李姣姣 趙永昌 武軍霞

原發(fā)性肝癌發(fā)病率在世界各國常見惡性腫瘤中位居前列,同時(shí)原發(fā)性肝癌也是癌癥死亡的第2大原因[1]。外科治療如射頻消融術(shù)、肝癌根治術(shù)等是原發(fā)性肝癌患者延長生存時(shí)間的重要方法,隨著精準(zhǔn)肝切除技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,護(hù)理水平的提高,肝癌根治術(shù)的價(jià)值越來越受到重視[2-3]。惡性胸腹水是肝癌切除術(shù)后的常見并發(fā)癥,胸腹水不僅增加患者的痛苦、影響患者的康復(fù),嚴(yán)重時(shí)還可能引起呼吸衰竭、肺部感染甚至威脅患者生命,并增加其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4-5]。目前國內(nèi)有關(guān)惡性胸腹水的研究較少,但有報(bào)道指出惡性胸腹水患者存在明顯的免疫抑制,自然殺傷(Natural killer, NK)細(xì)胞具有識(shí)別和清除變異細(xì)胞的作用,可用于腫瘤監(jiān)視[6-7]。本研究納入100例原發(fā)性肝癌根治術(shù)后胸腹水患者,觀察胸腹水T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞水平并探究其臨床意義。

資料與方法

一、一般資料

陜西省榆林市第二醫(yī)院收治的100例原發(fā)性肝癌根治術(shù)后胸腹水患者,納入時(shí)間2019年3月—2022年3月,男性58例、女性42例;年齡34～58歲,平均(44.1±8.8)歲?；颊呔显l(fā)性肝癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并嚴(yán)重心、腎等器官功能障礙;②合并神經(jīng)、免疫及血液系統(tǒng)疾病;③預(yù)計(jì)生存時(shí)間不足3個(gè)月;④妊娠或哺乳期婦女;⑤凝血功能障礙。胸腹水標(biāo)本經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查檢出惡性腫瘤細(xì)胞,穿刺活檢或手術(shù)病理學(xué)診斷為惡性腫瘤,符合其中任意一條則診斷為惡性胸腹水,不符合任意一條則診斷為非惡性胸腹水,根據(jù)胸腹水良惡性將患者分為惡性組(24例)和非惡性組(76例)。患者及家屬知情同意,研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-23號(hào))。

二、指標(biāo)檢測(cè)

采集患者胸腹水5 mL,將其置于肝素抗凝管中保存,上下顛倒使之混合均勻,之后在30 min內(nèi)處理標(biāo)本。另取一支流式管,分別向其中加入CD3、CD4、CD8(鼠抗人單克隆抗體,均購自上海信裕伊赫生物科技有限公司),各10 μL,已經(jīng)過熒光素標(biāo)記,之后取胸腹水標(biāo)本700 μL加入流式管中,混合均勻后,在避光、室溫環(huán)境下孵育1 h。對(duì)肝素抗凝管中余下的胸腹水進(jìn)行離心處理。將紅細(xì)胞裂解液和三蒸水以1∶9的比例進(jìn)行配制,將配置完成的紅細(xì)胞裂解液1000 μL加入流式管中,10 min混勻,離心后去上清液,將管口吸干。向流式管中加入PBS緩沖液3 mL,混合均勻后在室溫環(huán)境下離心處理,離心后去上清液,將管口吸干。最后將300 μL PBS緩沖液加入流式管中,立即送檢,使用貝克曼FC500流式細(xì)胞儀檢測(cè)胸腹水CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+表達(dá)。收集胸腹水單個(gè)核細(xì)胞于1.5 mL滅菌EP管中,離心后去上清,加入培養(yǎng)基、重懸,之后依次進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、質(zhì)控,并檢測(cè)NK細(xì)胞表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組T淋巴細(xì)胞亞群與NK細(xì)胞水平比較

與非惡性組相比,惡性組CD3+、CD3+CD4+、NK細(xì)胞水平較低,CD3+CD8+細(xì)胞水平較高(P<0.05),見表1。原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水、非惡性胸腹水CT圖像見圖1。

A:原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水CT圖像,B:原發(fā)性肝癌根治術(shù)后非惡性胸腹水CT圖像

表1 兩組T淋巴細(xì)胞亞群與NK細(xì)胞水平(±s)比較

二、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK細(xì)胞水平診斷原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水的ROC分析

經(jīng)ROC分析,CD3+≤69.2%、CD3+CD4+≤70.8%、CD3+CD8+≥31.5%、NK≤22.1%是原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水的最佳截?cái)嘀?P<0.05,表2);CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK細(xì)胞水平診斷原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水的ROC曲線見圖2。

圖2 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、NK細(xì)胞水平診斷原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水的ROC曲線

表2 CD3+、CD3+CD8+、NK細(xì)胞水平診斷原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水的ROC分析

三、原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水風(fēng)險(xiǎn)與T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞水平的相關(guān)性分析

原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水風(fēng)險(xiǎn)與CD3+、CD3+CD4+、NK細(xì)胞水平成負(fù)相關(guān)(r=-0.625、r=-0.517、r=-0.573,P<0.05),與CD3+CD8+水平呈正相關(guān)(r=0.582,P<0.05)。

討 論

作為惡性腫瘤的一種常見并發(fā)癥,惡性胸腹水也是許多中晚期癌癥患者的常見臨床表現(xiàn),也是惡性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的常見表現(xiàn)[9-11]。T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞,在機(jī)體識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞方面具有重要作用,胸腹水中通常聚集了大量淋巴細(xì)胞,主要為CD4+T細(xì)胞亞群,而NK細(xì)胞也參與了胸腹水的發(fā)生和發(fā)展[12-13]。

本研究結(jié)果顯示,與非惡性組相比,惡性組CD3+、CD3+CD4+、NK細(xì)胞水平較低,CD3+CD8+細(xì)胞水平較高,提示與非惡性胸腹水患者相比,惡性胸腹水患者存在嚴(yán)重T淋巴細(xì)亞群失調(diào)。T淋巴細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)和患者自身免疫耐受中具有關(guān)鍵作用[14]。T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+、CD8+在抗腫瘤免疫中具有不同的作用。CD4+能夠同時(shí)誘發(fā)自身免疫、產(chǎn)生腫瘤免疫。CD8+具有殺傷作用,直接接觸到腫瘤細(xì)胞后,CD8+能夠釋放細(xì)胞毒性物質(zhì),如顆粒酶、穿孔素等,這些毒性物質(zhì)可作用于靶細(xì)胞使之發(fā)生溶解,CD8+釋放的細(xì)胞因子還能在一定程度上誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[15]。惡性胸腹水是其他部位腫瘤向胸腹膜轉(zhuǎn)移或腫瘤直接侵襲胸腹膜造成,胸腹水中通常存在大量CD4+細(xì)胞,輔助T淋巴細(xì)胞1(Helper T lymphocyte 1, Th1)的抗腫瘤免疫作用主要是通過大量釋放γ干擾素(Interferon-γ, IFN-γ)實(shí)現(xiàn)的[16]。研究顯示[17],與結(jié)核性胸腹水相比,惡性胸腹水中IFN-γ的表達(dá)水平顯著較低,結(jié)核性胸腹水微環(huán)境的免疫應(yīng)答接近Th1類淋巴細(xì)胞,有利于清除病原菌。與之相比,惡性胸腹水患者雖然受到腫瘤相關(guān)炎癥的影響也存在CD4+細(xì)胞聚集情況,但更傾向于Th2類,未能充分發(fā)揮CD4+細(xì)胞的免疫功能,為腫瘤細(xì)胞的侵襲和逃避免疫識(shí)別創(chuàng)造了條件。

NK細(xì)胞在過去的研究中多被用于各種肝細(xì)胞癌、肝炎的診斷和鑒別,能用于反映患者的細(xì)胞免疫平衡狀態(tài)。此外,作為一種廣譜殺傷性細(xì)胞,NK細(xì)胞具有識(shí)別并清除變異細(xì)胞的作用,但許多研究顯示[18-19],原發(fā)性肝癌等腫瘤患者機(jī)體中的NK細(xì)胞功能多處于受損狀態(tài),因此NK細(xì)胞的功能減弱多被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的原因之一。NK細(xì)胞中CD56dimNK亞群是發(fā)揮細(xì)胞毒性功能的主體,本研究中惡性胸腹水的NK細(xì)胞比例低于非惡性胸腹水,其原因可能為CD56dimNK亞群的比例降低,并且CD56dimNK亞群比例降低也是惡性胸腹水患者免疫功能減弱的原因之一。

綜上,原發(fā)性肝癌根治術(shù)后惡性胸腹水患者存在明顯的免疫功能低下,主要表現(xiàn)為CD3+、CD3+CD4+、NK細(xì)胞比例的下調(diào)和CD3+CD8+細(xì)胞比例的上調(diào),原發(fā)性肝癌患者發(fā)生惡性胸腹水的風(fēng)險(xiǎn)越高,此外與非惡性胸腹水相比,惡性胸腹水免疫功能紊亂更嚴(yán)重,臨床可參考以上指標(biāo)對(duì)惡性胸腹水進(jìn)行篩查。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。