◎ 袁 平 ，汪恩婷， 趙壯志， 沈 銳， 趙旭東， 李庭行，覃馨玉

（1.重慶市永川食品藥品檢驗所，重慶 402160；2.重慶市計量質(zhì)量檢測研究院，重慶 402160）

1 鑒別

1.1 樣品處理

樣品50 g放入燒杯，分別加入乙酸鋅溶液及亞鐵氰化鉀溶液各5 mL搖勻，沉淀靜置1 h過濾，用快速濾液來分別進行鑒別。

1.2 濃鹽酸鑒別法

用蘸有濃鹽酸的玻璃棒靠近加熱分解的樣品，如果樣品含有尿素，則會發(fā)出NH4Cl白煙。

1.3 濃硝酸鑒別法

濾液加濃硝酸 50滴，混勻放置 5～10 min，若有白色結(jié)晶產(chǎn)生就證明存在尿素。

1.4 硫酸銅鑒定法

濾液20～50 mL放入燒杯，用水20 mL溶解之后過濾，濾液放在電爐上加熱，冷卻之后，加入100 g /L 氫氧化鈉溶液10滴，攪拌均勻，接著加入100 g /L的硫酸銅溶液1滴，若出現(xiàn)紫色，證明含有尿素[1]。

1.5 強堿鑒定法

取5 mL濾液加100 g /L氫氧化鈉溶液5 mL，用電爐加熱沸騰1 min，如果出現(xiàn)氨味，則證明含有尿素。

2 二乙酰一肟分光光度計法

2.1 原理

試樣采用蛋白質(zhì)沉淀劑去蛋白，用活性炭脫色，二乙酰一肟與尿素在酸性條件下，經(jīng)過催化進行縮合，在硫氨脲作用下，生成4，5-二甲基-2-1咪唑化合物，于525 nm的吸光度與尿素含量成正比，用分光光度計進行檢驗，外標(biāo)法定量。

2.2 試劑

除特殊注明外，所有試劑均為分析純，水為超純水。冰乙酸；濃硫酸；磷酸：85%；乙酸鋅；亞鐵氰化鉀；硫氨脲；硫酸高鐵銨；二乙酰一肟；乙酸鋅溶液（106 g/L)，亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L)：酸性試劑；二乙酰一肟溶液（20 g/L)；二乙酰一肟顯色液；尿素標(biāo)液（1 g/L）； 尿素工作標(biāo)液：分別為0、20、40、80、100、150、200、300 μg/mL的工作標(biāo)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 儀器

分光光度計；振蕩器；水浴鍋。

2.4 分析步驟

2.4.1 樣品前處理

根據(jù)尿素含量稱取試樣1～10 g(精確到0.0002 g)于100 mL燒杯之中，加入2.5 g活性炭，再加入乙酸鋅溶液及亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，用250 mL容量瓶定容至刻度，攪拌均勻，用快速濾紙過濾，收集濾液作為樣品處理液[2]。

2.4.2 樣品測定

吸取不同濃度尿素工作標(biāo)液各10 mL，分別置于50 mL比色管中，加入10 mL二乙酰一肟顯色液，于95 ℃水浴中加熱20 min（小心搖動4～5次），用中速濾紙過濾，以尿素濃度為零的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作參比，于波長525 nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取樣品處理液供試溶液10 mL于50 mL比色管中，操作步驟同上。

2.4.3 結(jié)果計算和表述

式中：X1為試樣中尿素的含量，mg/kg；c為由試樣吸光度按標(biāo)準(zhǔn)曲線求得尿素的量，mg；m1為取5 mL試樣液相當(dāng)試樣的質(zhì)量，g。

3 二甲胺基苯甲醛分光光度計法

3.1 原理

對二甲胺基苯甲醛與尿素可形成有顏色的復(fù)合物，該復(fù)合物420 nm處可用紫外分光光度進行定量比色，從而計算出尿素的含量[3]。

3.2 儀器

同2.3。

3.3 試劑

DMAB（對二甲胺基苯甲醛）顯色劑，稱取16 g DMAB于1000 mL甲醇中，再加入100 mol/L鹽酸；參比溶液 2 mg尿素/10 mL。

3.4 分析步驟

3.4.1 樣品前處理

同2.4.1。

3.4.2 樣品測定

吸取不同濃度尿素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各5 mL，分別置于25 mL比色管中，加入5 mL DMAB顯色劑。制備一空白對照液，吸取5 mL 溶液和5 mL磷酸緩沖液于25 mL比色管中。將所有比色管輕輕充分搖動并置于25 ℃水浴中放置10 min。用空白對照調(diào)節(jié)吸光度0點。用1 cm比色杯于420 nm處讀取各溶液的吸光度值。用吸光度對尿素濃度做譜圖，得出一條直線，準(zhǔn)確吸取樣品處理液供試溶液5 mL于20 mL比色管中，余下操作同上述步驟。每組樣品均應(yīng)帶一參比標(biāo)準(zhǔn)（5 mL參比溶液和5 mL 溶液）及一個空白對照液，并于25 ℃水浴中放置100 min。接著，以空白對照液為對照，讀取420 nm的吸光度[4]。

3.4.3 結(jié)果計算和表述

式中：X2為試樣中尿素的含量，mg/kg；c為由試樣吸光度按標(biāo)準(zhǔn)曲線求得尿素的量，mg；m2為取5 mL試樣液相當(dāng)試樣的質(zhì)量，g。

4 液相色譜法

4.1 原理

試樣用1%乙酸提取，占頓醇熒光衍生化，液相色譜-熒光檢測器測定，外標(biāo)法定量。

4.2 試劑和材料

甲醇，色譜純；三氯甲烷，色譜純；乙酸，色譜純；鹽酸；辛烷基磺酸鈉；占頓醇（CAS號90-46-0，純度大于99%）；1%乙酸溶液；1%鹽酸溶液；20 mmol/L辛烷基磺酸鈉水溶液；占頓醇衍生劑；尿素標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于99%；標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)；標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.3 儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀，配有熒光檢測器；組織搗碎機；均質(zhì)器；渦旋混合器；離心機。

4.4 試樣的制備與保存

樣品約500 g，搗碎，混勻，分為2份，裝入潔凈容器，密封，并注明標(biāo)記，于-18 ℃冷凍保存。

4.5 測定步驟

4.5.1 提取

稱取試樣5 g于50 mL具塞離心管之中，加入20 mL 1%乙酸溶液，均質(zhì)2 min，以3000 r/m離心3 min，提取上清液，過濾。在盛有殘渣的離心管中加入20 mL 1%乙酸溶液，均質(zhì)2 min，再離心過濾。合并提取液用水定容50 mL，混勻，待衍生。

4.5.2 衍生化

準(zhǔn)確吸取0.5 mL提取液和各級標(biāo)準(zhǔn)工作液（0. 2、2、20、200、l 000 mg/L)，分 別加入2 mL進樣瓶中，依次加入0.4 mL甲醇，50 μL 占頓醇衍生劑和50 μL 1%鹽酸溶液，蓋緊瓶蓋，混勻，衍生5 min，過0.22濾膜后，供HPLC測定。

4.5.3 測定

4.5.3.1 色譜條件

色譜柱C18柱，長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 mm；柱溫：35 ℃；流動相：20 m辛烷基磺酸鈉水溶液+乙腈；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：激發(fā)波長213 nm，發(fā)射波長308 nm。

4.5.3.2 定量測定

將衍生后的標(biāo)準(zhǔn)工作液按濃度由低到高依次進樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進行定量。在上述色譜條件下，尿素衍生物的參考保留時間約為8.0 mm[5]。

4.5.3.3 空白實驗

除不加試樣外，按上述測定步驟進行。

4.5.4 結(jié)果計算和表述

用色譜數(shù)據(jù)處理機或按下列計算試樣中尿素的殘留量：

式中：X3為試樣中尿素含量，mg/kg；A為樣液中尿素衍生物的峰面積；Cs為標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生物的濃度，μg/mL；V為樣液最終定容體積，mL；As為標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生物的峰面積；m4為稱樣量，g；20為稀釋倍數(shù)。

5 尿素酶滴定法

5.1 原理

樣品在偏酸性的條件下，所含尿素被尿素酶分解為銨鹽，用酸滴定，從而得出尿素的含量[5]。

5.2 試劑

尿素酶，0.25 g尿素于40～45 ℃在1 h之內(nèi)完全分解，按照產(chǎn)品說明保存； 0.02 mol/L及0.1 mol/L鹽酸；0.1 mol/L氫氧化鈉。

5.3 試驗方法

稱取樣品0.5 g于高型燒杯之中，加入50 mL水，用塑料薄膜封口，超聲提取20 min。將高型燒杯放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊滴加0.1 mol/L鹽酸（或者氫氧化鈉溶液）中和至pH=4.0，加入0.2 g粉碎較細的尿素酶，立即用薄膜封口，置于50 ℃水浴中不時搖晃，30 min后取出冷卻到室溫，邊攪拌邊用0.1 mol/L鹽酸滴定至pH=4.0，記錄0.1 mol/L鹽酸消耗體積V1，同時做空白試驗，記錄消耗的0.1 mol/L體積V0。

5.4 結(jié)果計算

式中：60.06為尿素的相對分子質(zhì)量；X4為試樣中尿素含量，g/kg；V1為樣品滴定消耗鹽酸體積，mL；C2為鹽酸標(biāo)液的濃度，mol/L；V0為空白消耗鹽酸體積，mL；m5——稱樣量，g。