汪增秀 趙宏宇 吳衛(wèi)鋒 宋金云

外泌體是一種直徑30～150 nm雙磷脂膜囊泡,攜帶著大量的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物活性成分,存在于各種體液中,包括血液、尿液、唾液、乳汁、腦脊液、胸腔積液、羊水和腹水等[1]。外泌體作為一種信息交流的媒介,將攜帶的mRNA、miRNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種組分傳遞至近鄰細胞,通過體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)到達身體其他細胞和組織中,影響靶細胞的生物活性,并可影響多種生理和病理過程[2]。

“不明原因肝病”是指肝功能生化指標反復(fù)異常(一般持續(xù)6個月以上),或肝臟影像學(xué)檢查異常,甚至發(fā)展為肝硬化等病變,無法通過病史詢問、體格檢查和血清學(xué)檢查等常規(guī)診療手段明確病因。不明原因肝病病因繁多,主要以非感染因素為主,如自身免疫性肝炎(AIH)、原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)、藥物性肝損傷(DILI)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)及其他系統(tǒng)疾病累及肝臟等[3]。肝穿刺活組織檢查是確認不明原因肝病原因的金標準,但是肝穿刺活檢的有創(chuàng)性使得該診斷方法在效率上仍受到限制。大量研究顯示,外泌體可能參與了不明原因肝病的發(fā)生和發(fā)展過程。目前,尿液中的外泌體被認為是非侵入性的分子生物標志物,血液中的外泌體被認為是微創(chuàng)分子生物標志物,有可能代替以往的肝穿刺活組織檢查技術(shù),用于不明原因肝病的早期檢測和預(yù)后。另外,外泌體及其攜帶組分參與了肝細胞的修復(fù)、再生和遷移等生理過程,因此可能是不明原因肝病的潛在治療手段和治療靶點。以下簡要概述外泌體在不明原因肝病的發(fā)生和發(fā)展中的作用。

一、泌體形成過程與組成成分

(一)外泌體形成過程 首先在胞吞作用下,細胞膜內(nèi)陷形成包含細胞表面蛋白與細胞外環(huán)境成分(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、代謝物、小分子和離子)的杯狀結(jié)構(gòu),早期核內(nèi)體形成。早期核內(nèi)體還可以與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和反式高爾基體融合,所以一些早期核內(nèi)體可能包含不同起源的膜和管腔成分。早期核內(nèi)體成熟,形成晚期核內(nèi)體。晚期核內(nèi)體通過二次內(nèi)陷,形成腔內(nèi)小囊泡。腔內(nèi)小囊泡不斷累積并逐漸成熟,最終形成包含一定數(shù)量和大小不一小囊泡的多泡體。多泡體可以通過細胞骨架和微管網(wǎng)絡(luò)運輸?shù)郊毎?與細胞膜融合,最終釋放出外泌體。另外,多泡體可以與溶酶體或自噬體融合后降解,降解產(chǎn)物可由細胞回收[4]。

(二)外泌體組成成分 外泌體包含不同類型的細胞表面蛋白質(zhì)、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、RNA、DNA、氨基酸和代謝物等成分。四跨膜蛋白家族(CD9、CD81和CD63)、脂筏標記蛋白(flotillin)、凋亡轉(zhuǎn)接基因2互作蛋白X(ALIX)、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、神經(jīng)酰胺是外泌體的標志蛋白質(zhì)。多種細胞可分泌外泌體,如間充質(zhì)干細胞(MSC)、腫瘤細胞、人羊膜上皮細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元細胞、肥大細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及T淋巴細胞等[5]。

(三)外泌體功能 外泌體作為細胞間通信的關(guān)鍵介質(zhì),能夠輸送核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)到靶細胞,在抗原呈遞、炎癥、血管形成、細胞凋亡等生物過程中發(fā)揮作用,從而維持正常生理過程和介導(dǎo)病理過程,包括癌癥、感染、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病及自身免疫性疾病等[6-10]。

二、外泌體在不明原因肝病中的作用

肝臟是人體新陳代謝的重要器官,參與機體的再生、凝血、免疫、解毒、三大物質(zhì)代謝、生物轉(zhuǎn)化和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、存儲等功能。肝臟細胞既可以分泌外泌體,同時也是自身分泌的和其他組織細胞產(chǎn)生的外泌體的作用靶點。以肝臟細胞為靶點的外泌體廣泛參與了不明原因肝病的多項生物學(xué)進程,與不明原因肝病的發(fā)生和發(fā)展均有密切聯(lián)系。

(一)外泌體與AIH AIH是一種由免疫介導(dǎo)的攻擊自身健康肝細胞而引起的慢性肝臟實質(zhì)性炎癥,臨床特征為血清轉(zhuǎn)氨酶異常升高、自身抗體(主要為抗核抗體、抗平滑肌抗體及抗肝腎微粒體抗體等)陽性、免疫球蛋白和γ球蛋白水平升高。肝組織學(xué)特征為肝小葉內(nèi),肝細胞存在不同程度的界板炎,以及所謂的“玫瑰花結(jié)”樣肝細胞變性團。AIH如果不治療,將可進展為肝硬化和肝衰竭[11]。雖然使用皮質(zhì)類固醇是AIH的常見治療方法,但一些AIH患者對皮質(zhì)類固醇治療反應(yīng)嚴重,一些康復(fù)患者在停止使用類固醇后可能會產(chǎn)生嚴重的不良反應(yīng)或者疾病復(fù)發(fā)[12]。因此,需要新的替代療法用于AIH 的治療。

由于MSC具有較強的分化能力、低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能,常被用于組織修復(fù)和炎癥性疾病的治療[13]。有研究發(fā)現(xiàn),MSC通過其分泌的外泌體靶向恢復(fù)肝臟穩(wěn)態(tài),并使肝細胞修復(fù)和再生,可能具有治療肝臟疾病的特性[14]。MiR-223-3p(曾稱為MiR-223)是骨間充質(zhì)干細胞(BMSC)中表達最高的miRNA,可以負向調(diào)節(jié)許多炎癥基因的表達,在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。在肝抗原S100誘導(dǎo)的小鼠AIH實驗?zāi)Ｐ椭?BMSC來源的外泌體作為載體,遞送miR-223,可減輕AIH 引起的肝損傷,這可能與外泌體miR-223能夠降低NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)及 caspase-1蛋白的表達有關(guān)[15]。另一項研究也發(fā)現(xiàn)BMSC外泌體能夠與miR-223-3p成功結(jié)合,并將miR-233-3p輸送到巨噬細胞,同時對巨噬細胞無毒性作用。用攜帶 miR-223-3p 的BMSC外泌體治療S100/CFA 誘導(dǎo)的AIH小鼠,可以減輕AIH小鼠肝臟的炎癥反應(yīng)及巨噬細胞中的炎性細胞因子釋放。其機制可能與 miRNA-223-3p 介導(dǎo)的 STAT3 基因和炎性細胞因子(IL-1β 和 IL-6)表達的調(diào)節(jié),以及 Treg/Th17升高有關(guān)[16]。在炎癥相關(guān)細胞中,巨噬細胞在AIH的觸發(fā)和過程中起主導(dǎo)作用。由于外泌體作為一種具有高生物相容性和低免疫原性的藥物載體,而地塞米松(DEX)又是一種強效抗炎藥,所以Zhao J等結(jié)合外泌體和DEX的優(yōu)勢,構(gòu)建了攜帶DEX的外泌體(Exo@DEX)。研究發(fā)現(xiàn),Exo@DEX可以在刀豆蛋白 A誘導(dǎo)的AIH小鼠肝臟中大量累積,有效地內(nèi)化到巨噬細胞中,并且對巨噬細胞具有顯著的抑制作用,進而對刀豆蛋白A誘導(dǎo)的AIH小鼠肝臟具有有效的保護作用。該研究發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)的DEX治療相比,MSC衍生的外泌體作為DEX載體給藥,對AIH具有更好的治療效果[17]。這些研究結(jié)果表明,外泌體可能為AIH的治療提供一定的方向和依據(jù)。

(二)外泌體在PBC和PSC中的作用 PBC以前稱為原發(fā)性膽汁性肝硬化,是一種以肝內(nèi)中小膽管的非化膿性進行性破壞性損傷為特征的慢性肝內(nèi)膽汁淤積性疾病,最終可發(fā)展至肝硬化。PBC多見于中老年女性,其發(fā)病機制可能與遺傳、環(huán)境及免疫等因素有關(guān)?？咕€粒體抗體是PBC的特異性標志物,且PBC最典型的臨床癥狀為乏力、瘙癢、黃疸及消化不良[18]。PSC也是一種慢性膽汁淤積性病變的自身免疫性肝病,其主要特征為特發(fā)性肝內(nèi)外膽管炎癥和纖維化,進而導(dǎo)致多灶性膽管狹窄,最終可發(fā)展為肝硬化和肝衰竭。PSC多見于中青年男性,主要癥狀表現(xiàn)為乏力、瘙癢、骨質(zhì)疏松和脂溶性維生素缺乏等,其病因可能與感染、腸毒素吸收、遺傳、免疫及膽管缺血等因素有關(guān)[19]。研究發(fā)現(xiàn),從PBC患者血漿中分離出的外泌體雖然不會改變細胞因子的產(chǎn)生,但它們確實顯著改變抗原呈遞細胞上的共刺激分子表達,如CD14+單核細胞上的CD86表達上調(diào),以及CD11c+樹突狀細胞的CD40表達上調(diào)。這些共刺激分子在調(diào)節(jié)T細胞活化中發(fā)揮不同的作用,可能參與PBC的發(fā)病機制[20]。Liu R等研究發(fā)現(xiàn),PBC、PSC患者的血清外泌體H19水平顯著上調(diào),通過real-time PCR、western blot、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析小鼠和人PSC/ PBC肝臟樣本,發(fā)現(xiàn)肝H19水平與肝纖維化的嚴重程度密切相關(guān)。肝星狀細胞(HSC)在膽汁淤積性肝病進展中起著關(guān)鍵作用,體外實驗發(fā)現(xiàn)富含H19的外泌體能夠增強小鼠原代HSC的轉(zhuǎn)分化,并促進HSC衍生的成纖維細胞的增殖。體內(nèi)實驗表明在膽汁淤積條件下,膽管細胞來源的富含H19的外泌體快速且優(yōu)先被HSC及HSC衍生的成纖維細胞吸收,然后通過上調(diào)成纖維細胞的纖維化基因表達,從而促進肝纖維化。這項研究表明,膽管細胞源性外泌體H19可以作為膽汁淤積性肝纖維化的潛在診斷標志物和治療靶點[21]。膽管細胞衰老是PBC和PSC的重要病理過程。Chen W等將氧化應(yīng)激刺激的膽管細胞類器官與人胎盤間充質(zhì)干細胞(hPMSC)衍生的外泌體共培養(yǎng),使用免疫組織化學(xué)、免疫熒光染色及ELISA等試驗分析,發(fā)現(xiàn)hPMSC衍生的外泌體治療可延緩膽管樣衰老進程并降低SASP成分和趨化因子的表達,如CCL2、CX3CL1、IL-6、TNF-a、CXCL1和CXCL10,表明hPMSC衍生的外泌體可能對PSC或PBC具有治療潛力[22]。這些研究結(jié)果表明,外泌體既可以作為PSC或PBC微創(chuàng)分子生物標志物,也可能是PSC或PBC的潛在治療靶點。

(三)外泌體與DILI DILI是指由藥物本身,如化學(xué)藥物、傳統(tǒng)中藥、保健品等,及其中間代謝產(chǎn)物所誘發(fā)的肝損害[23]。由于DILI無特異的臨床表現(xiàn),診斷困難,多通過測定患者肝功能指標、常規(guī)影像學(xué)檢查及肝活檢來輔助診斷。近年來,一些研究認為外泌體可能作為潛在分子生物標記物,用于DILI的早期檢測、監(jiān)測和評估。乙酰氨基酚(APAP)引起的急性肝衰竭是DILI和死亡的主要原因。在APAP-DILI的SD大鼠中,循環(huán)miR-122的數(shù)量增加,并且miR-122主要存在于外泌體中。此外,當(dāng)人原代肝細胞暴露于10mM APAP 24 h后,外泌體中miR-122的水平明顯增加[24]。在另一項研究中,APAP給藥能顯著提高外泌體中miR-122、miR-192和miR-155的表達量,這三種外泌體miRNA可以反映肝細胞損傷情況[25]。Zheng等對苦楝水提取物(FMT)暴露的小鼠血清循環(huán)外泌體中的miRNA進行差異表達分析,發(fā)現(xiàn)外泌體miR-370-3p是變化最顯著的miRNA。外泌體miR-370-3p通過升高p21和細胞周期蛋白E,從而加重中藥的細胞毒性作用,提示外泌體miRNA參與了中藥肝損傷的發(fā)病機制[26]。這些研究表明,外泌體中miRNA可以作為診斷DILI的生物標記物。除了miRNA,血液中外泌體mRNA,如白蛋白(Alb)、纖維蛋白原Bβ-多肽(Fgb)、結(jié)合珠蛋白(Hp)和β-肌動蛋白(Actb),鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白),β多肽2樣蛋白1(Gnb2l)和血漿視黃醇結(jié)合蛋白4(Rbp4)等均可作為DILI的生物標記物[27,28]。在DILI小鼠模型中,APAP治療影響了138種外泌體蛋白的豐度,如CES1、ADH1、GST、APOA1、ALB、HP和FGB蛋白,外泌體蛋白的表達水平與APAP劑量和暴露時間有關(guān)。這些研究表明血液中除了外泌體miRNA和mRNA外,外泌體蛋白也可以作為DILI的敏感生物標記物[29]。此外,研究還發(fā)現(xiàn),來源于 MSC和肝細胞的外泌體能夠促進肝臟再生,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),減少肝細胞凋亡,可以作為DILI的潛在治療藥物和靶點[30]。Tan CY等通過不同的給藥途徑將外泌體與CCl4同時引入小鼠模型,發(fā)現(xiàn)MSC衍生的外泌體通過促進肝細胞的增殖,增加細胞核抗原(PCNA)、細胞周期蛋白D1和細胞周期蛋白E的表達,逆轉(zhuǎn)CCl4誘導(dǎo)的損傷。體內(nèi)研究表明,在APAP和H2O2引起的損傷后,MSC來源的外泌體可以通過上調(diào) Bcl- xL 抑制 APAP誘導(dǎo)的肝細胞凋亡蛋白表達,通過激活增殖和再生反應(yīng)來引發(fā)針對毒物誘導(dǎo)的損傷的肝保護作用[31]。大多數(shù)藥物誘導(dǎo)的肝損傷是由肝臟的適應(yīng)性免疫攻擊引起的。Holman NS等通過聚合物沉淀法從原代人肝細胞的條件培養(yǎng)基中分離出外泌體,然后用肝細胞來源的外泌體(HDE)處理THP-1單核細胞,并用LPS刺激,發(fā)現(xiàn)HDE能夠?qū)е翷PS誘導(dǎo)的IL-1β 和IL-8水平顯著降低。另外,通過差異表達基因發(fā)現(xiàn),HDE導(dǎo)致72個轉(zhuǎn)錄本減少,其中許多轉(zhuǎn)錄本涉及免疫功能。在這些差異表達基因中第二豐富的信號通路是“先天免疫細胞和適應(yīng)性免疫細胞之間的通信”,表明先天免疫細胞(如單核細胞)內(nèi)的變化可能影響適應(yīng)性免疫反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)表明,在DILI中,HDE能夠被單核細胞吸收并傳遞功能性miRNA,這些調(diào)節(jié)性miRNA和其他外泌體內(nèi)容物靶向多種免疫介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物,并抑制LPS刺激的細胞因子釋放,從而促進肝臟的免疫耐受[32]。

(四)外泌體與NAFLD NAFLD是指排除飲酒史或酒精攝入過多、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷等所導(dǎo)致的肝臟疾病,其主要病理特征為肝細胞的脂肪蓄積和大泡性脂肪變。NAFLD包括單純性脂肪肝(NAFL)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 到肝硬化及肝癌的一組疾病[33]。外泌體對脂質(zhì)代謝具有顯著影響,包括脂質(zhì)的合成、運輸和降解[34]。將帶有miR-199a-5p的外泌體遞送到高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪變性模型小鼠中,發(fā)現(xiàn)小鼠肝細胞中的脂質(zhì)積聚加重,同時伴有肝哺乳動物不育系 20 樣激酶 1(MST1)表達的下調(diào),最終加劇肝細胞中脂質(zhì)的積累[35]。AMPKα1是調(diào)節(jié)白色脂肪組織中外泌體合成、組成成分和脫落的關(guān)鍵分子。Yan C 等發(fā)現(xiàn)AMPKα1基因敲除增加了來源于脂肪細胞的外泌體的脫落,并促進了CD36在外泌體中的積累,然后含CD36的外泌體被肝細胞內(nèi)吞,誘導(dǎo)脂質(zhì)積聚和炎癥。另外高脂飲食可減弱脂肪細胞中的AMPKα1,從而誘導(dǎo)外泌體分泌,增強了白色脂肪組織與肝臟之間的通信,促使了NAFLD的發(fā)生[36]。在NAFLD患者的血清中 miR-192-5p 水平與疾病進展呈正相關(guān),且M1巨噬細胞(CD11b+/CD86+)激活是 NAFLD 進展中的重要過程。Liu XL等發(fā)現(xiàn)在高脂、高膽固醇飲食喂養(yǎng)的大鼠中,血清miR-192-5p水平、M1巨噬細胞數(shù)量及肝臟促炎因子的表達水平與疾病進展相關(guān)。脂毒性肝細胞分泌富含miR-192-5p的外泌體,該外泌體能夠促進M1巨噬細胞活化,增加誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、IL-6和TNF-α的表達。另外,肝細胞源性的外泌體miR-192-5p抑制雷帕霉素不敏感伴隨物(Rictor)的表達,進一步抑制Akt和叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1(FoxO1)的磷酸化水平,導(dǎo)致FOXO1的激活,最終誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),從而推動NAFLD的進展,表明血清外泌體miR-192-5p可以作為NAFLD的潛在無創(chuàng)生物標志物和治療靶點[37]。脂肪毒性和巨噬細胞介導(dǎo)的炎癥在NASH的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。Zhao Z等使用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和甲基-β-環(huán)糊精(MβCD)膽固醇處理Huh7細胞,發(fā)現(xiàn)膽固醇減少了溶酶體的數(shù)量,抑制多泡體在溶酶體的降解,促進Huh7細胞釋放含有miR-122-5p的外泌體。外泌體miR-122-5p誘導(dǎo)巨噬細胞M1極化及相關(guān)炎癥,促進了NASH的發(fā)生與發(fā)展[38]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)參與調(diào)節(jié)脂代謝穩(wěn)態(tài),ER應(yīng)激引起脂質(zhì)代謝功能障礙,導(dǎo)致肥胖誘導(dǎo)的肝脂肪變性進展為NASH。Gu H等利用重組慢病毒載體基因沉默方法和基于LC-MS/MS的蛋白質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué),發(fā)現(xiàn)ER應(yīng)激誘導(dǎo)的脂肪細胞分泌外泌體(ATEx)能夠協(xié)調(diào)肝臟中的脂質(zhì)動態(tài)變化。ATEx通過向肝細胞遞送外泌體醛酮還原酶1b7(Akr1b7)并升高甘油水平觸發(fā)NASH的發(fā)生[39]。IL-6誘導(dǎo)巨噬細胞和中性粒細胞(盡管程度較小)釋放富含miR-223的外泌體,然后外泌體miR-223轉(zhuǎn)移到肝細胞,抑制具有PDZ結(jié)合序列的轉(zhuǎn)錄共活化因子(TAZ)、Nlrp3、C-X-C基序趨化因子10(Cxcl10)及胰島素樣生長因子1受體(Igf1r)的表達,這幾種miR-223靶向促纖維化基因具有促進NASH纖維化作用,從而為NAFLD的治療提供了新思路[40]。這些研究都表明,外泌體作為細胞間信息交流載體,推動了NAFLD進展,臨床上可將其作為NAFLD治療中的重要靶點。

三、展望

基于目前研究,外泌體攜帶miRNA、mRNA、lncRNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等多種物質(zhì),在肝內(nèi)進行細胞間通信,轉(zhuǎn)運各種信號分子,是細胞之間進行生命活性物質(zhì)交換的重要載體。外泌體因其具有運輸性質(zhì)、循環(huán)能力及優(yōu)異的生物相容性,可作為一種理想的藥物載體,遞送多種藥物、蛋白質(zhì)、核酸和基因治療劑,以提高靶向準確性,同時降低最小劑量和不良反應(yīng),為疾病診斷和治療創(chuàng)新提供新的機遇。雖然國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對外泌體的靶向給藥、分子標志物及發(fā)病機制等方面進行了研究,但是外泌體的臨床應(yīng)用外尚未展開,故外泌體在不明原因肝病中的發(fā)展空間巨大。隨著研究的進一步深入,外泌體將會為不明原因肝病的預(yù)防、診斷、治療提供新的方法和策略。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。