含量的測(cè)定

游離巰基的含量參考Zhang 等[14]的方法測(cè)定，并略作修改。將100 mg 凝膠置于5 mL pH8.0 的Tris-Gly緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L Gly、4 mmol/L EDTA）中，渦旋使其充分混合，然后將PPI 分散體在5 000 r/min 下離心20 min。將Ellman 試劑（Tris-Gly緩沖液配制的4 mg/mL DTNB）與上清液以1∶100 的體積比混合。然后將混合物在25 ℃下避光反應(yīng)60 min，并在412 nm 處測(cè)量吸光值。使用緩沖液代替PPI 分散體作為空白對(duì)照。游離巰基含量按照公式（3）進(jìn)行計(jì)算。

式中：S 為游離巰基含量，μmol/g；A412為波長(zhǎng)412 nm處的吸光值；D 為稀釋倍數(shù)；C 為蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；73.53 由106/（1.36×104） 計(jì)算得出，其中1.36×104L/（mol·cm）為摩爾消光系數(shù)。

1.3.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

將凍干的凝膠樣品（1 mg）與干燥的KBr（150 mg）混合，將其研磨均勻并壓成薄片。采用傅里葉變換紅外光譜儀，在4 000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)掃描64 次，分辨率為4 cm-1，溫度25 ℃，以空氣為采集背景。使用Peakfit 4.12 軟件分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成和含量。

1.3.8 微觀結(jié)構(gòu)的觀察

參考Zhang 等[20]的方法，將凝膠樣品切成小塊（2 mm×5 mm）置于2.5%戊二醛中4 ℃固定2 h。隨后使用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.2） 將樣品洗滌3次，再使用濃度分別為50%、70%、80%和90%的乙醇溶液浸泡脫水10 min。然后使用無(wú)水乙醇再次進(jìn)行脫水3 次，每次浸泡10 min。最后將樣品浸入無(wú)水乙醇和叔丁醇的混合物（體積比1∶1）中浸泡15 min，轉(zhuǎn)移到叔丁醇中浸泡15 min。預(yù)處理后的凝膠樣品真空冷凍干燥后用導(dǎo)電膠固定于樣品臺(tái)上，用離子濺射機(jī)噴灑金原子涂層并使用掃描電子顯微鏡在加速電壓為15 kV下觀察樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有數(shù)據(jù)采用Origin 2018 軟件繪圖，并用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 值偏移改性豌豆分離蛋白冷致凝膠的特性表征

2.1.1 pH 值偏移對(duì)豌豆分離蛋白冷致凝膠持水性的影響

凝膠的持水性可以反映凝膠的質(zhì)地和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，是評(píng)價(jià)凝膠性能的重要指標(biāo)，并且凝膠的持水性還取決于凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔徑和強(qiáng)度，以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水的相互作用[8]。pH 值偏移對(duì)TG 凝膠和GDL 凝膠持水性的影響見圖1。

圖1 pH 值偏移對(duì)TG 凝膠和GDL 凝膠持水性的影響Fig.1 Effect of pH-shifting on water holding capacity of TG gels and GDL gels

由圖1（a）可知，未經(jīng)pH 值偏移改性形成的TG凝膠持水性為52.0%～55.9%，而pH 值偏移顯著提高了TG 凝膠的持水性（P＜0.05），并且隨著pH 偏移值的增加持水性逐漸上升，pH12 偏移改性后形成的TG 凝膠對(duì)水的結(jié)合能力最強(qiáng)，在TG 添加量為50 U/g 時(shí)可達(dá)到（92.13±2.40）%。研究發(fā)現(xiàn)，在中性pH 值下由蛋清蛋白制備的凝膠持水性為90.03%[21]；基于不同制備方法的大豆蛋白凝膠的持水性為60%～95%[22]。而本研究中的較高持水性可歸因于pH 值偏移對(duì)TG 交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生了有益的影響，促進(jìn)了凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，從而有利于其束縛更多的水。隨著TG 添加量的增加（30～50 U/g），TG 凝膠的持水性顯著增加（P＜0.05），但是當(dāng)TG 添加量大于50 U/g 時(shí)，TG 凝膠的持水性整體略微下降但差異不顯著（P＞0.05），可能的原因是隨著TG 添加量的增大，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)，當(dāng)TG 過量后會(huì)削弱蛋白質(zhì)-水之間的相互作用，導(dǎo)致持水性略微下降，在Ruzengwe 等[6]的研究中也觀察到類似的結(jié)果。圖1（b）顯示，pH 值偏移改性對(duì)GDL 凝膠持水性的影響較小，僅在pH12 偏移改性后形成的凝膠中觀察到持水性明顯增大的趨勢(shì)。但GDL 的添加量對(duì)凝膠的持水性有一定的影響，添加量為12.5%時(shí)凝膠的持水性相對(duì)最高，此時(shí)凝膠的最終pH 值更接近豌豆分離蛋白等電點(diǎn)，靜電斥力達(dá)到最小值，疏水相互作用引起的蛋白質(zhì)聚集會(huì)由于失去靜電斥力的穩(wěn)定作用而增強(qiáng)[13]。

2.1.2 pH 值偏移對(duì)豌豆分離蛋白冷致凝膠硬度的影響硬度是指凝膠樣品在外部壓力下被迫達(dá)到一定形變時(shí)所施加的力，它通常與蛋白質(zhì)的凝膠結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組分間的相互作用力有關(guān)，可以表征凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的緊密程度[4]。pH 值偏移對(duì)TG 凝膠和GDL 凝膠硬度的影響見圖2。

圖2 pH 值偏移對(duì)TG 凝膠和GDL 凝膠硬度的影響Fig.2 Effect of pH-shifting on hardness of TG gels and GDL gels

由圖2（a）可知，pH 值偏移改性后TG 凝膠的硬度隨著pH 偏移值的增加而顯著增加（P＜0.05），特別是TG 添加量70 U/g 時(shí)，pH12 偏移改性后形成的凝膠硬度最高（413.82 g），是對(duì)照組的3.19 倍，這與持水性的變化趨勢(shì)一致。試驗(yàn)證明，pH 值偏移有利于TG 催化豌豆分離蛋白聚集體交聯(lián)形成凝膠，凝膠強(qiáng)度的增加可能是因?yàn)閜H 值偏移使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)部分展開，聚集體粒徑減小溶解度增加，使它們能夠分散在水中并與TG 相互作用[23]，從而使豌豆分離蛋白在中性條件下形成更均勻、更致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致凝膠硬度和持水性大大增強(qiáng)。此外，TG 的添加量也顯著影響凝膠的硬度，這可能是因?yàn)閜H 值偏移使豌豆分離蛋白結(jié)構(gòu)展開，通過堿性處理破壞側(cè)鏈相互作用，包括二硫鍵、疏水相互作用和最初穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的氫鍵，為分子相互作用創(chuàng)建了足夠多的游離活性位點(diǎn)及谷氨酰胺和賴氨酸殘基位點(diǎn)，所以隨著TG 添加量的增加，形成的G-L 異肽鍵也增加，更利于形成蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。由圖2（b）可知，pH 值偏移改性后GDL 凝膠的硬度隨pH 偏移值的增加呈先下降后上升趨勢(shì)。隨著GDL 添加量的增加，凝膠的硬度先增加后減小，這與持水性的變化趨勢(shì)一致，表明pH 值偏移改性后豌豆分離蛋白變性不利于GDL 凝膠的形成。此外，過高的GDL 添加量可能導(dǎo)致體系過酸，pH 值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，使得凝膠結(jié)構(gòu)被破壞，性質(zhì)變差。因此，pH 值偏移改性可以顯著改善豌豆分離蛋白TG 凝膠的性質(zhì)，而對(duì)GDL 凝膠沒有顯著的影響。

2.1.3 pH 值偏移對(duì)豌豆分離蛋白冷致凝膠非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量的影響

不參與凝膠網(wǎng)絡(luò)形成并在凝膠化后作為可溶性組分包埋在凝膠基質(zhì)中的蛋白質(zhì)稱為非網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)[19]。參與形成凝膠網(wǎng)絡(luò)的蛋白數(shù)量很大程度上影響著凝膠強(qiáng)度及其相關(guān)特性。因此，測(cè)定凝膠中的非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量可以進(jìn)一步了解凝膠的特性。pH 值偏移對(duì)TG凝膠和GDL 凝膠非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量的影響見圖3。

圖3 pH 值偏移對(duì)TG 凝膠和GDL 凝膠非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量的影響Fig.3 Effect of pH-shifting on non-network protein content of TG gels and GDL gels

如圖3（a）所示，pH 值偏移改性后大大降低了TG凝膠中非網(wǎng)絡(luò)蛋白的數(shù)量，表明有更多的蛋白質(zhì)參與了凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。特別是豌豆分離蛋白經(jīng)過pH12 偏移改性后形成的TG 凝膠中釋放的非網(wǎng)絡(luò)蛋白比例遠(yuǎn)低于其他組凝膠。隨著堿性pH 偏移值的增加，更多的蛋白質(zhì)參與凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，使得凝膠網(wǎng)絡(luò)中鏈數(shù)增加或鏈增厚[24]，導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度和持水性增加。Wu 等[25]也報(bào)道了熱誘導(dǎo)大豆蛋白凝膠的硬度與其非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量呈負(fù)相關(guān)性。并且隨著TG 添加量的增加，非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量逐漸減少，這與硬度的變化趨勢(shì)一致。然而，pH 值偏移改性后形成的GDL 凝膠中非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量出現(xiàn)增加的趨勢(shì)，表明pH 值偏移導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，網(wǎng)絡(luò)蛋白含量降低，不穩(wěn)固的凝膠結(jié)構(gòu)無(wú)法鎖住水分，因此表現(xiàn)為持水性和硬度下降的宏觀特性。在GDL 添加量為12.5%時(shí)觀察到非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量相對(duì)較低，這與持水性和硬度的結(jié)果一致，表明在此添加量下最終pH 值最接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，靜電斥力達(dá)到最低，凝膠結(jié)構(gòu)最為致密。與此同時(shí)，在GDL 凝膠中觀察到釋放的非網(wǎng)絡(luò)蛋白含量遠(yuǎn)高于TG 凝膠，因?yàn)樾纬蒅DL 凝膠網(wǎng)絡(luò)的主要作用力為非共價(jià)相互作用（離子鍵、氫鍵和疏水相互作用），而TG 催化產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的共價(jià)交聯(lián)，形成的G-L 異肽鍵強(qiáng)度比疏水相互作用和氫鍵的強(qiáng)度高20 倍，并被鑒定為維持TG 凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要作用力[6]。

2.1.4 pH 值偏移對(duì)豌豆分離蛋白冷致凝膠游離巰基含量的影響

在凝膠化過程中，游離巰基會(huì)氧化形成二硫鍵，顯著影響凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度[5]。pH 值偏移對(duì)TG凝膠和GDL 凝膠游離巰基含量的影響見圖4。

圖4 pH 值偏移對(duì)TG 凝膠和GDL 凝膠游離巰基含量的影響Fig.4 Effect of pH-shifting on -SH content of TG gels and GDL gels

如圖4（a）所示，pH 值偏移改性后TG 凝膠中的游離巰基含量整體呈降低的趨勢(shì)，這可能是由于凝膠化過程中蛋白質(zhì)去折疊發(fā)生構(gòu)象變化，部分埋藏的游離巰基被暴露導(dǎo)致分子內(nèi)或分子間二硫鍵的形成[3]。另一方面，pH 值偏移可能促進(jìn)了TG 催化的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，形成G-L 共價(jià)鍵，導(dǎo)致部分游離巰基被包裹在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中而未被檢測(cè)到[26]，這也導(dǎo)致TG 凝膠中游離巰基含量的減少。此外，pH11-7 組中隨著TG 添加量的增加游離巰基含量呈降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)榻宦?lián)作用的增強(qiáng)有助于巰基二硫鍵的交換反應(yīng)，這將促進(jìn)分子間二硫鍵的形成。然而在GDL 凝膠中，GDL 的添加使體系pH 值下降，接近等電點(diǎn)時(shí)負(fù)電荷被中和，蛋白質(zhì)通過二硫鍵和非共價(jià)相互作用發(fā)生聚集形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。因此，在天然豌豆分離蛋白中GDL 凝膠的游離巰基含量略低于TG 凝膠，并且在GDL 添加量為12.5%時(shí)游離巰基含量最低，此時(shí)有更多的二硫鍵參與凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成使得凝膠網(wǎng)絡(luò)更加緊密。與此同時(shí)，pH 值偏移改性對(duì)GDL 凝膠中游離巰基含量沒有顯著影響，這與凝膠的持水性和硬度的結(jié)果一致。

綜上所述，pH 值偏移可以作為一種有效的改性方法來(lái)改善中性pH 值下TG 交聯(lián)豌豆分離蛋白凝膠的性質(zhì)，但是對(duì)GDL 凝膠的性質(zhì)無(wú)明顯改善作用。因此，有必要進(jìn)一步研究pH 值偏移對(duì)TG 凝膠結(jié)構(gòu)的影響。

2.2 pH 值偏移改性豌豆分離蛋白冷致凝膠的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 pH 值偏移對(duì)TG 凝膠二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)凝膠樣品進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR） 分析以確定蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的鍵和結(jié)構(gòu)。pH 值偏移對(duì)TG 凝膠紅外光譜和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響見圖5。

圖5 pH 值偏移對(duì)TG 凝膠紅外光譜和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Fig.5 Effect of pH-shifting on FTIR and secondary structure content of TG gels

由圖5（a）可知，凝膠樣品在3 424～3 414 cm-1的峰代表酰胺A 帶，這可能與游離或結(jié)合的O—H 和N—H 基團(tuán)有關(guān)，2 926～2 850 cm-1的峰代表酰胺B 帶，這可能與C—H 和NH2拉伸振動(dòng)有關(guān)[12]；此外蛋白質(zhì)中CO 的拉伸振動(dòng)對(duì)應(yīng)于酰胺I 帶（1 700～1 600 cm-1），平面內(nèi)N—H 彎曲對(duì)應(yīng)于酰胺II 帶（1 546～1 541 cm-1），以及N—H 彎曲和C—N 拉伸振動(dòng)對(duì)應(yīng)于酰胺III 帶（1 386～1 240 cm-1）[27]。所有凝膠樣品出現(xiàn)的峰的位置無(wú)顯著變化，沒有峰消失，也沒有新的峰出現(xiàn)，表明pH值偏移不會(huì)完全破壞或產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)官能團(tuán)。為了詳細(xì)了解改性豌豆分離蛋白凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，對(duì)酰胺I 帶進(jìn)行解卷積，以確定α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量。其中，α-螺旋和β-折疊對(duì)于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成至關(guān)重要[17]。由圖5（b）可知，經(jīng)過pH 值偏移后凝膠中α-螺旋和β-折疊含量增加，且隨著pH偏移值的增加而增加，這與凝膠的持水性和質(zhì)構(gòu)的結(jié)果一致。Lv 等[28]研究證實(shí)大豆蛋白-馬鈴薯蛋白-蛋清蛋白復(fù)合凝膠中的β-折疊含量與持水性之間存在正相關(guān)性。Li 等[15]發(fā)現(xiàn)在花生蛋白凝膠中β-折疊含量的變化與破裂力的變化一致，并且β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲是不規(guī)則的，它們不利于有序凝膠結(jié)構(gòu)的形成。在本研究中隨著pH 偏移值的增加，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量逐漸減少，這也證明了pH 值偏移對(duì)TG 交聯(lián)反應(yīng)具有促進(jìn)作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)、聚集，宏觀表現(xiàn)為凝膠強(qiáng)度和持水性的提高。

2.2.2 pH 值偏移對(duì)TG 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

使用掃描電子顯微鏡觀察凝膠樣品的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從微觀角度探討pH 值偏移對(duì)TG 凝膠特性的影響見圖6。

圖6 pH 值偏移對(duì)TG 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.6 Effect of pH-shifting on microstructure of TG gels

如圖6 所示，未經(jīng)pH 值偏移制備的凝膠樣品質(zhì)地柔軟不具有良好的自支撐性，且具有非均勻的大顆粒聚集區(qū)域，此外未折疊的蛋白質(zhì)在凝膠化過程中相互作用，再次促進(jìn)聚集體粒徑的增加。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用較弱導(dǎo)致形成的凝膠具有更松散的結(jié)構(gòu)，離心后會(huì)滲出大量的水，因此表現(xiàn)出凝膠表面粗糙、凹凸不平的微觀結(jié)構(gòu)。pH 值偏移后凝膠樣品表現(xiàn)為微觀結(jié)構(gòu)更加均勻、致密和光滑，并且隨著pH 偏移值的增加，凝膠的微結(jié)構(gòu)變得更細(xì)膩，特別是pH12 偏移改性后PPI 凝膠具有更高的交聯(lián)度、更小的孔和相對(duì)均勻、光滑的表面，此時(shí)高度互連和緊密的凝膠網(wǎng)絡(luò)表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗外力能力，并通過毛細(xì)管效應(yīng)束縛更多的水[14]，因此pH12 偏移改性凝膠的硬度和持水性遠(yuǎn)高于其他樣品。Peyrano 等[29]和Chen 等[12]的研究也指出致密的微觀結(jié)構(gòu)與凝膠強(qiáng)度和持水性的提高呈正相關(guān)性。Cui 等[30]還發(fā)現(xiàn)交聯(lián)度較高、孔隙較密的微觀結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了大豆乳清混合蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和持水性。總體而言，在本研究中TG 凝膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)都證實(shí)了pH 值偏移可以提高豌豆分離蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)性質(zhì)和持水性，并且可以調(diào)控TG誘導(dǎo)豌豆分離蛋白凝膠的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究分別以TG 和GDL 作為交聯(lián)劑，針對(duì)pH值偏移對(duì)豌豆分離蛋白冷致凝膠性質(zhì)的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，由于TG 促進(jìn)了較高凝膠強(qiáng)度的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，使得豌豆分離蛋白無(wú)論是否進(jìn)行pH 值偏移處理，形成的TG 凝膠的性質(zhì)均優(yōu)于GDL 凝膠，但推薦TG 添加量為50 U/g，因?yàn)檫M(jìn)一步增加TG 添加量對(duì)凝膠性質(zhì)的增強(qiáng)沒有顯著影響。此外，pH 值偏移通過促進(jìn)TG 的交聯(lián)反應(yīng)，提高凝膠的持水性和硬度，并且該凝膠顯示出與大豆蛋白或動(dòng)物蛋白相當(dāng)?shù)哪z性質(zhì)。FTIR 分析和微觀結(jié)構(gòu)也表明，pH 值偏移促進(jìn)了TG 凝膠中無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角向β-折疊和α-螺旋的轉(zhuǎn)化，以形成均勻致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)。然而GDL 凝膠的網(wǎng)絡(luò)主要靠二硫鍵和非共價(jià)相互作用維持，因此pH值偏移改性對(duì)GDL 凝膠性質(zhì)的改善沒有顯著影響。研究結(jié)果為豌豆分離蛋白作為大豆蛋白的替代品以及天然食品凝膠劑提供了理論依據(jù)。