張靜，王常松

·綜 述·

人胃癌裸鼠移植模型的研究進(jìn)展

張靜，王常松

福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122

胃癌的發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)位居前列。胃癌的基礎(chǔ)研究需要能真正模擬胃癌在人體內(nèi)自然生長、侵襲及轉(zhuǎn)移過程的動(dòng)物模型，建立合理有效的胃癌動(dòng)物模型是做好胃癌研究的前提。鼠基因組與人類基因組高度相似，裸鼠免疫能力低，對(duì)惡性腫瘤異質(zhì)移植不會(huì)產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。將人源胃癌細(xì)胞或胃癌組織塊移植到裸鼠體內(nèi)可形成胃癌組織，且瘤體形成時(shí)間短，成功率高。本文對(duì)人胃癌裸鼠移植模型的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為胃癌研究者選用合適的造模方法并避免在造模過程中可能出現(xiàn)的問題提供參考。

胃癌模型；動(dòng)物模型；裸鼠；基礎(chǔ)研究

胃癌是原發(fā)于胃的上皮源性惡性腫瘤，是最常見的消化道腫瘤之一[1]。據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，胃癌的發(fā)病率和病死率分別位居全部癌癥的第5位和第4位[2]；我國胃癌發(fā)病率位居全部癌癥的第3位[3]。目前，關(guān)于胃癌的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，臨床治療以手術(shù)切除和放療、化療為主。建立可靠的胃癌動(dòng)物模型為運(yùn)用新方法、新手段、新藥物阻止胃癌進(jìn)程的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，能夠更好地將胃癌基礎(chǔ)研究和臨床治療相結(jié)合。

1 構(gòu)建胃癌模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和方法

構(gòu)建胃癌動(dòng)物模型可選用的動(dòng)物有兔子、大鼠、小鼠、裸鼠、犬及非靈長類動(dòng)物。構(gòu)建方法包括甲基硝基亞硝基胍灌胃化學(xué)誘導(dǎo)法、幽門螺桿菌感染等長期誘導(dǎo)法、基因工程造模法、免疫抑制法和快速移植法，其中快速移植法又分為原位移植和異位移植[4-9]。快速移植法、免疫抑制法經(jīng)注射人胃癌細(xì)胞或移植人新鮮胃癌組織塊得以實(shí)現(xiàn)，具有造模周期短且能保持人胃癌瘤體遺傳學(xué)特性的優(yōu)勢。人胃癌移植模型可模擬胃癌在人體中的發(fā)展，為胃癌治療藥物、發(fā)病機(jī)制、免疫學(xué)等研究提供動(dòng)物模型。

2 構(gòu)建胃癌模型裸鼠的選擇

鼠繁殖速度快，價(jià)格便宜，其基因與人類基因具有高度相似性，使得鼠成為構(gòu)建胃癌動(dòng)物模型的最優(yōu)選擇[10]。正常免疫胃癌鼠模型的構(gòu)建需要腹腔皮下注射阿糖胞苷，并使用射線照射以降低其免疫力[11]。研究表明，異源性腫瘤移植到正常大鼠體內(nèi)無法成瘤，而移植到胸腺切除大鼠體內(nèi)其腫瘤存活率增加[12]。裸鼠為無胸腺的先天性T細(xì)胞免疫缺陷鼠，因其T細(xì)胞無法發(fā)育成熟，機(jī)體對(duì)外源物質(zhì)的抑制作用及殺傷能力較弱，使其不排斥異種動(dòng)物組織移植，是構(gòu)建腫瘤疾病動(dòng)物模型的理想對(duì)象。裸鼠存活時(shí)間一般不超過25周，多選用4～8周齡、體質(zhì)量15～22g的裸鼠用于造模，因幼齡裸鼠免疫力過低、耐受力較弱，易發(fā)生死亡[13-15]。

3 人胃癌裸鼠移植模型的構(gòu)建

人胃癌裸鼠移植模型的構(gòu)建包括原位移植和異位移植。皮下移植和腹腔種植模型屬異位移植，皮下移植是異位移植中最常用的方法。原位移植包括胃癌細(xì)胞懸液胃壁種植和新鮮胃癌腫瘤組織塊胃壁移植。原位移植中使用的新鮮、完整的胃癌組織塊較少從人胃部腫瘤獲得，一般使用裸鼠皮下移植生長的腫瘤塊，因此皮下移植模型是原位移植實(shí)現(xiàn)的基礎(chǔ)，同時(shí)理想的胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型也依賴于原位移植模型的構(gòu)建才能得以實(shí)現(xiàn)。

3.1 構(gòu)建人胃癌裸鼠皮下移植模型

皮下移植瘤的構(gòu)建具有操作簡便、易于觀察成瘤情況、方便測量腫瘤大小等優(yōu)點(diǎn)，成為諸多胃癌研究者的首選造模方法。閆喜鳳等[16]使用人胃癌細(xì)胞MGC-803制備成細(xì)胞懸液并注射至裸鼠皮下，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞濃度低于1×105/ml時(shí)難以成瘤，濃度為1×107/ml時(shí)，裸鼠成瘤率為90%。馬嵋等[17]研究人胃癌細(xì)胞株BGC-823皮下移植瘤模型，分別用1×105/ml、1×106/ml、1×107/ml、5×107/ml四種濃度的細(xì)胞注射于裸鼠皮下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1×105/ml濃度的細(xì)胞無法成瘤，其他濃度的細(xì)胞成瘤時(shí)間為3～7d。應(yīng)用人胃癌細(xì)胞SGC-7901構(gòu)建胃癌模型，其細(xì)胞濃度≥3.5×105/ml時(shí)可成瘤[18]；應(yīng)用人胃癌細(xì)胞MKN-45構(gòu)建胃癌模型，一般使用1×107/ml的細(xì)胞濃度，按照0.2ml/只進(jìn)行注射成瘤[19]。賀巖等[20]用SGC-7901構(gòu)建裸鼠胃癌模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種5×108/ml、5×107/ml兩種濃度的細(xì)胞，注射0.2ml/只于裸鼠皮下時(shí)，7d可成瘤，21d時(shí)腫瘤出現(xiàn)出血和壞死，且經(jīng)過腹水接種的胃癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲力。人胃癌裸鼠皮下移植模型會(huì)隨其研究內(nèi)容的不同而使用不同的胃癌細(xì)胞株，注射細(xì)胞濃度也存在差異。因此，在構(gòu)建人胃癌裸鼠皮下移植模型研究新藥治療或構(gòu)建胃癌與其他疾病的復(fù)合模型時(shí)，應(yīng)充分考慮胃癌細(xì)胞的注射濃度，既要避免細(xì)胞濃度太低無法成瘤，亦要避免細(xì)胞濃度太高而導(dǎo)致瘤體在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)出血、壞死等。

3.2 構(gòu)建人胃癌裸鼠原位移植模型

原位移植能更好地模擬腫瘤在機(jī)體內(nèi)的侵犯、轉(zhuǎn)移、粘連、浸潤等情況，更真實(shí)地模擬胃癌影響人體各項(xiàng)指標(biāo)的變化[21]。研究發(fā)現(xiàn)，在胃部植入完整腫瘤組織比注射腫瘤細(xì)胞懸液具有更高的成瘤率[22]；直接注射法相比組織塊移植法，其生長速度更慢且發(fā)生轉(zhuǎn)移的情況遠(yuǎn)不如后者[23]。在此基礎(chǔ)上，研究者發(fā)現(xiàn)在將腫瘤細(xì)胞懸液、完整皮下腫瘤組織或原位胃腫瘤組織原位植入裸鼠胃部形成植入腫瘤三種構(gòu)建原位移植瘤的方法中，與其他模型相比，植入原位胃腫瘤組織的模型具有更好的生物學(xué)活性，更易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移[24]。裸鼠皮下生長出來的腫瘤組織塊有包膜包被會(huì)影響原位成瘤，因此應(yīng)盡量剔除其包膜結(jié)締組織，選取生長狀況良好的魚肉狀瘤組織作為原位移植的腫瘤組織源，從而增加原位成瘤率[25]。研究發(fā)現(xiàn)，將人體癌組織移植到裸鼠身上，接種一段時(shí)間后在裸鼠接種部位能夠發(fā)現(xiàn)可識(shí)別的腫瘤[26]。另有研究對(duì)胃癌患者的原發(fā)性腫瘤異位移植和胃癌細(xì)胞系的腫瘤標(biāo)本原位移植的腫瘤生長速率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)后者生長速度快且可重復(fù)，并可發(fā)生轉(zhuǎn)移[27]。

原位移植手術(shù)復(fù)雜，移植裸鼠生存率低，組織學(xué)完整的原位移植模型經(jīng)歷3個(gè)代表性階段，分別是縫合法、胃滑囊法、OB生物膠粘合法。為減少裸鼠胃部縫合、降低手術(shù)復(fù)雜性、減少對(duì)裸鼠的傷害，選擇輕微劃破胃壁黏膜后，使用OB生物膠將組織塊原位貼在裸鼠胃壁上的方法能增加裸鼠存活率；與傳統(tǒng)手術(shù)方法相比，該方法更易發(fā)生其他部位轉(zhuǎn)移[28]。研究者使用SGC-7901和MKN-45兩種不同的胃癌細(xì)胞株，利用OB生物膠技術(shù)建立裸鼠人胃癌原位移植模型，證實(shí)其生物學(xué)行為與人胃癌生長轉(zhuǎn)移的自然過程相似，該方法是目前腫瘤增殖轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究中的理想模型[29]。原位移植胃癌模型不便于觀察體內(nèi)腫瘤生長趨勢。為解決這一問題，研究者以膠原蛋白為支架，以表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的人胃癌細(xì)胞系BGC823-EGFP為種子細(xì)胞，體外構(gòu)建工程胃腫瘤，然后將工程腫瘤植入裸鼠胃中，可利用體內(nèi)熒光成像技術(shù)觀察腫瘤生長情況[30]。

3.3 構(gòu)建胃癌裸鼠腹腔移植和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型

張常華等[31]在構(gòu)建裸鼠胃癌腹腔種植瘤時(shí)分別選用人胃癌細(xì)胞AGS、NCI-N87和SNU16共3種細(xì)胞株進(jìn)行腹腔注射，每組8只裸鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射5×106個(gè)細(xì)胞時(shí)，其成瘤率分別為0、75%、25%。羅奮等[32]將胃癌細(xì)胞株SGC7901和MKN45注射到裸鼠后肢皮下后，將長出的新鮮瘤體制成腫瘤懸浮液并將其濃度調(diào)為1×106/ml、1×107/ml、1×108/ml，行腹腔直接注射和腹腔小切口注射2種不同接種方式構(gòu)建胃癌腹腔轉(zhuǎn)移模型，比較不同胃癌細(xì)胞、不同濃度、不同接種方式在腹腔內(nèi)的種植情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接注射比腹腔小切口注射更易發(fā)生腹壁種植，4周出現(xiàn)腹壁種植數(shù)比3周時(shí)多，相同時(shí)間內(nèi)高濃度比低濃度更易發(fā)生腹腔種植。劉福全等[33]建立胃癌肝轉(zhuǎn)移模型，從脾臟中央進(jìn)針5mm，將5×106/ml MKN-45或TMK-1癌細(xì)胞懸液注入脾臟被膜下，拔出針頭按壓止血，10min后夾閉，切除脾臟血管，觀察發(fā)現(xiàn)關(guān)腹后3周腫瘤轉(zhuǎn)移至肝邊緣，6周轉(zhuǎn)移病灶累及全肝。裸鼠在原位移植過程中發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移需要較長的周期[34]。閆銘霞等[35]建立裸鼠胃癌肝靶向高轉(zhuǎn)移模型，將組織學(xué)完整的MKN-45腫瘤組織塊移植到裸鼠胃部，按照胃原位移植→肝轉(zhuǎn)移→皮下擴(kuò)增→胃原位移植方法進(jìn)行反復(fù)篩選，得到胃癌肝靶向高轉(zhuǎn)移模型。目前系統(tǒng)的靶向胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型缺乏，其應(yīng)用受到一定限制。

4 小結(jié)

人胃癌裸鼠移植模型能保留胃癌瘤體在體內(nèi)生長的免疫學(xué)特性，不同濃度的不同人胃癌細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)生長狀況存在一定差異，皮下移植、原位移植及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移胃癌模型的構(gòu)建各有優(yōu)缺點(diǎn)，在造模過程中要求實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)自身研究內(nèi)容選用最優(yōu)的造模方法。在實(shí)驗(yàn)過程中如若只需檢測胃癌腫瘤組織中的基因、蛋白、腫瘤細(xì)胞表面抗原時(shí)，可采用皮下注射造模方法；如若需要檢測血液、肝、脾等非腫瘤種植部位某物質(zhì)含量的變化情況，應(yīng)采用原位移植法構(gòu)建遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移模型，將更加真實(shí)地模擬胃癌在人體發(fā)展過程中引起的相應(yīng)指標(biāo)的變化，為胃癌研究提供更加有價(jià)值的數(shù)據(jù)。

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（2022–10–17）

（2023–06–13）

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2020J01738）

王常松，電子信箱：fz_wcs@126.com

R-33；R735.2

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.19.028