何一秀,王梓良,朱亞非

(1.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科,浙江 杭州 310015;2.山西醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院 心外科,山西 太原 030001)

抗菌肽是存在于人體內(nèi)的、天然的具有多種生物學(xué)活性的小分子肽。迄今已有許多天然的抗菌肽被報(bào)道,其中LL-37是目前發(fā)現(xiàn)的唯一來(lái)源于人的組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)家族成員?，F(xiàn)已證實(shí),LL-37具有多種抗感染的生物學(xué)活性。本文著重針對(duì)LL-37在不同病毒發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起的作用,就目前研究的最新進(jìn)展進(jìn)行總結(jié),為研究抗病毒的發(fā)生發(fā)展和治療提供新的視角和思路。

1 LL-37的結(jié)構(gòu)與分布

LL-37于1995 年首次被發(fā)現(xiàn),主要由hCAP-18分解產(chǎn)生,后者主要由CAMP基因編碼,位于3號(hào)染色體的p21位點(diǎn)。該基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成,其中第4個(gè)外顯子編碼抗菌域[1-2]。LL-37包含C末端的抗菌結(jié)構(gòu)域和N 末端結(jié)構(gòu)域,其命名主要基于N 端前兩個(gè)氨基酸殘基為賴氨酸,且由37 個(gè)氨基酸殘基組成[1]。N端螺旋主要負(fù)責(zé)肽寡聚化、抗蛋白酶水解、趨化和溶血活性,而C端螺旋參與抗病原體作用[2]。C末端是形成肽四聚體的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),它有助于激活效應(yīng)細(xì)胞,并有利于與血清成分和細(xì)菌外壁相互作用,從而導(dǎo)致肽的滯留,降低其抗病原潛能。LL-37可表達(dá)于多種上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞,當(dāng)機(jī)體感染時(shí),它可以通過(guò)免疫細(xì)胞趨化作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放、補(bǔ)體系統(tǒng)參與、抑制細(xì)胞凋亡等進(jìn)行調(diào)控,是人體固有免疫中重要的多功能分子,在疾病的預(yù)防和控制中起著重要作用。

2 LL-37的生物學(xué)特性

2.1 免疫調(diào)節(jié)作用 LL-37可招募效應(yīng)細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞到炎癥灶中,通過(guò)免疫細(xì)胞受體的特定激活來(lái)調(diào)節(jié)獲得性免疫[3]。最初,中性粒細(xì)胞可合成不活躍的hCAP-18前體并儲(chǔ)存在次級(jí)顆粒中。通過(guò)損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern molecules,DAMPs)或病原相關(guān)分子模式(pathogenassociated molecular pattern molecules,PAMPs),激活Toll樣受體(Toll-like Receptor,TLRs)和/或細(xì)胞因子類型和水平的改變,可促進(jìn)細(xì)胞脫顆粒。在刺激下,hCAP-18被脫顆粒并釋放到細(xì)胞外[4]。此外,單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞被證明能表達(dá)LL-37。在炎癥過(guò)程中,LL-37可以誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖,顯著增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells,Tregs)的產(chǎn)生,減少外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)的促炎因子表達(dá)(如干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α);這表示當(dāng)肽發(fā)揮自身的抗感染特性時(shí),始終伴有控制性炎癥反應(yīng),以保護(hù)身體免受嚴(yán)重炎癥反應(yīng)的影響[5]。

2.2 抗內(nèi)毒素作用 LL-37可通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜來(lái)殺死病原體,并抑制病毒復(fù)制,還能與瀕死細(xì)菌釋放的各種成分結(jié)合,這些危險(xiǎn)分子可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,包括腫瘤壞死因子-α、白介素-8和誘導(dǎo)型一氧化氮,從而引發(fā)突然和夸大的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致宿主發(fā)病和死亡[6]。LL-37可抑制這種壓倒性的免疫反應(yīng),并通過(guò)中和其內(nèi)毒素活性來(lái)保護(hù)宿主免受脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)。像LL-37這樣的陽(yáng)離子肽,能夠抑制細(xì)菌LPS誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)的能力,很大程度上是通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的LPS結(jié)合[7]。

2.3 抗菌作用 在革蘭氏陽(yáng)性菌中,胞質(zhì)膜被一層厚的肽聚糖層包圍,而革蘭氏陰性菌胞質(zhì)膜被一層薄的肽聚糖層和一層外膜包圍,革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜都富含磷脂酰甘油、心磷脂和磷脂酰絲氨酸,這些磷脂具有帶負(fù)電荷的頭部基團(tuán),對(duì)帶正電荷的抗菌肽極具吸引力[8]。

Wang[2]研究發(fā)現(xiàn),在靜電作用下,LL-37 可與細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷的細(xì)菌結(jié)合,由線性結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槁菪Y(jié)構(gòu),可使細(xì)菌膜變薄、破裂,從而對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌產(chǎn)生廣譜抗菌活性。Wan等[9]研究發(fā)現(xiàn),LL-37可通過(guò)dTHP1細(xì)胞增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中IgG Fc受體清除細(xì)菌的能力,當(dāng)THP1 細(xì)胞在20 mL LL-37溶液中溫育8 h后,免疫球蛋白G可得到加強(qiáng),來(lái)調(diào)節(jié)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的吞噬能力。其次,LL-37 的構(gòu)象與其抗菌活性密切相關(guān),因LL-37 分子中的部分氨基酸具有雙親性螺旋結(jié)構(gòu),在疏水作用下易形成寡聚體。該寡聚體形式的α螺旋結(jié)構(gòu)與機(jī)體的抗體活性成正比,即α螺旋結(jié)構(gòu)的寡聚體越多,其抗菌活性越強(qiáng)[10]。

2.4 抗病毒作用 LL-37對(duì)多種病毒具有抗病毒活性,其抗病毒活性主要是通過(guò)與病毒外膜的相互作用介導(dǎo)[11]。

2.4.1 抗流感病毒 Barlow等[12]研究發(fā)現(xiàn),LL-37對(duì)流感病毒(influenza virus,IAV)感染的小鼠有保護(hù)作用,且這種抗病毒活性部分是由對(duì)病毒粒子的直接作用介導(dǎo)的,通過(guò)限制病毒復(fù)制和病毒誘導(dǎo)的炎癥在體內(nèi)促進(jìn)宿主對(duì)病毒的防御,且治療性使用LL-37能夠降低流感病毒感染的嚴(yán)重程度,其程度與目前人類一線治療藥物扎那米韋相似。LL-37與防御素不同的是,LL-37不會(huì)引起病毒聚集或改變上皮細(xì)胞對(duì)病毒的攝取,但可通過(guò)參與甲酰肽受體-2 (formyl peptide receptor 2,FPR-2)增加中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)和中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)對(duì)IAV的反應(yīng),并可能與LL-37在體內(nèi)IAV感染過(guò)程中的保護(hù)作用有關(guān)[13-14]。研究已發(fā)現(xiàn),在上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中LL-37的表達(dá)上調(diào)是維生素D依賴的[15]。因此,依賴維生素D上調(diào)LL-37可能有助于人體對(duì)病毒感染的保護(hù)作用。

2.4.2 抗呼吸道合胞病毒 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染是嬰兒,特別是早產(chǎn)兒呼吸道疾病的最常見原因之一,目前還沒(méi)有疫苗或具體有效的治療方法。在大多數(shù)兒童中,毛細(xì)支氣管炎是一種輕微的自限性感染,但有時(shí)也可能在嬰兒中進(jìn)展為呼吸衰竭[16]。

Currie等[17]研究發(fā)現(xiàn),在肺部RSV感染的小鼠模型中,外源性應(yīng)用LL-37在體內(nèi)對(duì)RSV介導(dǎo)的疾病具有保護(hù)作用;在健康的成人RSV感染模型中,較高的鼻腔LL-37水平與保護(hù)作用有關(guān);LL-37在體外可直接誘導(dǎo)病毒被膜的損傷,破壞病毒顆粒,減少病毒與人上皮細(xì)胞的結(jié)合和感染。LL-37水平較低的兒童更容易感染呼吸道合胞病毒,可能增加疾病的嚴(yán)重程度,并且住院時(shí)間更長(zhǎng)[18]?？梢?LL-37是抵抗呼吸道合胞病毒肺部感染的宿主防御的一個(gè)關(guān)鍵成分,起著第一接觸點(diǎn)抗病毒盾牌的作用,并在減少疾病后果的嚴(yán)重性方面具有額外的后期作用。

2.4.3 抗人類免疫缺陷病毒 先天免疫系統(tǒng)可構(gòu)成黏膜表面的第一道防線,在急性感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)時(shí)具有降低病毒載量的能力。Wong等[19]研究發(fā)現(xiàn),LL-37可以直接與HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合,以劑量依賴的方式阻斷其活性。而且,在單純皰疹病毒感染的上皮細(xì)胞中,通過(guò)誘導(dǎo)朗格漢斯細(xì)胞中HIV受體的上調(diào),發(fā)現(xiàn)LL-37與HIV感染風(fēng)險(xiǎn)的增加密切相關(guān)[20]。Tangpricha等[21]研究發(fā)現(xiàn),體外LL-37可抑制外周血單核細(xì)胞中的HIV復(fù)制,未接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的HIV感染患者與接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的HIV感染患者相比,血漿LL-37水平顯著降低,這表明抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療可能減少了HIV復(fù)制以提高血漿LL-37水平。然而,仍需進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)的體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以確定LL-37對(duì)HIV感染的有益效果。

2.4.4 抗丙型肝炎病毒 據(jù)估計(jì),全世界有1.6億多人長(zhǎng)期感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV),大多數(shù)情況下,HCV持續(xù)感染可導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生[22]。HCV是一種包膜病毒,這意味著病毒粒子含有脂質(zhì)雙層,可以作為L(zhǎng)L-37的靶標(biāo)。Matsumura等[23]研究發(fā)現(xiàn),LL-37在細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出抗HCV的特性,當(dāng)HCV與LL-37預(yù)先孵育并隨后用于感染HuH-7細(xì)胞時(shí),HCV滴度顯著降低。用BE-KO(載脂蛋白B和載脂蛋白E雙基因敲除)細(xì)胞進(jìn)行的體外研究表明, LL-37的表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)HCV的RNA水平?jīng)]有影響,反而顯著增加了細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的HCV感染滴度。這表明需要進(jìn)行劑量依賴性的研究,以了解LL-37在HCV復(fù)制中的抗病毒作用[24]。

2.4.5 抗單純皰疹病毒 單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)主要引起口腔皮膚或黏膜的感染,當(dāng)病毒感染眼睛(皰疹角膜炎),或侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)、損害大腦(皰疹腦炎)時(shí),就會(huì)發(fā)生更嚴(yán)重的疾病。免疫系統(tǒng)不成熟或受抑制的患者容易出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。

Roy等[25]研究發(fā)現(xiàn):人原代角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)LL-37處理1 h后,HSV-1 DNA滴度與未處理細(xì)胞比較顯著降低;在LL-37存在下感染HSV-1的角質(zhì)形成細(xì)胞顯示5個(gè)重要的干擾素刺激基因(IFIT1、OAS1、ISG20、IRF7和viperin)的表達(dá)增加,尤其是IRF7的表達(dá)顯著增加,而干擾素-β的表達(dá)降低;這表明在體外培養(yǎng)的LL-37處理的角質(zhì)形成細(xì)胞中,IRF7是抑制HSV-1復(fù)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn),LL-37在體外與病毒粒子預(yù)先孵育時(shí)可以抑制HSV-1感染,還可將角膜上皮細(xì)胞中的病毒滴度降低100倍以上[26]。Ron-Doitch等[27]還成功制備了含LL-37的聚乙二醇化脂質(zhì)體制劑,可以降低細(xì)胞毒性,并具有增強(qiáng)抗HSV-1的生物活性。因此,脂質(zhì)體LL-37可作為一種潛在的治療藥物用于預(yù)防HSV-1感染,然而,這種保護(hù)機(jī)制仍不清楚。

2.4.6 抗鼻病毒 人類鼻病毒(human rhinovirus,HRV)是病毒性呼吸道感染的最常見原因,雖然在具有免疫能力的宿主中,人鼻病毒感染是溫和而自限的,但人鼻病毒感染與嬰兒毛細(xì)支氣管炎、免疫抑制中的肺炎,以及既往存在的肺部疾病如哮喘或慢性阻塞性肺疾病的惡化有關(guān)[28]。

研究證明LL-37對(duì)HRV有很強(qiáng)的抗病毒活性,其主要作用機(jī)制是直接影響病毒;與健康細(xì)胞相比,較低濃度的LL-37(≤30 μg/mL) 可顯著降低感染細(xì)胞的代謝活性,而不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡或壞死[29]。Greiller等[30]研究發(fā)現(xiàn)維生素D誘導(dǎo)了LL-37和IkBa激酶的表達(dá),并降低了HRV對(duì)NF-kB驅(qū)動(dòng)基因的誘導(dǎo)作用,這表明維生素D可以增強(qiáng)對(duì)鼻病毒感染的抵抗力。肽基精氨酸脫氨酶(peptidyl arginine deaminase,PAD)可調(diào)節(jié)所有帶正電荷的精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸,導(dǎo)致LL-37對(duì)HRV的抗病毒活性顯著降低[31]。因此,靶向降低PAD酶可能有助于維持LL-37抗HRV感染的活性。

2.4.7 抗輪狀病毒 隨著衛(wèi)生條件的不斷改善,輪狀病毒成為發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家5歲以下兒童嚴(yán)重胃腸炎的病原體之一[32]。到目前為止,尚無(wú)治療輪狀病毒感染的特定藥物,而且在開發(fā)新的抗病毒藥物方面仍面臨許多重大挑戰(zhàn)。Hosseini等[33]研究體外LL-37對(duì)輪狀病毒感染的影響,發(fā)現(xiàn)在病毒暴露前用LL-37預(yù)處理細(xì)胞,可以劑量依賴的方式顯著減少感染性病毒粒子的產(chǎn)生,這可能與LL-37結(jié)合輪狀病毒受體,阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞有關(guān),也可能與LL-37促進(jìn)先天免疫反應(yīng)抑制輪狀病毒感染有關(guān)。

2.4.8 抗新型β-冠狀病毒 目前,新型β-冠狀病毒(SARS-CoV-2)可導(dǎo)致急性呼吸道疾病、肺炎的大流行,甚至死亡[34]。循證研究結(jié)果表明,血清25-羥基維生素D水平低與COVID-19疾病發(fā)病率或患病率的高風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)。維生素D可以上調(diào)幾種抗菌劑,包括LL-37,它可以直接或間接作用于SARS-CoV-2并阻止其復(fù)制,增加抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,降低促炎免疫反應(yīng)[35]。然而,還需要進(jìn)一步的隨機(jī)臨床研究來(lái)證明LL-37對(duì)SARS-CoV-2發(fā)病機(jī)制和預(yù)防的影響。

2.4.9 抗腸道病毒71型 腸道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原體,可導(dǎo)致患兒神經(jīng)系統(tǒng)和全身并發(fā)癥[36]。由于缺乏特效抗病毒藥物,迫切需要對(duì)EV71感染進(jìn)行有效的抗病毒治療。近期研究發(fā)現(xiàn),腸病毒71型感染顯著誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)干擾素-β,干擾素-β應(yīng)答在神經(jīng)細(xì)胞對(duì)抗腸病毒71型感染中起重要作用[37]。Yu等[38]測(cè)試了 LL-37是否能調(diào)節(jié)人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞中干擾素-β的表達(dá),發(fā)現(xiàn)U251細(xì)胞與LL-37共孵育后可顯著誘導(dǎo)基礎(chǔ)干擾素-β的表達(dá),并在EV71感染時(shí)輕度增強(qiáng)干擾素-β的表達(dá)。且LL-37能有效抑制EV71誘導(dǎo)的U251細(xì)胞的CPE和EV71復(fù)制,雖對(duì)EV71無(wú)直接滅活作用,但可有效調(diào)節(jié)干擾素-β和IL-6應(yīng)答,并顯著抑制病毒結(jié)合,可見該抗菌肽在抗EV71感染的抗病毒治療中是有一定潛力的。

3 展望

抗菌肽LL-37在治療或預(yù)防相關(guān)病毒方面,能發(fā)揮多大效果,取決于對(duì)這些肽具有抗病毒作用的機(jī)制、直接殺滅病毒的程度或通過(guò)調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)的程度,以及在動(dòng)物模型和人類疾病的體外觀察的生理相關(guān)性的深入理解。雖然目前研究還處于早期階段,但開發(fā)針對(duì)病毒和這些病原體的天然宿主反應(yīng)的新型干預(yù)措施具有很大潛力,這一領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)很可能會(huì)繼續(xù)快速出現(xiàn)。