林紅麗，張雪菲，彭慧，黃倩倩，張月輝

[青島市中醫(yī)醫(yī)院（青島市海慈醫(yī)院） 干部保健科，山東 青島 266033]

既往多項研究證實，microRNA-29a（miR-29a）參與機體多系統(tǒng)疾病如腎小球病變[1]、膿毒癥[2]、神經元細胞凋亡[3]等；動物實驗證實，敲除miR-29a小鼠出現蛋白尿，且腎小球損傷及腎臟纖維化程度加劇[1]。臨床數據表明，早期膿毒癥患者外周血中檢出miR-29a表達明顯上調，是潛在的診斷膿毒血癥的生物標志物，可能也具有預測膿毒癥患者臨床預后的價值[2]。隨著研究的深入，發(fā)現miR-29a參與冠心病發(fā)生、發(fā)展，是臨床診斷冠心病的有益生物學標志物，與健康對照組相比，miR-29a在冠心病患者中表達增加，且參與冠心病病情進展，影響患者心功能，分析機制可能與miR-29a影響機體炎癥反應有關[4]。筆者回顧文獻發(fā)現，miR-29a對冠心病的影響可能與其參與冠狀動脈粥樣斑塊的發(fā)生、發(fā)展有關。查晴等[5]發(fā)現，冠狀動脈粥樣斑塊中miR-16的表達顯著上調，進一步的病理學機制研究發(fā)現，miR-16促進血管內皮炎癥反應，加劇泡沫細胞凋亡。目前針對miR-29a與斑塊穩(wěn)定性及冠脈血管內皮損傷的相關性研究尚屬空白，闡明miR-29a參與上述病理過程的機制能夠為臨床治療冠心病提供新的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

連續(xù)納入2020年4月—2022年6月于青島市中醫(yī)醫(yī)院心血管內科門診住院的冠心病患者120例。其中，男性68例，女性52例；年齡46～81歲，平均（59.03±8.27）歲。納入標準：①患者符合冠心病診斷[6]；②首次診斷冠心病且自愿入組；③穩(wěn)定型心絞痛定義為特定勞力狀態(tài)下導致胸悶和（或）胸痛等癥狀；④不穩(wěn)定型心絞痛。排除標準：①合并急性心肌梗死（包括急性ST段抬高型心肌梗死和非ST段抬高型心肌梗死）；②存在抗血小板、調脂等藥物治療禁忌證；③合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全等不適宜入組疾?。虎芗韧邮苓^冠狀動脈介入治療；⑤臨床資料不完整；⑥存在先天性心臟病、反復且難以控制的心力衰竭及其他累及心血管系統(tǒng)的疾病；⑦雖有冠狀動脈血管病變，但平素無心絞痛等臨床癥狀；⑧妊娠或哺乳期婦女。所有患者自愿入組，入組前獲得充分知情同意，并簽署知情同意書。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準（No：20221014002）。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本收集 抽取受試者禁食12 h后外周靜脈血，3 000 r/min離心5 min，收集上層血清用于實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）和酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA），同時抽取禁食12 h后靜脈血用于檢測血脂水平。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-29a表達 取凍存血清室溫完全解凍后加入TRIzol試劑提取總RNA，通過紫外分光光度儀在波長260 nm處檢測總RNA濃度和純度合格[4]，備用實驗。應用miScript Reverse Transcription Kit逆轉錄試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）構建cDNA文庫，應用TaqMan?Fast Advanced Master Mix試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）進行qRT-PCR，配制總體積為20 μL的反應體系：包括5 μL cDNA，10 μL Master Mix，正向引物和反應引物各1 μL（上海生工生物工程股份有限公司），3 μL RNA-free水。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共40個循環(huán)。以U6為內參基因。miR-29a正向引物：5'-CGCGGATC CATGGTTAAAGAGCC-3'；反向引物：5'-CCCAAGCTT TCAGTATAACCATTC-3'，引物長度23 bp；U6正向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，引物長度25 bp。miR-29a mRNA相對表達量的計算方式為2-ΔΔCt，每個樣本均重復檢測3次，取平均值。

1.2.3 ELISA法檢測內皮細胞特異性分子-1（endothelial cell specific molecule-1,ESM-1）、內皮素-1（endothelin-1,ET-1）、一氧化氮（nitric oxide,NO）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1） 取1.2.1中血清，采用ELISA法檢測內皮細胞ESM-1、ET-1、NO、TNF-α、ICAM-1[7]，檢測試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2.4 實驗室檢查 抽取受試者空腹靜脈血約5 mL送檢至本院中心實驗室，檢測低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglycerides,TG）及血肌酐（serum creatinine,Scr）。

1.2.5 冠狀動脈CT血管成像檢查評估冠狀動脈粥樣硬化斑塊性質 根據冠狀動脈CT血管成像評價冠狀動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[7]，計算斑塊CT值，其中CT值< 60 HU為軟斑塊，60 HU≤ CT值<130 HU為纖維斑塊，CT值≥ 130 HU為鈣化斑塊。應用寶石能譜CT進行冠狀動脈成像檢查（德國西門子公司），掃描范圍設定為主動脈弓肺動脈起始段至膈肌下1 cm。參數設置：管電壓為120 kV，管電流為800 mA，螺距為0.5 mm，層厚0.625 mm，經肘正中靜脈推注對比劑，注射速度3.5 mL/s；依據冠狀動脈CT血管成像檢查將冠狀動脈粥樣斑塊分為穩(wěn)定斑塊（鈣化斑塊和硬斑塊）及不穩(wěn)定斑塊（軟斑塊和混合斑塊）[8]。

1.3 分組

根據miR-29a mRNA中位數（miR-29a mRNA=1.13）對患者進行分組，外周血miR-29a mRNA>1.13的患者歸為高miR-29a組（59例），外周血miR-29a mRNA≤1.13的患者歸為低miR-29a組（61例）。根據患者斑塊性質，將患者分為軟斑塊（51例）、纖維斑塊（37例）及鈣化斑塊（32例）。根據斑塊穩(wěn)定性，將患者分為斑塊穩(wěn)定組（82例）與斑塊不穩(wěn)定組（38例）。根據患者臨床表現將患者分為穩(wěn)定型心絞痛組（74例）與不穩(wěn)定型心絞痛組（46例）。

1.4 統(tǒng)計學方法

數據分析均采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Pearson法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料及實驗室指標比較

高miR-29a組與低miR-29a組的年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、LDL-C、HDL-C、TG、TC、Scr比較，經t檢驗或χ2檢驗，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。高miR-29a組與低miR-29a組的NO、ET-1、ESM-1、TNF-α及ICAM-1水平比較，經t檢驗或χ2檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），高miR-29a組的NO、ET-1、ESM-1、TNF-α及ICAM-1水平高于低miR-29a組（P<0.05）。見表1。

表1 兩組患者臨床資料及實驗室指標的比較

2.2 miR-29a與斑塊穩(wěn)定性、不穩(wěn)定型心絞痛及斑塊性質的關系

qRT-PCR結果顯示，穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組miR-29a mRNA相對表達量分別為（1.42±0.51）、（2.09±0.33），經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.933，P=0.000）；不斑塊穩(wěn)定組外周血miR-29a mRNA相對表達量高于斑塊穩(wěn)定組。

qRT-PCR結果顯示，不穩(wěn)定型心絞痛組與穩(wěn)定型心絞痛組miR-29a mRNA相對表達量分別為（2.27±0.41）、（1.58±0.36），經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.656，P=0.000）；不穩(wěn)定型心絞痛組外周血miR-29a mRNA相對表達量高于穩(wěn)定型心絞痛組。

qRT-PCR結果顯示，軟斑塊組、纖維斑塊組、鈣化斑塊組的miR-29a mRNA相對表達量分別為（2.41±0.43）、（1.94±0.29）、（1.25±0.27），經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=4.053，P=0.000）。軟斑塊組外周血miR-29a mRNA相對表達量高于纖維斑塊組及鈣化斑塊組（P<0.05）；但纖維斑塊組及鈣化斑塊組外周血miR-29a mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 miR-29a與冠狀動脈血管內皮因子的相關性

Pearson相關性分析結果提示，miR-29a與ET-1、TNF-α及ESM-1呈正相關（r=0.471、0.605和0.328，P=0.000、0.041和0.000），但與NO呈負相關（r=-0.291，P=0.034）。

3 討論

血管內皮損傷是指內皮功能或正常形態(tài)受到損傷時出現功能障礙及變形，導致機體炎癥反應、血栓聚集、氧化應激及血管收縮等病理過程顯著加強，也是動脈粥樣硬化的始動因素。持續(xù)的內皮細胞損傷最終導致動脈粥樣硬化[9-11]，因此探討影響血管內皮損傷的機制有利于降低動脈粥樣類疾病的病程進展和惡性事件風險。孫定軍等[12]研究發(fā)現，miR-29a-3p調控細胞凋亡等病理生理過程，抑制miR-29a-3p降低了ox-LDL所致的血管內皮細胞氧化應激和凋亡，以上結果提示臨床通過靶向干預miR-29a-3p治療動脈粥樣硬化類疾病有理論基礎支撐。本研究則從臨床病例出發(fā)，探討了miR-29a在冠心病心絞痛患者中的表達變化，及其與血管內皮損傷程度、斑塊穩(wěn)定性、心絞痛發(fā)作情況的相關性，為后續(xù)開展基因靶向治療提供理論基礎。

本研究結果顯示，高miR-29a組ESM-1、ET-1、NO、TNF-α均高于低miR-29a組；且miR-29a與ET-1、TNF-α及ESM-1呈正相關，與NO呈負相關。說明循環(huán)miR-29a水平可能是反應冠狀動脈血管內皮損傷程度的指標，提示miR-29a可能具備潛在的損傷冠脈血管內皮，加劇病程進展的不利影響因素，與既往研究結果一致[13]。比較可知，斑塊不穩(wěn)定患者miR-29a水平高于斑塊穩(wěn)定患者，不穩(wěn)定型心絞痛患者miR-29a水平高于穩(wěn)定型心絞痛患者；軟斑塊患者miR-29a水平高于纖維斑塊及鈣化斑塊患者，結果提示高水平miR-29a提示患者有更多的心血管事件風險，能夠幫助臨床醫(yī)師在診治過程中識別高?；颊?，積極給予綜合干預措施，降低不良心血管事件發(fā)生風險。

綜上所述，miR-29a與冠心病患者冠脈血管內皮損傷及斑塊不穩(wěn)定性具有相關性，miR-29a表達越高，血管內皮損傷可能越嚴重，斑塊不穩(wěn)定性風險越大。后續(xù)筆者將開展相關研究探討干預miR-29a對冠心病的影響，為臨床轉化提供理論依據。