王凱，張婉，黃云海，張立新，婁春波

（1 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，細(xì)胞與基因線路設(shè)計中心，廣東 深圳 518000； 2 上海藥明生物技術(shù)有限公司，上海 200131； 3 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海 200237）

胞內(nèi)病原菌可以侵入并在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)生存，通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，創(chuàng)造合適的生態(tài)位［1?2］。根據(jù)生活史，胞內(nèi)病原菌可分為專性胞內(nèi)細(xì)菌（obligatory intracellular bacteria）和兼性胞內(nèi)細(xì)菌（facultative intracellular bacteria）。前者只能在宿主細(xì)胞內(nèi)生長和繁殖，如沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）和伯氏柯克氏桿菌（Coxiella burneti）；而兼性胞內(nèi)細(xì)菌除了可以寄生在胞內(nèi)，也可在宿主細(xì)胞間隙、血液、淋巴液、組織液等體液中生長繁殖，如結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、腸沙門氏菌（Salmonella enterica）和單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）［3?7］。

由于受到宿主細(xì)胞膜的保護(hù)，胞內(nèi)病原菌難以被免疫系統(tǒng)和抗生素接觸到，因而不容易被殺死，治療失敗的風(fēng)險很高，危害人體健康甚至生命安全［8?10］。以結(jié)核病為例，結(jié)核病是由胞內(nèi)致病菌結(jié)核分枝桿菌引起的傳染性疾病，它是全球第十大死因，也是因單一病原體感染造成的主要死因。據(jù)世界衛(wèi)生組織《2022 年全球結(jié)核病報告》，2021 年全球約有1060 萬人患結(jié)核病，導(dǎo)致大約160萬人死亡［11］。目前防治結(jié)核病最常用的是化學(xué)療法，利福平和異煙肼是使用最廣泛的強效抗結(jié)核藥物［12?13］，然而隨著感染的迅速傳播、藥物的長期不規(guī)范使用，結(jié)核分枝桿菌的耐藥性問題日益嚴(yán)重。2020～2021 年，耐藥結(jié)核病發(fā)病率上升了3%，且新增45 萬例耐利福平結(jié)核病新病例，這是多年來首次報告耐藥結(jié)核病患者數(shù)和患者總數(shù)同時增加，意味著亟需提出新的包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的胞內(nèi)病原菌防治辦法［11］。噬菌體療法就是富有前途的策略之一［14］。噬菌體對病原菌具有很強的選擇性，可以特異性裂解靶細(xì)菌而不影響宿主體細(xì)胞和其他正常菌群，且治療效果不因細(xì)菌耐受抗生素而改變，因此噬菌體療法在治療胞內(nèi)耐藥病原菌引起的疾病方面具有巨大的潛力［15］。近年來，噬菌體療法在治療胞內(nèi)病原菌，尤其是胞內(nèi)耐藥病原菌方面已經(jīng)有一些成功的案例，展現(xiàn)了其獨到的優(yōu)勢，當(dāng)然也有不盡如人意之處［16?17］。在這篇綜述中，我們將介紹噬菌體療法應(yīng)對胞內(nèi)耐藥病原菌的前景及需要克服的困難，并將討論這一領(lǐng)域未來需要突破的瓶頸以及可能的努力方向。

1 胞內(nèi)病原菌的感染機制及耐藥性

1.1 胞內(nèi)病原菌的感染機制

胞內(nèi)病原菌可以通過多種方式跨越細(xì)胞膜屏障進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)［18?19］。對于具有內(nèi)吞特性的巨噬細(xì)胞，胞內(nèi)病原菌就可以通過細(xì)胞本身的吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞。以結(jié)核分枝桿菌為例，該菌在依次通過鼻、咽、上呼吸道后到達(dá)下呼吸道，這里有豐富的巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過多種受體識別結(jié)核分枝桿菌并將其通過內(nèi)吞體的形式吞入細(xì)胞內(nèi)［20?21］。而對于不具有吞噬作用的細(xì)胞，胞內(nèi)病原菌則進(jìn)化出了其他入侵細(xì)胞的策略。如李斯特氏菌利用表面的入侵蛋白InlA 和InlB 分別與其宿主細(xì)胞表面受體E?鈣黏蛋白和酪氨酸激酶Met（mesenchymal epithelial transition factor）相互作用，觸發(fā)宿主細(xì)胞內(nèi)吞效應(yīng)分子的募集，肌醇磷脂代謝的顛覆和肌動蛋白細(xì)胞骨架的重塑，從而導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)吞，這一過程又稱作拉鏈模式［22?23］；志賀氏菌的Ⅲ型分泌器將含有IPAB和IPAC蛋白的結(jié)構(gòu)插入細(xì)胞膜，然后誘導(dǎo)細(xì)菌?宿主細(xì)胞相互作用部位的細(xì)胞骨架重組來入侵上皮細(xì)胞［24?25］。

通過吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞的病原菌存在于被稱為吞噬體和/或核內(nèi)體的特殊細(xì)胞內(nèi)區(qū)，巨噬細(xì)胞傾向于將這些囊泡和溶酶體等融合，通過低pH環(huán)境和溶菌酶殺死病原菌［26?28］。為了生存下來，病原體進(jìn)化出了相應(yīng)策略，例如結(jié)核分枝桿菌通過分泌的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase）PtpA與巨噬細(xì)胞空泡ATP 酶（V?ATPase）的H 亞單位結(jié)合，抑制吞噬小體酸化；還可以通過其表面的脂阿拉伯?甘露醇聚糖（lipoarabinomannan）阻止吞噬小體成熟，限制吞噬小體?溶酶體（P?L）融合從而在巨噬細(xì)胞中存活［29?30］。而布魯氏菌（Brucellae）、 衣原體（Chlamydia） 和軍團(tuán)菌（Legionellae）會使自身所在的液泡迅速從吞噬溶酶體途徑中分離出來，避免被溶解失活［31?34］。

為了在細(xì)胞中棲息和復(fù)制，細(xì)菌還需要避免被宿主免疫系統(tǒng)消除，因此許多細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出包括阻止免疫系統(tǒng)識別胞內(nèi)病原菌以及主動抑制免疫反應(yīng)下游信號在內(nèi)的策略來逃脫免疫系統(tǒng)的懲罰，如單增李斯特氏菌可以通過分泌毒力因子InlC及在細(xì)胞感染期間干擾NF?κB的激活來抑制宿主免疫反應(yīng)［35?40］。

總之，胞內(nèi)病原菌進(jìn)化出了很多策略才得以跨越細(xì)胞膜屏障，并且經(jīng)受住免疫系統(tǒng)的考驗在宿主細(xì)胞內(nèi)生存繁殖。

1.2 胞內(nèi)病原菌的耐藥性

抗生素對胞內(nèi)病原菌的抑菌活性取決于幾個因素，其中就包括抗生素的作用機制和藥代動力學(xué)特性。若要發(fā)揮抑菌作用，抗生素首先必須通過全身運輸途徑到達(dá)受感染細(xì)胞所在的組織。其次，抗生素需要穿過細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞內(nèi)并在細(xì)胞內(nèi)積累到足夠的濃度［41?44］。

宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜會阻礙抗生素胞內(nèi)濃度的積累，反過來成為胞內(nèi)病原菌的有力屏障，而低于致死濃度的抗生素往往容易促進(jìn)耐藥表型的出現(xiàn)，導(dǎo)致抗生素治療失?。?5］。與之相一致的是，在目前發(fā)表的工作中，耐藥基因在胞內(nèi)病原菌間水平轉(zhuǎn)移甚少見于報道［46］，而與之相反，通過基因突變獲得耐藥性則更常見。這些突變可能發(fā)生在核糖體蛋白編碼基因、外排泵編碼基因等等，從而對不同作用機制的抗生素產(chǎn)生耐藥性，其結(jié)果就是出現(xiàn)能夠耐受多種抗生素的胞內(nèi)耐藥菌［47?51］。

此外，胞內(nèi)病原菌的持續(xù)感染還與病原菌進(jìn)入保持態(tài)（persisters）有關(guān)?？股貢鸩≡膿p傷，從而導(dǎo)致其發(fā)生生物應(yīng)激反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)制代謝減緩的特殊狀態(tài)， 稱為保持態(tài)（persisters）。保持態(tài)病原菌通常生長緩慢甚至停滯，但其對抗生素耐受性高，并且后續(xù)可以重新恢復(fù)生長。保持態(tài)病原菌的存在可以導(dǎo)致持續(xù)性細(xì)菌感染，并且與治療期間出現(xiàn)抗生素耐藥性的風(fēng)險增加有關(guān)［42?57］。

以結(jié)核分枝桿菌為例，結(jié)核分枝桿菌是危害嚴(yán)重且具有代表性的胞內(nèi)致病菌。它通過巨噬細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)入胞內(nèi)，在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存并將巨噬細(xì)胞作為自己擴增的巢穴。它可以通過不同基因的突變耐受多種抗生素，如katG基因突變與異煙肼耐藥相關(guān)；rpoB基因突變與利福平耐藥相關(guān)；glpK基因突變與貝達(dá)喹啉耐藥相關(guān)等等［58?60］。而不同突變位點的積累最終會導(dǎo)致MDR?TB（multidrug?resistant tuberculosis）菌株的產(chǎn)生。此外，結(jié)核分枝桿菌在感染了支氣管的巨噬細(xì)胞之后，還會進(jìn)入肺部間質(zhì)，引起機體更強烈的天然免疫與適應(yīng)性免疫，形成肉芽腫組織。肉芽腫組織對結(jié)核桿菌擴散起到了限制作用，但同時也限制了抗生素接觸結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮抑菌作用，從而導(dǎo)致治療失?。?1?63］。在冠狀病毒大流行之前，結(jié)核病一直是因單一病原體感染導(dǎo)致死亡的第一大原因，致死率在艾滋病和梅毒之上。而結(jié)核分枝桿菌的耐藥性則使得這一病癥威脅更大。目前，在世界范圍內(nèi)，各國耐藥結(jié)核病的治療成功率通常在50%～75%之間，在可獲得數(shù)據(jù)的最新患者隊列中為60%，治愈率仍處于較低水平［11］。

事實上，由胞內(nèi)耐藥病原體引起的感染有著難以治療、失敗風(fēng)險高且治療選擇有限的特點，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康安全。鑒于此，人類需要開發(fā)用于消除這些病原菌的新策略。

2 噬菌體療法及其巨大潛力

噬菌體是指從環(huán)境中分離出的一類寄生并侵害細(xì)菌的病毒［64］。由于其對靶細(xì)菌特異性強作用效果好，噬菌體在發(fā)現(xiàn)之初即被用于細(xì)菌感染的臨床治療［65］。如1921 年，在法國巴黎H?pital des Enfants?Malades醫(yī)院，首次成功應(yīng)用噬菌體治愈了兒童痢疾［66］。然而，由于缺乏對噬菌體生物性質(zhì)的了解以及隨后抗生素的興起限制了噬菌體作為抗菌藥物的廣泛使用，噬菌體療法隨即只在波蘭、蘇聯(lián)等地被研究和應(yīng)用［67?68］。然而，隨著現(xiàn)在細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)峻，且新型抗生素開發(fā)速度難以滿足臨床需求，噬菌體療法治療細(xì)菌感染再次受到了世界范圍內(nèi)科研人員的廣泛重視［69?70］。

噬菌體通過宿主細(xì)菌表面受體特異性識別宿主細(xì)菌，然后附著在宿主細(xì)菌表面，將自身的遺傳物質(zhì)注入宿主細(xì)胞。隨后，通過劫持宿主轉(zhuǎn)錄翻譯機器進(jìn)行復(fù)制包裝等一系列活動，形成子代噬菌體，最后裂解宿主細(xì)菌，釋放子代噬菌體［71］，這一過程對于宿主細(xì)菌而言是致死性的（圖1）。由于獨特的作用機制，噬菌體療法相對于傳統(tǒng)的抗生素療法具有諸多優(yōu)勢。第一，由于噬菌體抑菌機制和抗生素抑菌機制差異很大，所以噬菌體療法對于胞內(nèi)耐藥病原菌仍然具有顯著抑制效果。第二，噬菌體治療具有較高的安全性和治療效率。噬菌體對于靶細(xì)菌具有顯著特異性，不會感染哺乳動物細(xì)胞，對人體天然微生物菌群影響?。?2］。此外，噬菌體可以在裂解病原菌的同時復(fù)制自身，釋放出子代噬菌體持續(xù)侵染裂解病原菌，直到宿主病原菌密度顯著下降，這意味著噬菌體將比傳統(tǒng)藥物治療需要更少的劑量就可以獲得很好的治療效果。第三，與抗生素相比，噬菌體的分離更加容易，使用簡單廉價的技術(shù)就可以將噬菌體從環(huán)境中分離出來［73?74］。細(xì)菌也會出現(xiàn)噬菌體耐受表型，如改變表面受體阻礙噬菌體識別和吸附［75］。然而，噬菌體和細(xì)菌宿主共存于自然界，噬菌體可以通過共同進(jìn)化克服細(xì)菌的耐受性，因此，理論上總是可以分離出新的噬菌體應(yīng)對細(xì)菌感染［76］。在實際應(yīng)用中，也可以使用針對同一種病原菌的幾種噬菌體的混合劑，稱為噬菌體雞尾酒（phage cocktails），減少噬菌體耐受性的產(chǎn)生［77?79］。

圖1 噬菌體裂解細(xì)菌Fig. 1 The process of bacteriophage lysis of bacteria

在后抗生素時代，噬菌體療法正在成為治療胞內(nèi)耐藥病原菌感染者的最后手段。2019年，Hatfull小組的Dedrick等［80］報道在臨床上使用噬菌體雞尾酒治療由耐藥膿腫分枝桿菌（Mycobacterium abscessus） 引起的播散性感染（disseminated infection）。該囊性纖維化（cystic fibrosis）患者是一名15 歲的女孩，她在雙側(cè)肺移植后出現(xiàn)感染。在該研究中，噬菌體雞尾酒包括一個原生噬菌體（Muddy）和兩個工程化噬菌體（BPsΔ33HTH?HRM10 和ZoeJΔ45）。噬菌體治療使患者皮膚結(jié)節(jié)縮小，胸骨傷口感染改善，腹部淋巴結(jié)減少，臨床總體改善，沒有觀察到對噬菌體的耐藥性，也沒有發(fā)生免疫中和反應(yīng)。這是首次將噬菌體用于治療人類分枝桿菌感染，也是首次使用工程化噬菌體，證實了工程化噬菌體的安全性及其治療由胞內(nèi)病原菌引起的感染的能力。與此相類似，2022年，在Hatfull教授的指導(dǎo)下，Nick等［81］將噬菌體D29_HRMGD40和噬菌體BPsΔ33HTH_HRM10組成的噬菌體雞尾酒靜脈注射給一名患有難治性（treatment?refractory）膿腫分枝桿菌肺部感染和嚴(yán)重囊性纖維性肺部疾病（severe cystic fibrosis lung disease）的男性。噬菌體在一年的治療過程中裂解了病原菌，難治性膿腫分枝桿菌肺部感染在一年的時間里被根除，隨后進(jìn)行的肺移植獲得成功。龜分枝桿菌（Mycobacterium chelonae）是免疫功能低下患者（immunocompromised patients）慢性播散性皮膚感染的病因。因為長期的抗生素治療會導(dǎo)致顯著的毒性和進(jìn)一步的抗生素耐藥，治療多重耐藥的龜分枝桿菌感染是富有挑戰(zhàn)性的。2022 年，Hatfull小組的Little 等［82］報道了使用單一噬菌體（Muddy）結(jié)合抗生素和外科治療來治療一例播散性皮膚龜分枝桿菌感染的新方法?；颊咧敖邮芰藦V泛的抗菌藥治療與手術(shù)清創(chuàng)，然而，其皮膚損傷和活組織檢查仍呈陽性，有壞死性肉芽腫和大量分枝桿菌染色的證據(jù)。在開始噬菌體治療后，其皮膚病變有顯著改善。此外，治療后2 個月和5個月的兩次活組織檢查顯示沒有肉芽腫?；颊邲]有出現(xiàn)與噬菌體療法相關(guān)的不良反應(yīng)，已經(jīng)成功地在家中實施了這種療法超過6個月。

此外還有一些利用噬菌體治療胞內(nèi)病原菌感染的研究，基本都處于臨床前研究階段（表1）。這些研究的結(jié)果將為噬菌體療法的臨床實踐做出貢獻(xiàn)。

表1 噬菌體治療胞內(nèi)病原菌感染［16?17，83?99］Table 1 Phages against intracellular bacterial infection.

3 噬菌體療法面臨的挑戰(zhàn)

雖然噬菌體療法為治療胞內(nèi)耐藥病原菌帶來了新的希望，但在實際應(yīng)用中仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)。第一，噬菌體對靶細(xì)菌的特異性很強，因此每次使用噬菌體療法前都要先確定患者感染的病原菌，然后才能根據(jù)病原菌篩選出具有特異性的噬菌體進(jìn)行擴大培養(yǎng)［100?101］，限制了其臨床上的大規(guī)模應(yīng)用。第二，由于噬菌體獨特的注射侵染機制，噬菌體和病原菌之間存在基因水平轉(zhuǎn)移的可能性，因此在篩選噬菌體時需要盡量選擇已測序噬菌體以避免噬菌體將攜帶的抗生素抗性基因、毒性基因傳遞給病原菌，從而導(dǎo)致細(xì)菌宿主的毒力或耐藥性增強［102］。這些因素綜合在一起就使得噬菌體治療通用性不強，難以大規(guī)模推廣，而且每次使用都可能因為篩選階段過長而錯過最佳治療時間。第三，篩選好的噬菌體在治療過程中還需要遞送到病灶部位，在這個過程中噬菌體需要經(jīng)受機體復(fù)雜生理環(huán)境以及免疫系統(tǒng)的考驗。例如，2016 年，Sarker 等［103］曾通過讓病人口服兩種不同的噬菌體雞尾酒的方式嘗試治療由致病性大腸桿菌引起的急性脫水性腹瀉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，服用噬菌體雞尾酒的實驗組與服用安慰劑的對照組并沒有顯著差異。其原因可能是口服的噬菌體顆粒無法在通過低pH 的胃酸環(huán)境后存活，存活下來的噬菌體最終可能因為濃度過低導(dǎo)致治療無效［103］。而采用靜脈注射的給藥方式又容易受到人體免疫系統(tǒng)的影響，給治療效果增加了不確定性。2019年，Hatfull 組［80］使用噬菌體療法成功治療膿腫分枝桿菌感染。然而在2021 年，該團(tuán)隊使用同樣方法對另一位患者進(jìn)行治療時，患者對噬菌體產(chǎn)生強烈的中和抗體反應(yīng)，噬菌體被免疫系統(tǒng)清除，導(dǎo)致治療失?。?04］。

除了上述限制外，開展胞內(nèi)噬菌體治療還面臨一大難題：噬菌體如何進(jìn)入真核細(xì)胞并有效釋放。以噬菌體D29 為例，其頭部包含49 000 個堿基對的雙鏈DNA 基因組，平均直徑為65 nm，尾長在150 nm 和450 nm 之間，顯然并不能通過簡單擴散內(nèi)化（internalization）進(jìn)入真核細(xì)胞并接觸到胞內(nèi)病原菌從而發(fā)揮抑菌作用［105?106］。雖然，理論上噬菌體可以通過吞噬作用、內(nèi)吞作用、巨胞飲等方式內(nèi)化進(jìn)入真核細(xì)胞［107］，但是這樣的進(jìn)入方式無法保證攝取效率，胞內(nèi)噬菌體數(shù)量可能無法達(dá)到足夠的抑菌濃度，而且如果噬菌體不能及時從內(nèi)體中逃逸，將會很快被分解失活［108?109］。例如，2002 年就有報道指出，將TM4 噬菌體添加到感染了鳥分枝桿菌的巨噬細(xì)胞單層中，并不能抑制胞內(nèi)病原菌，而只有通過載體將噬菌體遞送到細(xì)胞內(nèi)才可以有效抑制胞內(nèi)病原菌［16］。

4 噬菌體療法的未來展望

噬菌體療法在治療胞內(nèi)耐藥病原菌方面具有巨大潛力，但也面臨著以下困難：①噬菌體難以高效內(nèi)化進(jìn)入真核細(xì)胞并有效接觸到胞內(nèi)病原菌；②對噬菌體特異性識別病原菌的機制缺乏深入了解，噬菌體療法的使用缺乏理性指導(dǎo)；③對免疫系統(tǒng)的角色缺乏充分的認(rèn)識，免疫反應(yīng)會影響噬菌體療法的療效。因此，我們?nèi)孕枰度敫嗟呐頌槭删w療法的胞內(nèi)應(yīng)用鋪平道路。

4.1 解決噬菌體入胞難題

首先必須要解決的是噬菌體難以高效內(nèi)化進(jìn)入真核細(xì)胞內(nèi)且有效釋放，并接觸胞內(nèi)病原菌的問題。由于胞內(nèi)病原菌常存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的特殊囊泡結(jié)構(gòu)中，而噬菌體自身并不容易穿膜內(nèi)化接觸到病原菌，因此必須開發(fā)行之有效的策略將噬菌體高效內(nèi)化，并使其可以充分釋放，接觸胞內(nèi)病原菌發(fā)揮抑菌作用（圖2）。第一種策略可以考慮利用無致病性的天然細(xì)菌作為載體，將噬菌體運輸進(jìn)細(xì)胞。2002年，Broxmeyer等［16］利用非致病性細(xì)菌恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）作為載體，攜帶噬菌體TM4 進(jìn)入感染了鳥分枝桿菌（Mycobacterium avium）的巨噬細(xì)胞，噬菌體TM4很好地抑制了胞內(nèi)的鳥分枝桿菌。然而，需要注意的是，只使用一種噬菌體進(jìn)行治療容易出現(xiàn)對噬菌體的耐受性，而如果考慮噬菌體雞尾酒，那么能滿足多種噬菌體同時運輸?shù)淖匀惠d體很難通過篩選得到［110?111］，同時考慮到安全性的問題，盡管天然細(xì)菌是目前比較切實可行的載體選擇，但還應(yīng)致力于開發(fā)人工合成的有機大分子作為運輸噬菌體穿過細(xì)胞膜的載體，如殼聚糖?藻酸鹽?CaCl2化合物體系、聚合物MPs 和脂質(zhì)體等。2008 年，Ma 等［112］利用殼聚糖?藻酸鹽?CaCl2將沙門氏菌特異性噬菌體Felix O1微囊化，增加了噬菌體在模擬胃液或膽汁中的穩(wěn)定性；在此基礎(chǔ)上，Agarwal 等［113］使用改良的聚合物MPs 將噬菌體靶向遞送到肺部，有效改善了囊性纖維化小鼠的銅綠假單胞菌感染和相關(guān)炎癥。與其他人工載體相比，脂質(zhì)體具有良好的細(xì)胞穿透特性。2015 年，Neith 等［114］報告了將模式噬菌體λeyfp 和分枝桿菌噬菌體 TM4 有效封裝到巨型脂質(zhì)體中，使得這些噬菌體被真核細(xì)胞高效吸收?？傊?，隨著包裝效率、包裝空間大小以及材料安全性的不斷提升，人工載體將助力解決噬菌體入胞釋放的難題。

圖2 促進(jìn)細(xì)胞攝取噬菌體的策略Fig. 2 Strategies used to facilitate cellular uptake of phage

第二種策略是在對大分子跨膜機制不斷認(rèn)識的基礎(chǔ)上，開發(fā)新的跨膜方法。例如可以采用細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptide， CPP）修飾來促進(jìn)噬菌體內(nèi)化到細(xì)胞中。細(xì)胞穿透肽富含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸，可以通過易位或內(nèi)吞進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)移并將寡核苷酸等大分子運送到細(xì)胞中，有效提高噬菌體內(nèi)化效率［115］。例如Bhattarai等［116］使用常見的細(xì)胞穿透肽RGD（Arginine?Glycine?Aspartic acid）肽修飾絲狀（filamentous）噬菌體M13，與野生型相比，重組噬菌體進(jìn)入HeLa 299 細(xì)胞的內(nèi)化效率提高了76%。雖然這種方法目前主要用于絲狀噬菌體。而絲狀噬菌體由于其非裂解性生命周期，不作為理想抗菌劑用于噬菌體治療。但隨著技術(shù)的拓展，利用細(xì)胞穿透肽修飾來促進(jìn)噬菌體內(nèi)化的策略，不失為一種可行的策略。而將來隨著對于跨膜運輸機制認(rèn)識的深入，也必將有更多的類似策略被應(yīng)用到噬菌體穿膜內(nèi)化上來。

第三種策略可以考慮使用納米級材料對噬菌體進(jìn)行修飾，改變噬菌體表面電荷而促進(jìn)噬菌體的內(nèi)化效率。例如2019 年，F(xiàn)ulgione 等［117］使用羥基磷灰石（hydroxyapatite， HA）納米晶體作為噬菌體SRφ1 運載工具來治療胞內(nèi)沙門氏菌（Salmonella）感染，數(shù)據(jù)表明經(jīng)過24 h 的處理，HA?SRφ1 復(fù)合物能夠成功內(nèi)化到HepG2 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，但單獨的SRφ1則不能。隨后的Zeta電位分析表明，HA 中和了SRφ1 表面的負(fù)電荷。2022 年，劉盡堯課題組［118］使用陽離子聚合物通過靜電相互作用選擇性地覆蓋帶負(fù)電荷的噬菌體頭部而不影響帶正電荷的尾部，從而產(chǎn)生活力基本不受影響的電荷反轉(zhuǎn)噬菌體。由于納米帽子的表面正電荷和質(zhì)子海綿效應(yīng)，加帽的噬菌體能夠進(jìn)入腸上皮細(xì)胞并從內(nèi)體逃逸進(jìn)而裂解細(xì)胞內(nèi)藏匿的沙門氏菌 （Salmonella）。將來在不影響噬菌體活性的基礎(chǔ)上，研究和開發(fā)新的、對人體無害的修飾材料，也是非?？尚械陌l(fā)展方向。

4.2 噬菌體受體研究及噬菌體療法的理性設(shè)計

在實現(xiàn)噬菌體內(nèi)化入胞并有效釋放的基礎(chǔ)上，噬菌體療法還應(yīng)當(dāng)向更加理性化方向發(fā)展。到目前為止，對于細(xì)菌表面上參與噬菌體吸附的受體研究甚少見于報道，在使用噬菌體雞尾酒療法時的依據(jù)往往是根據(jù)患者感染的病原菌選擇幾種有裂解作用的噬菌體混合，對于噬菌體識別怎樣的位點、各自識別的位點是否重疊缺乏理性認(rèn)識，這是導(dǎo)致噬菌體療法要在篩選噬菌體耗費大量時間以及商用噬菌體雞尾酒療效不佳的根源［119］，而未來充分研究認(rèn)識病原菌表面噬菌體識別吸附受體，建立詳盡可查的受體信息數(shù)據(jù)庫必將促進(jìn)噬菌體療法的實際應(yīng)用。比如，在此基礎(chǔ)上我們就可以理性選擇噬菌體，對噬菌體雞尾酒進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，Yang等［120］就曾報道將有效地殺死銅綠假單胞菌O抗原缺失突變體的噬菌體phiYY和能夠用截短的O 抗原感染突變體的PaoP5?m1 與另外3 種廣泛宿主范圍的銅綠假單胞菌噬菌體混合來生成雞尾酒。噬菌體混合物可有效對抗銅綠假單胞菌的多種臨床分離株，并在短期內(nèi)限制了噬菌體抗性突變體的出現(xiàn)。此外，我們還可以暢想運用合成生物學(xué)和基因工程技術(shù)以合適的噬菌體為底盤，設(shè)計受體結(jié)合蛋白及其相關(guān)結(jié)構(gòu)域來重構(gòu)噬菌體特異性并避免耐受性。

4.3 自然界噬菌體資源開發(fā)與噬菌體重組改造

雖然噬菌體廣泛存在于地球上，然而目前可用于治療的噬菌體數(shù)量較少［121］。因此，在自然界尋找更多的噬菌體，對其進(jìn)行測序、培養(yǎng)，從而擴大噬菌體資源庫是很有必要的。而且值得注意的是，現(xiàn)在噬菌體療法中使用的噬菌體大多是烈性噬菌體，而溫和噬菌體則在自然界更為常見，而且由于溫和噬菌體的溶原化特性，使得它們中的很多其實已經(jīng)得到測序。結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測識別并找出這些溫和噬菌體，并嘗試對其進(jìn)行開發(fā)，必將進(jìn)一步擴充治療可用的噬菌體資源庫［122］。

此外，隨著基因改造技術(shù)及合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對噬菌體資源的開發(fā)離不開對噬菌體本身進(jìn)行工程化改造，構(gòu)建功能獨特的重組噬菌體。例如，可以通過敲除溶原化基因?qū)睾褪删w改造為烈性噬菌體，然后用來裂解病原菌起到抑菌效果［123］。此外，還可以利用噬菌體可以將遺傳物質(zhì)帶入病原菌的特性，使噬菌體攜帶殺菌效力更強的毒基因或其他基因線路，構(gòu)建更有效的重組噬菌體［124］。

5 總 結(jié)

胞內(nèi)病原菌可以通過多種方式跨越細(xì)胞膜屏障侵入真核細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)化出包括阻止免疫系統(tǒng)識別以及主動抑制免疫反應(yīng)下游信號在內(nèi)的策略來逃脫免疫系統(tǒng)的懲罰，因而不容易被殺死，對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前對抗胞內(nèi)病原菌的主要手段還是抗生素治療。然而，胞內(nèi)病原菌可以通過基因突變獲得耐藥性。這些突變可能發(fā)生在核糖體蛋白編碼基因、外排泵編碼基因等等，從而對不同作用機制的抗生素產(chǎn)生耐藥性，其結(jié)果就是出現(xiàn)能夠耐受多種抗生素的胞內(nèi)耐藥菌。而半透性細(xì)胞膜會妨礙抗生素胞內(nèi)濃度的積累，亞致死濃度的抗生素往往會促進(jìn)耐藥表型的出現(xiàn)。此外抗生素會引起病原菌的損傷，從而導(dǎo)致其因生物應(yīng)激反應(yīng)而變得復(fù)制代謝減緩，但對抗生素耐受性高的特殊狀態(tài)，也會增加病菌出現(xiàn)耐藥表型的風(fēng)險。開發(fā)新的抑菌策略來對抗胞內(nèi)耐藥病原菌是很有必要的。

噬菌體從發(fā)現(xiàn)之初即被用于細(xì)菌感染的臨床治療。然而，由于缺乏對噬菌體生物性質(zhì)的了解以及隨后抗生素的興起限制了噬菌體作為抗菌藥物的應(yīng)用。隨著細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)峻且新型抗生素開發(fā)速度難以滿足臨床需求，噬菌體療法治療細(xì)菌感染再次受到了世界范圍內(nèi)科研人員的廣泛重視。由于獨特的作用機制，對于胞內(nèi)耐藥病原菌甚至是耐多藥胞內(nèi)病原菌，噬菌體療法仍然具有顯著效果。而且，噬菌體療法還具有安全性好、副作用小等諸多優(yōu)點。噬菌體療法有望成為治療抗生素耐藥性感染患者的最后手段。

噬菌體療法的應(yīng)用雖然為對抗細(xì)胞內(nèi)耐藥病原體帶來了新的希望，但同時也面臨著諸多挑戰(zhàn)。由于噬菌體對靶細(xì)菌的特異性很強，噬菌體療法往往作為一種定制方案使用，限制了其在臨床上的大規(guī)模應(yīng)用。而且，噬菌體和細(xì)菌之間存在水平基因轉(zhuǎn)移的可能性，因此在篩選治療用噬菌體時要避免使用攜帶抗生素抗性基因、毒性基因的噬菌體，以免導(dǎo)致細(xì)菌宿主的毒力增加。如何保證噬菌體在通過復(fù)雜的人體環(huán)境運輸，經(jīng)受免疫系統(tǒng)考驗后保持活性到達(dá)病灶部位發(fā)揮作用也是需要考慮的問題。除此之外，使用噬菌體療法對抗胞內(nèi)病原菌時還需要意識到，噬菌體無法通過擴散進(jìn)入真核細(xì)胞，必須開發(fā)相應(yīng)策略使噬菌體高效率進(jìn)入細(xì)胞并充分接觸到細(xì)胞內(nèi)病原菌才能發(fā)揮它的能力。針對噬菌體療法面臨的諸多限制，我們進(jìn)行了相關(guān)的思考和討論。使用促進(jìn)內(nèi)吞作用的細(xì)胞穿透肽或者能夠改變噬菌體表面電荷的納米材料對噬菌體表面進(jìn)行修飾，或者使用脂質(zhì)體或無毒細(xì)菌等作為載體都將有助于噬菌體輸送到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。相信隨著對哺乳動物細(xì)胞攝取噬菌體機制了解的逐漸深入，還會有更多的內(nèi)化入胞策略被開發(fā)出來。在解決內(nèi)化入胞問題的基礎(chǔ)上，還應(yīng)當(dāng)開發(fā)包括溫和噬菌體在內(nèi)的噬菌體資源以豐富噬菌體資源庫；還可以通過基因編輯的手段增強噬菌體對細(xì)胞內(nèi)感染的治療功效?？傊麅?nèi)耐藥病原菌的噬菌體療法富有前景，大有可為。