馬孟丹，尚夢宇，劉宇辰

（1 深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院，深圳市第二人民醫(yī)院，深圳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，廣東 深圳 518035； 2 廣東省泌尿生殖腫瘤系統(tǒng)生物學(xué)與合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518035； 3 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 515041； 4 深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518060）

CRISPR?Cas 系統(tǒng)是生物體內(nèi)一種RNA 引導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，利用RNA 來引導(dǎo)Cas 蛋白對目標(biāo)基因結(jié)合并剪切。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種天然存在的CRISPR?Cas 系統(tǒng)，其中2 類系統(tǒng)只需要引導(dǎo)RNA及Cas蛋白即可完成對靶點(diǎn)的切割，其中最早發(fā)現(xiàn)的Cas9 是目前最廣泛使用的Cas 效應(yīng)子，此外還有可以靶向DNA 的Cas12 和靶向RNA 的Cas13。由RNA 引導(dǎo)的核酸酶系統(tǒng)的可編程性大大增加了它的功能和使用場景，通過對Cas蛋白進(jìn)行修飾改造，CRISPR 系統(tǒng)除用于基因剪切外還可在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)翻譯水平進(jìn)行調(diào)控，基因組成像，單/多堿基編輯以及甲基化、乙?；缺碛^遺傳水平的修飾（圖1），這些功能在疾病治療的研究與臨床應(yīng)用中極具潛力。CRISPR?Cas 系統(tǒng)被稱為革命性的“基因剪刀”技術(shù)，為癌癥研究和治療帶來了新的曙光［1］，該系統(tǒng)已被研究人員用于研究癌癥發(fā)生機(jī)制、發(fā)現(xiàn)耐藥相關(guān)基因，并開展與細(xì)胞信號通路、細(xì)胞功能基因組學(xué)、藥物研發(fā)、預(yù)測細(xì)胞對藥物的反應(yīng)，以及癌癥治療等相關(guān)工作。

圖1 CRISPR?Cas系統(tǒng)衍生工具的應(yīng)用Fig. 1 Application of CRISPR?Cas system derivatives

為了解決現(xiàn)有的臨床問題，許多研究使用CRISPR 技術(shù)建立細(xì)胞、類器官和動物癌癥模型［2?3］，探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，篩選耐藥細(xì)胞株［4?5］以及全基因組篩選腫瘤耐藥相關(guān)基因。該技術(shù)可高特異性地篩選靶向藥物，從而提高基因治療和免疫細(xì)胞治療對癌癥患者的療效［6?12］。本文將著重介紹CRISPR?Cas9系統(tǒng)及其衍生工具在腫瘤生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中的研究現(xiàn)狀及潛力。

1 基礎(chǔ)研究

通過基因測序和全基因組篩選，識別癌癥患者中常見的突變基因，利用CRISPR?Cas 技術(shù)進(jìn)行基因敲除、敲入、激活或抑制來模擬腫瘤基因突變，有助于我們快速、準(zhǔn)確地建立相關(guān)的細(xì)胞或動物模型，用于研究遺傳決定因素和腫瘤發(fā)展的潛在機(jī)制。

1.1 疾病模型構(gòu)建

1.1.1 細(xì)胞模型

細(xì)胞模型具有較短的實(shí)驗(yàn)周期和清晰的背景，并且易于提供結(jié)果。成神經(jīng)細(xì)胞瘤是一種在兒童中發(fā)病率較高的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，George 等［13］為了研究成神經(jīng)細(xì)胞瘤的不良預(yù)后與ATRX突變的關(guān)系，利用CRISPR?Cas9 技術(shù)，通過同源基因靶向，生成具有ATRX突變的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，并利用這些細(xì)胞模型設(shè)計(jì)了可能用于治療成神經(jīng)細(xì)胞瘤的創(chuàng)新方法。骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，現(xiàn)有化療藥物預(yù)后較差［14］，開發(fā)新的治療策略來改善治療效果和提高患者生存率十分重要。研究人員采用CRISPR?Cas9 技術(shù)實(shí)現(xiàn)敲除骨肉瘤細(xì)胞系KHOS 和U?2OS 中CDK11基因表達(dá)，細(xì)胞增殖和侵襲能力顯著減弱［15］。從而證明CRISPR?Cas9 靶向敲除CDK11基因?yàn)橐环N骨肉瘤的潛在治療方案。根據(jù)不同的研究目的，利用CRISPR?Cas9技術(shù)在編輯腫瘤細(xì)胞模型上對腫瘤細(xì)胞采取不同的編輯策略，通過建立新的腫瘤細(xì)胞模型，闡明發(fā)病機(jī)制，探討藥物作用機(jī)制，檢驗(yàn)體外治療效果。

1.1.2 類器官模型

類器官是一種利用成體干細(xì)胞或組織中衍生的、在體外培育而成、具備三維結(jié)構(gòu)的微器官，可以發(fā)展成類似于完整器官體內(nèi)解剖和生理的結(jié)構(gòu)。類器官培養(yǎng)提供了研究人類發(fā)育和疾病發(fā)生過程的潛力［16］。

腦瘤是最致命和最具破壞性的癌癥之一，但由于基因異質(zhì)性和缺乏模型，腦瘤的研究一直受到阻礙［17］。Bian團(tuán)隊(duì)［18］建立了一種新的腦腫瘤類器官（neoCOR）模型，在該模型中，利用轉(zhuǎn)座子和CRISPR?Cas9 技術(shù)將致癌突變引入類器官，再現(xiàn)了腦腫瘤的發(fā)展過程。該模型的建立補(bǔ)充了目前腦腫瘤生物學(xué)中的基礎(chǔ)和臨床前研究模型。此外，為了探索乳腺癌的病因，Dekker 等［19］利用Cas9 敲除乳腺祖細(xì)胞中P53、Pten、RB1和NF1四個乳腺癌相關(guān)基因。隨后，將突變后的腫瘤類器官移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些突變的乳腺類器官獲得了可以被長期培養(yǎng)的能力，形成雌激素受體陽性的腔內(nèi)腫瘤，并對化療藥物敏感。這些具有腫瘤特征的類器官模型的開發(fā)為腫瘤生物學(xué)的進(jìn)一步研究提供了一種新的途徑。

1.1.3 動物模型

動物模型可以反映腫瘤生長情況，更方便、快速地檢測潛在的腫瘤和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，探索腫瘤免疫逃逸、耐藥等機(jī)制，成為臨床前藥物試驗(yàn)的主要工具。除了利用CRISPR?Cas 實(shí)現(xiàn)胚系突變外，也將構(gòu)建好的質(zhì)粒原位導(dǎo)入動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生原位腫瘤模型［20］。Yang等［21］通過在小鼠受精卵中共注射Cas9 mRNA 和不同sgRNA，生成了在Nanog、Sox2和Oct4基因中攜帶標(biāo)簽或熒光報(bào)告結(jié)構(gòu)的小鼠模型以及Mecp2條件突變小鼠。Xue等［22］在野生型小鼠體內(nèi)使用流體動力注射將表達(dá)Cas9 和sgRNA 的質(zhì)粒遞送到肝臟，直接靶向腫瘤抑制基因Pten和P53誘導(dǎo)肝腫瘤，為肝癌模型和功能基因組學(xué)的快速發(fā)展提供了新的途徑。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種癌癥相關(guān)的突變基因，但由于患者之間存在個體差異，研究它們?nèi)绾斡绊戵w內(nèi)腫瘤的生長和擴(kuò)散仍是一個挑戰(zhàn)。建立能夠穩(wěn)定維持腫瘤細(xì)胞特性的動物模型，有利于進(jìn)一步研究腫瘤生長微環(huán)境，探索基因突變機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上篩選或研發(fā)靶向藥物。

1.2 腫瘤機(jī)制研究

利用CRISPR?Cas 技術(shù)可研究腫瘤發(fā)生機(jī)制，如單核苷酸突變、染色體異位事件和其他因素在腫瘤發(fā)展中的作用；此外，它還可用于腫瘤細(xì)胞中功能基因的篩選。這些基因關(guān)聯(lián)與腫瘤發(fā)生過程中發(fā)生的基因功能變化相對應(yīng)，從而有助于研究疾病機(jī)制［23］。

大量研究表明，在良性腫瘤中，血管生成罕見，血管生長緩慢；相反，大多數(shù)惡性腫瘤表現(xiàn)出致密的血管生成和快速的血管生長［24］。因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，抑制這一過程將顯著阻止腫瘤組織的發(fā)展、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移?？寡苌莎煼ǎˋTT）已經(jīng)成功地用于抑制腫瘤的異常血管生成，然而，惡性腫瘤往往表現(xiàn)出對ATT 的耐藥，CRISPR?Cas9 技術(shù)用于研究腫瘤血管生成的機(jī)制和耐藥的可能原因［25?26］。He 等［26］使用基于三維微載體的細(xì)胞培養(yǎng)和CRISPR?Cas9 進(jìn)行混合遺傳篩選，揭示了血液內(nèi)皮細(xì)胞（EC）對廣泛使用的AAT 貝伐單抗耐藥反應(yīng)的分子修飾機(jī)制。ARID1A 突變是人類癌癥中最常見的分子畸變之一，但其致癌機(jī)制尚不清楚。Lo 等［27］在TP53?/?的人胃器官中建立了ARID1A 敲除的缺陷模型，這些工程化的ARID1A缺陷器官反映了ARID1A突變型胃癌的臨床病理特征，結(jié)合基于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析和高通量藥物篩選，發(fā)現(xiàn)了ARID1A在胃上皮癌發(fā)生中的潛在機(jī)制。

CRISPR 衍生物也在癌癥研究中發(fā)揮了重要作用。當(dāng)失活的Cas9（dCas9）蛋白與轉(zhuǎn)錄激活物或抑制蛋白結(jié)構(gòu)域融合后，其隨后與sgRNA 序列結(jié)合靶向基因的上游調(diào)控區(qū)域，使得轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體能夠有效地控制基因的表達(dá)水平，進(jìn)而探索其功能。構(gòu)建靶向全基因組gRNA 文庫，利用dCas9與轉(zhuǎn)錄激活蛋白的協(xié)同活性上調(diào)全基因組表達(dá)，可用于高通量、快速的功能獲取篩選。單堿基編輯器，主要包括胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE），其用于產(chǎn)生多個DNA損傷響應(yīng)基因的單核苷酸突變，導(dǎo)致細(xì)胞在DNA 損傷發(fā)生時發(fā)生適應(yīng)性變化，以篩選和識別DNA 損傷響應(yīng)［28］。

2 腫瘤治療

癌癥是一種基因組疾病，其特征是整體基因組不穩(wěn)定、大量積累的點(diǎn)突變和腫瘤進(jìn)展中的結(jié)構(gòu)變化。這些基因組突變可能產(chǎn)生腫瘤抗原，這些抗原可能被免疫系統(tǒng)識別為非自身抗原，從而引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，免疫系統(tǒng)在免疫監(jiān)測中起著至關(guān)重要的作用，來自適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和先天免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞滲透到腫瘤微環(huán)境（TME）中，幫助調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展［29］。免疫細(xì)胞療法在治療癌癥方面表現(xiàn)出了優(yōu)異的療效，多種免疫細(xì)胞療法在臨床試驗(yàn)中得到了成功的驗(yàn)證［30］。CRISPR?Cas 系統(tǒng)作為一種新興的基因編輯技術(shù)，用于靶向敲除腫瘤免疫檢查點(diǎn)分子或進(jìn)行快速簡單的基因編輯，大大降低了腫瘤免疫治療的操作難度，促進(jìn)了該領(lǐng)域研究的發(fā)展。

2.1 免疫治療

2.1.1 過繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移療法（ACT）

ACT 用于從腫瘤患者體內(nèi)分離免疫活性細(xì)胞，擴(kuò)增后在體外確定它們的功能，并將其送回患者體內(nèi)，直接殺死腫瘤或激發(fā)免疫反應(yīng)，最終殺死腫瘤細(xì)胞［31］。最廣泛使用的ACT 技術(shù)包括嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞治療和使用CRISPR?Cas9技術(shù)設(shè)計(jì)的T 細(xì)胞受體（TCR）T 細(xì)胞治療［32?33］。該技術(shù)是最成熟和廣泛應(yīng)用的免疫細(xì)胞治療，在體內(nèi)和體外均顯示出良好的靶向性［34］。

CAR?T 細(xì)胞療法通過識別膜表面抗原工作，對血液腫瘤非常有效［35］。放療聯(lián)合CAR?T 細(xì)胞治療可提高治療效果［32］。許多臨床試驗(yàn)已經(jīng)或正在進(jìn)行中，以解決CAR?T 細(xì)胞在血液系統(tǒng)惡性腫瘤或?qū)嶓w瘤患者中的安全性、可行性和有效性。CAR?T 細(xì)胞治療已被證明對血液瘤有效，因?yàn)檠毫黾?xì)胞有一個獨(dú)特靶點(diǎn)CD19，可用來引導(dǎo)CAR?T 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)并摧毀癌細(xì)胞［36］。Zhang 等［37］利用非病毒系統(tǒng)CRISPR?Cas9 對整合位點(diǎn)進(jìn)行切割產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB），通過HDR 對其進(jìn)行修復(fù)，HDR 以包含CAR 序列的外源DNA 供體為模板，該供體上有匹配整合位點(diǎn)上下游的序列，因此，HDR 修復(fù)斷裂DNA 的同時會將CAR 序列定點(diǎn)整合進(jìn)T 細(xì)胞基因組。利用Cas9 同源定向修復(fù)技術(shù)精準(zhǔn)敲除PD1，首次生成非病毒、基因特異性靶向CAR?T 細(xì)胞，并在臨床試驗(yàn)表明以這種方式生成的CAR?T 細(xì)胞是安全的，在接受治療患者中未觀察到CAR?T 治療相關(guān)的神經(jīng)毒性和2 級以上的細(xì)胞因子釋放綜合征。此外，這種新型CAR?T 療法在難治性復(fù)發(fā)性淋巴瘤患者中顯示出卓越的治療效果，完全緩解率為87.5%，客觀緩解率高達(dá)100%。

CAR?T 對實(shí)體瘤的作用低于血液惡性腫瘤，Larson 等［38］通過CRISPR 全基因組篩選發(fā)現(xiàn)，在GBM 中，γ?干擾素受體（IFN?γR）信號通路是CAR?T 細(xì)胞充分黏附所必需的，該基因的缺失將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對CAR?T 細(xì)胞的殺傷更具耐藥性，為CAR?T 治療實(shí)體瘤提供新的方法。目前，自體CAR?T 治療已取得了臨床和商業(yè)上的成功。開發(fā)更多靶點(diǎn)是使患者受益，擴(kuò)大其應(yīng)用價值的重要策略之一。此外，通用CAR?T 治療是CAR?T 未來的一個重要方向，這些領(lǐng)先的技術(shù)更多地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品，將為患者提供更廣泛的治療選擇［39］。

同樣，TCR?T 療法在黑色素瘤和滑膜肉瘤的臨床試驗(yàn)中取得了重大突破，在治療其他晚期實(shí)體瘤方面也取得了初步療效［40］。Stadtmauer 等［41］使用CRISPR?Cas9 敲除了T 細(xì)胞中的3 個基因，分別是：T 細(xì)胞受體α（TCRα）基因和T 細(xì)胞受體β（TCRβ）基因，這兩個基因編碼內(nèi)源性TCR 鏈；PDCD1，一個基因編碼細(xì)胞死亡蛋白1（PD?1）的基因。并插入了一種癌癥特異性TCR轉(zhuǎn)基因NYESO-1。因此，修飾后的T 細(xì)胞被命名為NYCE（NY?ESO?1transduced CRISPR 3X edited cells）。最終，經(jīng)過4 輪編輯后，T 細(xì)胞被注射回病人體內(nèi)并保持長達(dá)9個月的修飾。結(jié)果表明這種方法免疫原性較低，并證明了CRISPR 基因編輯在癌癥免疫治療方面應(yīng)用的可行性。我們相信，將TCR 轉(zhuǎn)移和基因組編輯技術(shù)相結(jié)合，有望開發(fā)出更有效、更安全的癌癥免疫療法。

2.1.2 抗腫瘤抗體的導(dǎo)向治療

抗腫瘤抗體的導(dǎo)向治療是以抗腫瘤抗體為載體，結(jié)合具有細(xì)胞毒作用的物質(zhì)，通過載體與腫瘤相關(guān)抗原的免疫蛋白結(jié)合，提高腫瘤內(nèi)藥物濃度的一種治療方法。免疫檢查點(diǎn)分子是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)激活與抑制之間平衡的關(guān)鍵因子。癌細(xì)胞通常通過上調(diào)免疫檢查點(diǎn)分子來逃避免疫監(jiān)視，因此，阻斷這一過程可以顯著增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。PD?1 和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA?4）是眾所周知的免疫檢查點(diǎn)，可以顯著抑制T細(xì)胞的活性，從而使腫瘤細(xì)胞容易逃離機(jī)體的免疫機(jī)制，這導(dǎo)致T 細(xì)胞治療效果不佳［42］。通過使用CRISPR?Cas9基因編輯技術(shù)敲除參與免疫負(fù)調(diào)節(jié)的基因，也可以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫應(yīng)答。例如，使用靶向基因編輯技術(shù)敲除免疫檢查點(diǎn)是提高CAR?T治療實(shí)體腫瘤療效的一種很有前途的策略［42］。此外，Lu 等［43］在CRISPR?Cas9 基因編輯T 細(xì)胞治療晚期非小細(xì)胞肺癌患者的首個人類Ⅰ期臨床試驗(yàn)中證明了這種靶向免疫治療在臨床上是可行的。同樣，Si 等［44］對造血祖細(xì)胞激酶1（HPK1）在調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能障礙中的作用及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜合研究中發(fā)現(xiàn)，在多種血液和實(shí)體瘤小鼠模型中，以嵌合介導(dǎo)的HPK1降解為靶點(diǎn)的基因缺失、藥物抑制或蛋白水解增強(qiáng)了CAR?T 細(xì)胞為基礎(chǔ)的免疫治療的療效。HPK1 是改善免疫治療的一個有吸引力的藥物靶點(diǎn)。CRISPR?Cas9 技術(shù)制備的CD?19 HPK1KOCAR?T 細(xì)胞已用于臨床試驗(yàn)，這是世界上第二次通過基因編輯技術(shù)改善T細(xì)胞功能的臨床探索的一部分。

2.2 靶向致癌病毒感染

CRISPR?Cas9系統(tǒng)在細(xì)菌適應(yīng)性免疫中具有抗病毒作用，因此其在防御和清除受感染病毒方面具有巨大潛力，使用可特異性識別病毒基因組的Cas9?sgRNA，直接靶向致癌病毒基因或維持病毒復(fù)制所需的基因，導(dǎo)致病毒基因組發(fā)生突變并抑制致癌病毒基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌發(fā)生的主要原因，HPV 致癌基因尤其是E7 是預(yù)防和治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)，研究人員使用由非病毒載體PBAE546 和靶向HPV16 E7 的CRISPR?Cas9 重組質(zhì)粒組成的納米顆粒（NP），治療HPV 感染和相關(guān)宮頸惡性腫瘤。結(jié)果表明NP 在裸鼠中顯著抑制源自宮頸癌細(xì)胞系的異種移植瘤的生長，并顯著逆轉(zhuǎn)HPV16 轉(zhuǎn)基因小鼠的宮頸上皮惡性表型［45］。

除HPV 外，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染則是肝細(xì)胞癌（HCC）最常見的危險(xiǎn)因素。HBV表面抗原（HBsAg）高表達(dá)水平與肝癌發(fā)生和HBV 相關(guān)HCC 發(fā)展高度相關(guān)。研究人員設(shè)計(jì)了靶向HBV 基因組開放閱讀框preS1/preS2/S 的特異性單導(dǎo)RNA（sgRNAs），并使用CRISPR?Cas9 系統(tǒng)建立HBsAg 敲除HCC 細(xì)胞系。結(jié)果表明敲除HCC細(xì)胞系中的HBsAg 降低了HBsAg 的表達(dá)，并顯著減弱了HCC的體外增殖和體內(nèi)致瘤性［46］。然而，盡管這一策略可有效控制和清除致癌病毒，但除了CRISPR?Cas9基因編輯技術(shù)的遞送載體限制外，病毒靶點(diǎn)的高度變異性也對這些治療方法提出了挑戰(zhàn)。

2.3 基因治療

在體外改造T 細(xì)胞療法之外，使用CRISPR 基因編輯直接靶向驅(qū)動癌癥的變異基因是一個吸引人但非常困難的挑戰(zhàn)。理論上，通過CRISPR 基因編輯直接糾正驅(qū)動癌癥的基因變異，或者殺死產(chǎn)生特定基因變異的癌細(xì)胞，可以達(dá)到抑制腫瘤生長的效果。然而，這一策略需要克服多重障礙，包括完成腫瘤特異性療法遞送，以及需要達(dá)到高效率的基因編輯。

目前的臨床前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些腫瘤特異性基因編輯的策略?；蚓€路是合成生物學(xué)中的重要部分，由各種調(diào)控元件（包括特異性的啟動子、增強(qiáng)子、邏輯門等元件）和被調(diào)控的基因組合而成的遺傳裝置，通過構(gòu)建基因線路使細(xì)胞在特定情況下調(diào)節(jié)信號通路。目前常用的CRISPR 控制系統(tǒng)包括光學(xué)基因開關(guān)進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因活性［47］、基于蛋白質(zhì)的信號傳感器［48］以及RNA 信號傳感器--核糖開關(guān)，由RNA 順式調(diào)節(jié)模塊組成，通過感測細(xì)胞內(nèi)特定的小信號分子來操縱目標(biāo)基因的表達(dá)。已經(jīng)通過整合適體進(jìn)行了廣泛的工程化，適體通過配體與適體結(jié)合時產(chǎn)生的變化觸發(fā)“開”或“關(guān)”信號。受核糖開關(guān)和反義RNA 調(diào)節(jié)裝置的啟發(fā)，在sgRNA 中引入核糖開關(guān)模塊，它的5'端也包含一個反義RNA 區(qū)域。整合核糖開關(guān)特性的sgRNA允許整個CRISPR系統(tǒng)獲得感知相關(guān)配體的能力，以調(diào)節(jié)CRISPR 系統(tǒng)的“開?關(guān)”。

Liu 等［49］創(chuàng)建了基于CRISPR?Cas9 的信號傳導(dǎo)體，以響應(yīng)外部或內(nèi)部感興趣的信號，調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄。在缺乏特異性信號的情況下，原sgRNA 的引導(dǎo)區(qū)與設(shè)計(jì)的反義莖配對，不能與目標(biāo)DNA 結(jié)合，一個特定的外源小分子或者內(nèi)源蛋白質(zhì)信號可以結(jié)合到適體，誘導(dǎo)構(gòu)象改變，允許sgRNA 的間隔序列去結(jié)合對應(yīng)的DNA 序列而影響另一個信號的轉(zhuǎn)錄。這些裝置可以用來構(gòu)造所有基本類型的布爾邏輯門，在哺乳動物細(xì)胞中執(zhí)行邏輯信號操作，而不需要多層的遺傳線路；還可以通過構(gòu)建連接不同信號通路的合成鏈接來重新連接細(xì)胞信號。此外，這種方法可以通過控制同時的雙向（ON?OFF）基因轉(zhuǎn)錄來重定向致癌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞命運(yùn)的重編程。

Liu 等［50］將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動子和人uroplakinⅡ基因的膀胱特異性啟動子（hUPⅡ）結(jié)合（圖2），該基因線路需要兩個啟動子，當(dāng)且僅當(dāng)兩個啟動子同時作用時，目的基因才能進(jìn)行表達(dá)，為定向治療癌細(xì)胞提供了高效且具有針對性的方案。經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化，UPⅡ和TERT 啟動子被它們各自的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件所取代（圖3）。C?Myc 和Get1 僅在膀胱癌細(xì)胞中同時有較高水平的表達(dá)。在sgRNA1 和sgRNA2 的初始表達(dá)后，它們可以進(jìn)一步結(jié)合各自轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游，通過正反饋機(jī)制分別擴(kuò)增c?Myc 和Get1 的轉(zhuǎn)錄信號，從而擴(kuò)增其下游基因的轉(zhuǎn)錄，與傳統(tǒng)的基因線路相比，微基因線路顯示出更高的癌癥識別和干預(yù)能力，可用于一體化AAV 載體的體內(nèi)癌癥基因治療［51］。

圖2 與門遺傳電路的設(shè)計(jì)與構(gòu)建［50］（a）hUPⅡ和hTERT 啟動子是線路的輸入端。hUPⅡ啟動子驅(qū)動Cas9 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，hTERT 啟動子連接靶向LacI 的sgRNA 的轉(zhuǎn)錄。輸出基因由LacI控制的CMV 啟動子驅(qū)動。效應(yīng)子只有在Cas9蛋白和sgRNA 同時存在時才能表達(dá)。（b）～（e）是合成線路（SC?1，SC?2，SC?3和SC?4）的示意圖。輸出基因分別為hRluc、hBAX、p21和E-cadherinFig. 2 Design and construction of the AND gate genetic circuits[50](a) The hUPⅡ and hTERT promoters are the inputs to the circuit. The hUPⅡ promoter drives the transcription of Cas9 mRNA and the hTERT promoter is linked to the transcription of sgRNA targeting LacI. The output gene is driven by a LacI?controlled CMV promoter. The effector can be expressed only when both Cas9 protein and sgRNA are presented. (b)～(e) are schematic representations of the synthetic circuits (SC?1, SC?2, SC?3 and SC?4). The output genes were hRluc, hBAX, p21 and E-cadherin.

圖3 與門微型基因線路的設(shè)計(jì)與構(gòu)建［51］UPⅡ啟動子驅(qū)動了Cas9 mRNA的轉(zhuǎn)錄，而TERT啟動子被用來促進(jìn)以LacI為目標(biāo)的sgRNA的轉(zhuǎn)錄。輸出的Renilla熒光素酶基因由LacI控制的CMV啟動子調(diào)節(jié)。僅在UPⅡ啟動子和TERT啟動子都被激活時，熒光素酶基因才被表達(dá)。在迷你基因線路的設(shè)計(jì)中，UPⅡ和hTERT啟動子被各自的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件所取代，c?Myc和Get1僅在膀胱癌細(xì)胞中同時有較高的表達(dá)水平。sgRNA1和sgRNA2初始表達(dá)后，進(jìn)一步結(jié)合自身轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，通過正反饋機(jī)制擴(kuò)增c?Myc和Get1的轉(zhuǎn)錄信號，分別擴(kuò)增其下游基因的轉(zhuǎn)錄，此外，LacI基因被sgRNA2敲除，熒光素酶報(bào)告基因被轉(zhuǎn)錄激活。而在正常膀胱上皮細(xì)胞中，熒光素酶不能有效轉(zhuǎn)錄，并被背景水平表達(dá)的微量LacI進(jìn)一步沉默F(xiàn)ig. 3 Design and construction of the AND gate minigene circuits[51]The UPⅡ promoter drove the transcription of Cas9 mRNA, while the hTERT promoter was used to promote the transcription of sgRNA targeting LacI. The output Renilla luciferase gene was regulated by a LacI?controlled CMV promoter. The luciferase was expressed only when both UPⅡpromoter and TERT promoter were both activated. In the design of the minigene circuit, the UPⅡ and hTERT promoters were replaced by their respective transcription factor binding elements. Both c?Myc and Get1, only in bladder cancer cells, had a relative high expression level at the same time. After initial expression of sgRNA1 and sgRNA2, they could further bind upstream of their own transcription initiation sites and then amplify the transcription signals of c?Myc and Get1 through the positive feedback mechanism to amplify their corresponding downstream genes transcription,respectively. Furthermore, the LacI gene was knocked out by sgRNA2, and luciferase reporter gene was activated by transcription. In normal bladder epithelial cells, luciferase could not be effectively transcribed and was further silenced by trace amounts of LacI expressed at the background level

目前，用于基因治療的CRISPR 技術(shù)大多基于產(chǎn)生DSB，誘導(dǎo)細(xì)胞DNA 修復(fù)途徑，從而導(dǎo)致靶位點(diǎn)序列的改變。而大多數(shù)疾病都是由點(diǎn)突變引起的。因此，有必要開發(fā)針對特定點(diǎn)突變位點(diǎn)的工具。目前，現(xiàn)有的單堿基編輯技術(shù)包括CBE 和ABE［52?55］，先導(dǎo)編輯可以通過編輯sgRNA 為pegRNA 并在DSB 引入模板來進(jìn)行精確的基因編輯，包括長片段的替換、插入和刪除［56?57］，在遺傳疾病的研究和治療方面的應(yīng)用非常廣泛［58］。

CRISPR?Cas9將有助于腫瘤細(xì)胞中新致癌基因的發(fā)現(xiàn)及驗(yàn)證其在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，從而為腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)，為腫瘤基因治療提供了新思路。總的來說，基因治療仍處于臨床前探索階段，其安全性、持久性和有效性的衡量標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步加強(qiáng)和完善。目前的監(jiān)管模式需要大量的研究來確定其安全性和有效性，這不適用于處理在單個患者或極少數(shù)患者中發(fā)現(xiàn)的突變。理想方法是創(chuàng)造一種單一的組合物，可以治療更多的患者群體。在不久的將來，在轉(zhuǎn)向個性化療法中，細(xì)胞和基因治療領(lǐng)域的創(chuàng)新將面臨獨(dú)特的挑戰(zhàn)。對核酸遞送、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和人類基因組的精確操縱也將達(dá)到前所未有的控制水平。與此同時，這種技術(shù)激發(fā)了全新的研究領(lǐng)域，如合成生物學(xué)、細(xì)胞重編程和高通量功能基因組學(xué)，這些領(lǐng)域無疑將繼續(xù)重塑生物醫(yī)學(xué)研究的面貌。

3 腫瘤疫苗

與靶向免疫檢查點(diǎn)的腫瘤免疫治療不同，腫瘤疫苗利用抗原?抗體反應(yīng)［59］，主要分為預(yù)防性和治療性疫苗。預(yù)防性疫苗通過預(yù)防和殺死某些病毒或細(xì)菌感染來預(yù)防癌癥，而治療性疫苗通過癌細(xì)胞抗原激活機(jī)體的特定免疫功能來控制或殺死腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞癌變后產(chǎn)生的腫瘤抗原可作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的靶點(diǎn)，這是制備腫瘤疫苗的基礎(chǔ)；此外，測序突變基因和獲得新抗原有助于制備個體化癌癥疫苗［60?61］。個體化癌癥疫苗Neo Vax 在黑色素瘤患者的臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出了優(yōu)異的效果，并產(chǎn)生了持久的免疫反應(yīng)［62］。與免疫檢查點(diǎn)抑制劑或其他癌癥療法一起，這些個性化癌癥疫苗可能具有較高的臨床療效［63］。Ravindranathan 等［64］利用CRISPR?Cas9 技術(shù)篩選影響乳腺癌細(xì)胞免疫原性的細(xì)胞因子，增強(qiáng)自體腫瘤疫苗的有效性。Guo 等［65］發(fā)現(xiàn)STEAP1 在人鼠前列腺癌中均高表達(dá)，據(jù)此構(gòu)建了一種融合蛋白疫苗，在體內(nèi)抑制腫瘤生長，改善腫瘤微環(huán)境。當(dāng)使用CRISPR?Cas9敲除抗原靶點(diǎn)時，對前列腺癌的免疫反應(yīng)被大大抑制。

除此之外，利用CRISPR 改造免疫系統(tǒng)自身產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞，以便在感染的情況下按要求大量表達(dá)針對這些難治性病毒的抗體。研究人員成功對人類和小鼠B細(xì)胞進(jìn)行基因修飾來表達(dá)靶向致癌病毒，如呼吸道合胞病毒（RSV）、艾滋病毒（HIV）、流感病毒和Epstein?Barr 病毒（EBV），將編碼抗體的DNA 插入到原代人B 細(xì)胞的抗體編碼基因上產(chǎn)生的小切口中，使得新抗體蛋白的表達(dá)受到這些細(xì)胞自身啟動子的調(diào)節(jié)，從而允許這些細(xì)胞能夠像正常特異性免疫B細(xì)胞那樣在經(jīng)受病毒抗原觸發(fā)后產(chǎn)生新抗體蛋白，Moffett等［66］證實(shí)這些經(jīng)過基因改造的B 細(xì)胞在小鼠感染模型中阻止RSV 感染。將CRISPR 技術(shù)應(yīng)用于腫瘤疫苗的開發(fā)，是一種全新的嘗試，同時，也為腫瘤疫苗的探索提供了更加廣闊的發(fā)展空間。

4 文庫篩選作用靶點(diǎn)

CRISPR 技術(shù)還可以加速癌癥治療靶點(diǎn)基因的發(fā)現(xiàn)，使用靶向基因組中不同基因的引導(dǎo)RNA 文庫，可以系統(tǒng)性地敲除細(xì)胞系或類器官中的任何基因，然后觀察基因敲除對癌細(xì)胞生長或藥物反應(yīng)的影響，系統(tǒng)地研究癌癥的發(fā)生、發(fā)展和代謝依賴性，以確定潛在的治療途徑［67?68］。將特定抗癌藥物的藥敏與細(xì)胞系全基因組CRISPR 功能缺失篩查結(jié)合起來，研究支持藥物敏感性的細(xì)胞通路，這些蛋白?蛋白網(wǎng)絡(luò)的識別有助于藥物的開發(fā)［69?70］。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種藥物組合［4，71?72］，如在轉(zhuǎn)移性前列腺癌（PC）中存在有害的共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ataxia telangiectasia?mutated，ATM）缺陷時，PARP 抑制對該亞群具有抗腫瘤活性，但只有部分ATM 缺陷對PC 有反應(yīng)。Neeb 等［72］利用CRISPR?Cas9 修飾體外細(xì)胞系模型來破壞ATM功能，并用于藥物敏感性和功能分析，然后在患者衍生模型中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)聚腺苷二磷酸核糖聚合酶PARP和ATR聯(lián)合抑制對上述模型具有良好的抗腫瘤活性。

Ouyang 等［73］利用CRISPR 敲除（GeCKO）文庫篩選了卵巢癌細(xì)胞系中與順鉑耐藥相關(guān)的新基因。研究中篩選了6個候選基因，包括一個先前驗(yàn)證的基因SULF1和5 個新基因ZNF587B、TADA1、SEMA4G、POTEC和USP17L20。經(jīng)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩個基因（ZNF587B和SULF1）與順鉑耐藥有關(guān)，其中ZNF587B可能是預(yù)測順鉑耐藥的一種新的生物標(biāo)志物。

二甲雙胍是目前治療多種癌癥的強(qiáng)有力的候選抗腫瘤藥物，然而，其抗腫瘤效果在不同的癌癥或亞人群中存在差異，這可能是由于腫瘤的異質(zhì)性。為了探究哪些肝細(xì)胞癌（HCC）患者亞群可以從二甲雙胍治療中獲益，F(xiàn)eng 等［74］通過全基因組CRISPR?Cas9 敲除篩選，發(fā)現(xiàn)DOCK1 水平可以決定二甲雙胍的抗腫瘤作用，DOCK1 是二甲雙胍在HCC 中的一個合成致死靶點(diǎn)。機(jī)制上，二甲雙胍促進(jìn)DOCK1 磷酸化，DOCK1 磷酸化激活RAC1 促進(jìn)細(xì)胞生存，導(dǎo)致二甲雙胍耐藥。DOCK1選擇性抑制劑TBOPP可增強(qiáng)二甲雙胍在肝癌細(xì)胞株和患者源性肝癌類器官中的體外抗腫瘤活性，以及在體內(nèi)異種移植肝癌細(xì)胞和具有免疫能力的小鼠肝癌模型中的抗腫瘤活性，二甲雙胍可以改善DOCK1低水平HCC患者的總生存率，但對DOCK1 高表達(dá)的患者沒有改善作用。二甲雙胍的療效取決于DOCK1 水平，二甲雙胍聯(lián)合DOCK1 抑制可能為二甲雙胍耐藥提供一種有前途的個體化治療策略。

為了鑒定調(diào)控小鼠乳腺上皮細(xì)胞密度依賴性增殖的基因，研究人員建立了一種基于熒光泛素細(xì)胞周期標(biāo)志物的熒光激活細(xì)胞分選方法，該方法以不同的熒光團(tuán)標(biāo)記細(xì)胞周期的不同階段。接著，F(xiàn)omicheva 等［75］在4000 萬個上皮細(xì)胞中進(jìn)行了CRISPR?Cas9 全基因組敲除篩選，并通過選擇那些在低密度下正常增殖但在高密度下繼續(xù)分裂的細(xì)胞，首次發(fā)現(xiàn)了TRAF3與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，TRAF3的缺失會激活增殖信號通路，進(jìn)而推動細(xì)胞的分裂。

轉(zhuǎn)移是造成癌癥治療困難的主要因素之一，與癌癥預(yù)后不良有關(guān)。在最近的一項(xiàng)研究中，通過CRISPR 激活（CRISPRa）對編碼細(xì)胞表面蛋白的基因進(jìn)行篩選，以識別增強(qiáng)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞表面分子，Van Der Weyden 等［76］發(fā)現(xiàn)，LRRN4CL基因的過度表達(dá)增加了小鼠和人類黑色素瘤細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移的能力。他們還測試了結(jié)腸癌、乳腺癌和膀胱癌的細(xì)胞模型，并證實(shí)了在所有轉(zhuǎn)移至肺部的細(xì)胞中LRRN4CL的高表達(dá)。這是第一次發(fā)現(xiàn)LRRN4CL與癌癥有關(guān)。此外，研究結(jié)果表明，降低LRRN4CL的表達(dá)有助于防止轉(zhuǎn)移到肺部，從而使其成為潛在的藥物靶點(diǎn)。

利用CRISPR?Cas9 文庫對遺傳背景相同的一系列抑癌基因敲除細(xì)胞系進(jìn)行全基因組功能篩選，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證對于抑癌基因缺失的細(xì)胞，雖然CRISPR 系統(tǒng)無法靶向該基因本身，但是抑制DNA 修復(fù)、核苷酸代謝相關(guān)基因，或旁系同源基因，或其他抑癌基因等能夠發(fā)揮抑制細(xì)胞生長的作用，這些基因可以作為臨床治療的潛在靶點(diǎn)［77］。CRISPR 技術(shù)可以篩選改善免疫細(xì)胞功能的靶點(diǎn)，從而改善免疫治療［10，78］。通過CRISPR在體內(nèi)篩選，建立表觀遺傳轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，篩選增強(qiáng)免疫治療的新靶點(diǎn)［79］。張鋒團(tuán)隊(duì)［80］對人類黑色素瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞毒性T 細(xì)胞殺傷的基因進(jìn)行了全基因組規(guī)模的CRISPR 激活篩選，以此尋找癌細(xì)胞對細(xì)胞毒性T 細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵驅(qū)動因子。研究人員篩選鑒定了4 個候選基因：CD274（PD?L1）、MCL1、JUNB和B3GNT2，這些基因在上調(diào)后，可以使人類黑色素瘤細(xì)胞逃避T 細(xì)胞的殺傷，系統(tǒng)的功能獲得性篩查可以闡明耐藥途徑，并確定癌癥免疫治療的潛在靶點(diǎn)。CRISPR?Cas9 高通量篩選文庫在哺乳動物細(xì)胞中的應(yīng)用無疑會為腫瘤等相關(guān)疾病機(jī)制的研究提供極大的幫助，可以預(yù)見，隨著相關(guān)基礎(chǔ)研究的深入，CRISPR?Cas9 系統(tǒng)將在腫瘤個體化治療方面得到更廣闊的發(fā)展與應(yīng)用。

5 譜系追蹤

癌癥的一大特征是它的異質(zhì)性，癌細(xì)胞不斷積累基因變異，導(dǎo)致產(chǎn)生具有不同特征的細(xì)胞克隆，追蹤癌細(xì)胞的譜系變化，理解腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性并且追蹤新克隆的產(chǎn)生和演化可以更全面地了解腫瘤發(fā)生。基于Cas9 的單細(xì)胞RNA 測序細(xì)胞譜系追蹤的技術(shù)為大規(guī)模、高精度研究腫瘤進(jìn)展提供了可行的方案，Cas9 切割特定的基因組位點(diǎn)，造成的穩(wěn)定的插入/缺失等位基因突變可以被后代細(xì)胞繼承，隨著細(xì)胞分裂，它們在其他部位積累更多Cas9誘導(dǎo)的插入缺失突變（indel），從而進(jìn)一步區(qū)分連續(xù)的細(xì)胞分支。在譜系追蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，通過測序從單個細(xì)胞中收集indel 等位基因并與細(xì)胞狀態(tài)的單細(xì)胞表達(dá)譜配對。然后利用回溯性追蹤的計(jì)算方法重建系統(tǒng)發(fā)育樹，對測序得到的indel進(jìn)行亞克隆細(xì)胞關(guān)系建模［81］。

Christopher課題組［82］開發(fā)了一個基于CRISPR?Cas9 的“譜系回溯記錄器”macsGESTALT，使用CRISPR?Cas9來誘變合成引入的DNA序列，作為細(xì)胞條形碼，然后將這些工程化的癌細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)并使其轉(zhuǎn)移。當(dāng)癌癥在宿主小鼠中發(fā)展和擴(kuò)散時，細(xì)胞條形碼被CRISPR?Cas9 隨機(jī)“編輯”。因此，這種條碼編輯模式用于重建癌細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)育樹，可以動態(tài)追蹤體內(nèi)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程，且成功鑒定出與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。研究者將macsGESTALT 應(yīng)用于小鼠轉(zhuǎn)移性胰腺癌模型，通過分析38 萬個CRISPR 靶向部位信息來追蹤2.8萬個癌細(xì)胞的體內(nèi)擴(kuò)散情況，鑒定出一類具有上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）特征的過渡態(tài)細(xì)胞。處于晚期混合EMT 狀態(tài)的癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，在胰腺癌和肺癌患者中，這些晚期混合EMT 狀態(tài)的基因特征預(yù)示著較低的生存率。

基于CRISPR?Cas9 的譜系示蹤技術(shù)與scRNA?seq 結(jié)合，可以顯著提高追蹤的分辨率。Yang 團(tuán)隊(duì)［83］使用基于CRISPR 的譜系追蹤方法，為每個細(xì)胞嵌入可遺傳和可進(jìn)化的DNA 條形碼。他們對小鼠進(jìn)行改造，當(dāng)它們的肺細(xì)胞暴露于一種特制的病毒時，會激活Kras基因中的致癌突變，并使細(xì)胞中的腫瘤抑制基因Trp53失活，同時激活譜系追蹤，每次細(xì)胞分裂時條形碼都會被輕微修改。當(dāng)研究人員最終收獲原始細(xì)胞的后代時，就可比較細(xì)胞的條形碼來重建每個細(xì)胞的“家譜”，就像相關(guān)物種的進(jìn)化樹一樣。利用Cas9 編輯產(chǎn)生的indels 構(gòu)建的譜系發(fā)育樹并結(jié)合單細(xì)胞測序獲得的轉(zhuǎn)錄組信息，文章揭示了癌細(xì)胞可塑性和腫瘤的平行進(jìn)化路徑，確定了腫瘤轉(zhuǎn)移的亞克隆起源、空間位置和細(xì)胞狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)稀有的腫瘤亞克隆通過采用獨(dú)特的適應(yīng)度相關(guān)轉(zhuǎn)錄程序來驅(qū)動腫瘤擴(kuò)張。除此之外，敲除肺腺癌中常見的抑癌因子LKB1和APC會引起腫瘤進(jìn)化路徑的改變，使用RNA測序測量了細(xì)胞中的基因表達(dá)，以表征每個細(xì)胞的狀態(tài)。有了這些信息，研究人員就可以“拼湊”這種類型的肺癌如何變得具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性。

CRISPR?Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生的細(xì)胞條形碼與單細(xì)胞測序技術(shù)結(jié)合的譜系追蹤技術(shù)將會發(fā)展成為一種可綜合理解生物體各種組織和器官發(fā)育的平臺，從而加深我們對單細(xì)胞生長形成成年動物過程的理解，如果應(yīng)用于疾病模型，它將為疾病如何出現(xiàn)發(fā)展提供新的見解。在癌癥之外，該方法也為系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)研究提供了前所未有的分辨率和規(guī)模，大大增強(qiáng)了我們對于系統(tǒng)發(fā)生過程的理解。

6 技術(shù)挑戰(zhàn)

6.1 脫靶效應(yīng)

CRISPR技術(shù)自誕生以來，一直存在兩大障礙阻礙其臨床應(yīng)用，即高脫靶效應(yīng)和低遞送效率。此前，已經(jīng)開發(fā)出了多種Cas蛋白變體，包括：Cas9系統(tǒng)的dCas9［84］、SuperFi?Cas9［85］Cas9切口酶（nCas9）［86］、xCas9［87］，Cas12系統(tǒng)的Cas12f1［88］、hyperCas12a［89］，Cas13系統(tǒng)的hfCas13d［90］、Cas13X［91］等。研究人員已經(jīng)在改進(jìn)Cas 酶和引導(dǎo)RNA 設(shè)計(jì)方面取得了長足進(jìn)步，大幅度提高了核酸酶的特異性，結(jié)合預(yù)測靶向結(jié)果的設(shè)計(jì)工具和對基因表達(dá)的時空調(diào)控為提高靶向效率提供了全面應(yīng)對的策略［87，92?94］。CRISPR 單堿基編輯器也會導(dǎo)致許多不必要的和潛在危險(xiǎn)的脫靶效應(yīng)［95］?？梢圆扇∫韵虏呗越档兔摪行剩貉芯棵摪行?yīng)機(jī)制，開發(fā)并合理利用預(yù)測脫靶效應(yīng)的有效工具［85，96］；開發(fā)新的基因編輯系統(tǒng)［97］；利用高質(zhì)量參考基因組設(shè)計(jì)靶標(biāo)；靶向性強(qiáng)的基因編輯工具遞送系統(tǒng)［97］。

6.2 遞送效率

由于人類對Cas蛋白具有廣泛的免疫性，優(yōu)化Cas 系統(tǒng)遞送策略變得更具挑戰(zhàn)性。CRISPR 系統(tǒng)以DNA 形式進(jìn)行的遞送會長期表達(dá)，這可能導(dǎo)致脫靶效應(yīng)和免疫反應(yīng)的增加；由于mRNA 的穩(wěn)定性較差，在傳遞過程中需要一種特殊的機(jī)制來保護(hù)其不被胞外核酸酶降解。為了最大限度地減少CRISPR?Cas 系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，最有效的傳遞方法是直接引入Cas 蛋白及其特異性sgRNA，而不是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Cas9 蛋白和sgRNA 的pDNA 或mRNA［98?99］?；赗NP 的給藥方法顯示了細(xì)胞毒性和基因組重排效率之間的良好平衡［100］。解決這個問題的策略包括：利用較小的CRISPR 系統(tǒng)減輕遞送壓力，使用無細(xì)胞毒性的遞送載體，以及對特定細(xì)胞的定向運(yùn)輸。例如可以在體內(nèi)控制藥效和器官選擇性脂質(zhì)iPhos［101］。張峰團(tuán)隊(duì)［102］利用天然存在于人類的類似逆轉(zhuǎn)錄病毒的蛋白質(zhì)PEG10，開發(fā)了一種新的RNA 遞送平臺，名為SEND，該蛋白經(jīng)過工程改造后能與mRNA 結(jié)合，形成一個模塊化的遞送平臺，用于包裝和傳遞RNA。使用SEND，CRISPR?Cas9 系統(tǒng)成功地以mRNA 的形式傳遞到人類和小鼠細(xì)胞中，并編輯特定的基因。與其他載體相比，免疫反應(yīng)低，安全性高。

分子量更小的遞送系統(tǒng)也被不斷發(fā)現(xiàn)，腺相關(guān)病毒（AAV）是目前極具潛力的臨床應(yīng)用的基因治療載體，但其裝載量較小，無法容納多種傳統(tǒng)的CRISPR?Cas系統(tǒng)，需要使用雙AAV 進(jìn)行遞送降低效率。Zhan 等［103］開發(fā)了CRISPReader，能夠閱讀基因簇的開放閱讀框架，而不需要傳統(tǒng)的調(diào)控元件或其他輔助因子。利用這一策略，通過從表達(dá)盒中去除啟動子類元件來構(gòu)建一個一體化的AAV?CRISPR?Cas9 系統(tǒng)，以解決現(xiàn)有的AAV 包裝尺寸問題。以穩(wěn)定的方式控制無啟動子基因表達(dá)的技術(shù)，緊湊的AAV?CRISPR?Cas 在轉(zhuǎn)錄激活、DNA 切割和基因編輯方面比編碼兩個獨(dú)立Cas9 元件的雙AAV 載體更有效。Zhan 等［104］將各種lncRNA 功能基元集成到僅70～80 kDa 的CRISPR?dCasΦ 系統(tǒng)中crRNA 的不同部分，開發(fā)了CRISPR信號導(dǎo)體2.0 版本。該系統(tǒng)可以通過招募細(xì)胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控靶基因的表達(dá)，有效地感知經(jīng)典合成系統(tǒng)無法檢測到的各種蛋白質(zhì)信號，解決了背景泄露和信號響應(yīng)不靈敏的問題，并實(shí)現(xiàn)了多達(dá)6個輸入信號的邏輯門的構(gòu)建，可用于特異性靶向癌細(xì)胞。最后通過重組內(nèi)源性信號網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步證明了該系統(tǒng)在體內(nèi)癌癥基因治療中的有效性和生物安全性。

6.3 DNA損傷

CRISPR 系統(tǒng)可以激活p53，從而導(dǎo)致DNA 損傷［105?106］。在一項(xiàng)對小鼠和人類細(xì)胞的全面系統(tǒng)研究中，Kosicki等［107］發(fā)現(xiàn)，CRISPR?Cas9系統(tǒng)導(dǎo)致了廣泛的突變和基因重排，如大量細(xì)胞中DNA 的插入和缺失，這些變化可導(dǎo)致重要基因的開啟或關(guān)閉，從而導(dǎo)致致病后果。Xu 等［108］發(fā)現(xiàn)Cas9 蛋白及其各種突變可以直接與DNA 修復(fù)途徑中的關(guān)鍵因子KU86 結(jié)合，干擾DNA?PK 復(fù)合體的形成；這可以抑制非同源端連接（NHEJ）修復(fù)途徑介導(dǎo)的DNA 損傷修復(fù)，導(dǎo)致DNA 損傷和基因組不穩(wěn)定。因此，在CRISPR?Cas9 系統(tǒng)臨床應(yīng)用之前，還需要進(jìn)一步的研究和特異性測試。此外，使用Cas 變體，如誘導(dǎo)單鏈斷裂（SSB）而不是DSB 的Cas9n 產(chǎn)生堿基編輯和先導(dǎo)編輯的發(fā)展，是CRISPR技術(shù)安全治療應(yīng)用的一項(xiàng)關(guān)鍵創(chuàng)新。

6.4 細(xì)胞毒性

之前的研究表明，CRISPR?Cas9基因編輯可以導(dǎo)致p53激活，進(jìn)而導(dǎo)致DNA 損傷，因此，基因編輯成功的細(xì)胞中p53有可能存在缺陷。這增加了患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，并可能在接受過這些基因編輯細(xì)胞治療的個體中引發(fā)癌癥［105?106］。隨后發(fā)現(xiàn)，CRISPR?Cas9編輯小鼠的受精卵中出現(xiàn)了頻繁和大量的堿基缺失［109?110］。Wagner 等［111］在研究中發(fā)現(xiàn)幾乎所有健康的人類受試者都擁有能對Cas蛋白產(chǎn)生反應(yīng)的T 細(xì)胞，這可能是由于對Cas9 蛋白已有的免疫記憶，因?yàn)殒溓蚓腥驹谌祟愔泻艹Ｒ姡瑏碜云渌?xì)菌的Cas 分子也會產(chǎn)生類似的免疫反應(yīng)。此外，Cas9 特異性T 細(xì)胞可能會主動清除Cas9 修飾的細(xì)胞，導(dǎo)致治療失?。?12］。這些免疫細(xì)胞在基因治療過程中可能會產(chǎn)生不良的免疫反應(yīng)，從而影響CRISPR 技術(shù)的安全性和有效性。這些研究表明，人體的免疫反應(yīng)可以破壞基因治療，并對接受治療的患者的健康構(gòu)成威脅。Leibowitz［113］報(bào)道了在CRISPR?Cas9 基因編輯過程中引入的DSB 可能導(dǎo)致染色體碎片化，這是一種具有高度破壞性的基因組重排形式，可能導(dǎo)致致癌融合蛋白的出現(xiàn)或特定基因表達(dá)的失調(diào)。對此，我們可以通過從一種從未感染過人類的細(xì)菌中尋找一種新的或者通過人工重新設(shè)計(jì)Cas蛋白酶，來避免免疫排斥反應(yīng)。CRISPR?Cas 系統(tǒng)引發(fā)的一系列問題的發(fā)現(xiàn)，說明我們對其機(jī)制認(rèn)識還不夠，需要對該技術(shù)的安全性評價保持謹(jǐn)慎。

7 總結(jié)及展望

在過去的十年里，CRISPR 技術(shù)從最初的基因敲除到模塊化工具的飛躍發(fā)展，如今在疾病治療和研究中發(fā)揮著重要作用，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控［114?115］、表觀遺傳修飾［116?117］、染色質(zhì)成像［118?119］和堿基編輯［120］，關(guān)鍵的挑戰(zhàn)是將新技術(shù)應(yīng)用于臨床治療。相信隨著安全有效的基因編輯工具的發(fā)展以及更完善的基因傳遞系統(tǒng)，未來CRISPR 技術(shù)將在疾病治療中得到更廣泛的應(yīng)用。DNA 測序的發(fā)展及其大規(guī)模應(yīng)用使人們認(rèn)識到患者人群與普通人群之間的遺傳變異；此外，它加深了我們對遺傳變異（例如DNA突變）與疾病易感性、疾病發(fā)展和治療反應(yīng)之間相關(guān)性的理解［70］。這些進(jìn)步刺激了個性化或精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。CRISPR?Cas9系統(tǒng)也適用于大規(guī)模篩選，并已在各種環(huán)境中使用。在疾病模型構(gòu)建、藥物開發(fā)、藥物靶點(diǎn)篩選、臨床前研究等方面均取得了良好的效果。CRISPR 基因編輯系統(tǒng)還可以作為自我調(diào)節(jié)開關(guān)，可以幫助科學(xué)家開發(fā)用于研究的基因工程細(xì)胞的新方法［121］。更小的Cas 蛋白的開發(fā)和應(yīng)用，可以簡化基因傳遞過程，可以開發(fā)為基因調(diào)控和治療的多種基因工程工具［122］。

CRISPR?Cas9技術(shù)作為一種功能強(qiáng)大的編輯工具，具有巨大的治療潛力，已經(jīng)在臨床中得到應(yīng)用。接下來CRISPR 系統(tǒng)需要解決的關(guān)鍵挑戰(zhàn)包括：編輯準(zhǔn)確性（即目標(biāo)位點(diǎn)的特異性）和精度（即產(chǎn)生確切的所需編輯結(jié)果）；提高多基因調(diào)控效率；體外基因編輯的更廣泛的應(yīng)用；體內(nèi)基因編輯的安全性和遞送效率等。相信隨著安全措施的完善和個性化治療的發(fā)展，該技術(shù)在疾病治療中的大規(guī)模應(yīng)用將很快成為可能。盡管臨床應(yīng)用的路上仍具有一些挑戰(zhàn)，我們依然有理由認(rèn)為基因編輯療法將預(yù)示著癌癥領(lǐng)域一個新的時代的到來。