明陽，陳彬，黃小強(qiáng)

（南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南京大學(xué)化學(xué)與生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，配位化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

自然界中的酶是細(xì)胞產(chǎn)生的天然催化劑，由于酶活性口袋獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，它可以降低反應(yīng)活化能并調(diào)控反應(yīng)過程，從而可以在溫和條件下催化高度化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性的反應(yīng)［1］。得益于微生物學(xué)、分子生物學(xué)和合成生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的高速發(fā)展，許多具有優(yōu)異催化性能的酶已經(jīng)可以市場化，大大擴(kuò)展了生物催化工具箱［2］。以酶催化為基石的生物制造可以顯著降低成本和能源消耗，還具有優(yōu)異的反應(yīng)活性和選擇性，因此酶廣泛用于食品和動(dòng)物飼料、日化、制藥和生物技術(shù)研發(fā)等行業(yè)［3?5］。最近的一份統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，2021 年全球酶市場價(jià)值約58 億美元，預(yù)計(jì)到2031 年將達(dá)102 億美元［6］。而在學(xué)術(shù)研究領(lǐng)域，化學(xué)家們對反應(yīng)選擇性，尤其是立體選擇性的追求越來越高。酶催化由于具有綠色可持續(xù)、活性高與選擇性可進(jìn)化、可調(diào)控的優(yōu)點(diǎn)，所以其被視為一個(gè)解決傳統(tǒng)合成所面臨的環(huán)境、效率和立體控制等問題的潛在完美方案［7?8］。然而，相對于傳統(tǒng)化學(xué)催化劑，現(xiàn)有酶催化的反應(yīng)類型相對有限，難以滿足綠色生物合成的需求。因此，如何通過擴(kuò)展酶的催化功能來實(shí)現(xiàn)更多更廣泛的生物合成，是當(dāng)下科學(xué)前沿的熱點(diǎn)問題［9］。

太陽能是一種環(huán)保無污染、豐富且可再生的清潔能源，因此被視為一種綠色化學(xué)合成的“理想試劑”［10］。1912 年，有機(jī)光化學(xué)的先驅(qū)人物Giacomo Ciamician 最早闡述了這一觀點(diǎn)［11］，在題為《未來的光化學(xué)》的文章中提到：一個(gè)新的、對環(huán)境更負(fù)責(zé)任的化學(xué)工業(yè)，可以用清潔、經(jīng)濟(jì)、高效的光化學(xué)轉(zhuǎn)化取代高能合成工藝，并由此帶來巨大的生態(tài)效益。就像植物能利用陽光作為可再生能源將CO2和水轉(zhuǎn)化為有機(jī)化合物，光化學(xué)合成相較于傳統(tǒng)合成的優(yōu)勢在于更清潔、可持續(xù)。此外，新型高效光催化劑的開發(fā)［12?13］，豐富了光催化的機(jī)理途徑［14］，進(jìn)而推動(dòng)了光催化水裂解制氫［15］、CO2還原生產(chǎn)燃料［16］、降解有機(jī)污染物［17?18］以及選擇性有機(jī)合成［19?21］等領(lǐng)域的發(fā)展。在過去的十余年中，可見光催化與合成化學(xué)的交叉融合已經(jīng)成為了一個(gè)非常重要的研究領(lǐng)域。然而，光誘導(dǎo)所產(chǎn)生的高能有機(jī)中間體通常面臨著活性過高、反應(yīng)性難以調(diào)控、副反應(yīng)較多等問題［22?24］。因此，如何恰當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)光催化合成體系，從而合理地避免副反應(yīng)發(fā)生，提高反應(yīng)的選擇性，是目前光催化有機(jī)合成的難點(diǎn)。

光酶催化能夠一定程度上解決可見光催化和酶催化分別面臨的問題，同時(shí)通過整合各自的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)高附加值化合物的高效、可持續(xù)綠色制造［25?28］。一方面，基于可見光催化在溫和條件下產(chǎn)生的活潑化學(xué)中間體，光酶催化不僅能夠利用光再生輔因子來發(fā)揮酶的天然活性，還能引發(fā)酶的非天然反應(yīng)活性，獲得新酶催化功能；另一方面，利用酶催化的高選擇性和可定向進(jìn)化的特性［29?30］，光酶催化能夠調(diào)控光引發(fā)的活潑反應(yīng)中間體，從而為光化學(xué)領(lǐng)域的立體化學(xué)控制難題提供新的解決方案。自然界中被人們所揭示的天然光酶催化合成系統(tǒng)有四類，包括：光合系統(tǒng)［31?32］、光裂合酶［33］、原葉綠素酸酯氧化還原酶［34］和脂肪酸光脫羧酶［35?36］。近年來，得益于多學(xué)科技術(shù)的交叉融合，非天然的光酶催化發(fā)展迅速，在合成領(lǐng)域展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用潛力。光酶催化目前已成功用于催化碳碳、碳氮、碳氧、碳鹵成鍵等重要的生化反應(yīng)，在催化活性、反應(yīng)選擇性、底物譜拓展等方面表現(xiàn)出其獨(dú)有的優(yōu)勢［8］。

本文綜述光酶催化合成領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，根據(jù)光與酶的結(jié)合模式，將本文分成四部分內(nèi)容討論（圖1）：光氧化還原實(shí)現(xiàn)輔因子再生；光催化劑?酶的協(xié)同或串聯(lián)；光激發(fā)已知酶實(shí)現(xiàn)新轉(zhuǎn)化；人工光酶。本文將歸納近年來典型的有關(guān)光酶催化合成的研究報(bào)道，重點(diǎn)分析光酶催化反應(yīng)的化學(xué)機(jī)制和實(shí)現(xiàn)新生物轉(zhuǎn)化的策略，通過分析該領(lǐng)域當(dāng)下面臨的瓶頸，進(jìn)一步展望光酶催化未來的發(fā)展方向。

圖1 光酶催化模式圖Sub-底物；Prod-產(chǎn)物；Int-中間體Fig. 1 Photobiocatalytic modes diagramSub-substrate; Prod-product; Int-intermediate

1 光氧化還原實(shí)現(xiàn)輔因子再生

通過光氧化還原催化實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)所需輔因子的再生，是光酶結(jié)合最直觀的系統(tǒng)，也是最容易實(shí)現(xiàn)、早期報(bào)道最多的系統(tǒng)［37］，其意義在于替代成本高昂的天然輔因子，或簡化電子傳遞鏈從而實(shí)現(xiàn)更高效的反應(yīng)。如圖1（a）所示，該耦合系統(tǒng)有5 個(gè)組成部分：底物/產(chǎn)物、氧化還原酶（redox enzyme）、輔因子（cofactor）/氧化還原介質(zhì)（mediator）、光催化劑（photocatalyst）以及電子犧牲供體/受體。通常，該系統(tǒng)可以看作由協(xié)同的酶氧化還原循環(huán)和光氧化還原循環(huán)組成。以光催化循環(huán)實(shí)現(xiàn)輔因子的還原再生為例：首先，光催化劑被光激發(fā)，從犧牲電子供體中捕獲電子或氫原子；隨后，電子從還原態(tài)光催化劑直接或間接轉(zhuǎn)移至輔因子，實(shí)現(xiàn)輔因子的還原再生；最后，氧化還原酶利用再生的輔因子，將底物還原為對應(yīng)產(chǎn)物［38］。目前常見的犧牲電子供體包括叔胺［如三乙醇胺（TEOA）、乙二胺四乙酸（EDTA）］、有機(jī)酸（如甲酸、抗壞血酸）、含硫化合物（如甲硫氨酸、聯(lián)二亞硫酸鹽）、兩性離子緩沖液［2?嗎啉乙磺酸（MES）、4?羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）］等；而光催化劑的種類更加多樣，包括各種金屬有機(jī)絡(luò)合物、有機(jī)染料（如卟啉?葉綠素、黃嘌呤、黃素）和納米材料［如量子點(diǎn)（QD）、氮化碳（CN）、碳點(diǎn)（CD）］等；目前報(bào)道過的輔因子/介質(zhì)主要包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NAD（P）H、黃素（flavins，如FMN/FAD）、甲基紫精（methyl viologen， MV2+）、銠絡(luò)合物等［39］（圖2）。目前已有許多綜述總結(jié)了有關(guān)研究［37?41］，因此本文僅介紹一些近期報(bào)道的典型例子。

圖2 光氧化還原實(shí)現(xiàn)輔因子再生系統(tǒng)中常見的犧牲電子供體、輔因子或介質(zhì)Fig. 2 Common sacrificial electron donors and cofactors/mediators in photoredox?enabled cofactor regeneration system

2018 年，Paul 和Park 等［42］報(bào)告了使用光驅(qū)動(dòng)氮摻雜碳納米點(diǎn)（N?CDs）再生輔因子NADH 及其類似物，并用于老黃酶（old yellow enzyme，OYE）催化的不對稱碳碳雙鍵的還原反應(yīng)。由N?CDs產(chǎn)生的光激發(fā)電子還原銠絡(luò)合物（Mox），還原態(tài)的銠絡(luò)合物Mred將基質(zhì)中的輔因子NAD+還原進(jìn)而將氫負(fù)提供給老黃酶中的輔基（黃素單核苷酸FMN），完成酶活化底物的立體選擇性還原。同年，Kottke 等［43］使用藍(lán)光和犧牲還原供體EDTA再生黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），開發(fā)了一例光化學(xué)驅(qū)動(dòng)的黃素依賴鹵代酶催化的色氨酸5?位氯化反應(yīng)。該系統(tǒng)通過照射酶結(jié)合的黃素而不是游離黃素，避免了游離黃素之間的無效電子循環(huán)，提高了電子傳遞效率。

在光合系統(tǒng)中，錨定在類囊體膜上的鐵氧還蛋白將電子傳遞給NADP+還原酶（FNR），實(shí)現(xiàn)NADPH 的高效再生。受此啟發(fā)，整合天然酶與半導(dǎo)體光催化劑而構(gòu)建的光?酶耦合催化系統(tǒng)（PECCS），在清潔能源轉(zhuǎn)化和大宗化學(xué)品合成方面具有巨大的前景。姜忠義/石家福團(tuán)隊(duì)［44］將銠絡(luò)合物（［Cp*Rh（bpy）H2O］2+）通過單寧酸/聚乙烯亞胺（TA/PEI）黏合層錨定在聚合物氮化碳（PCN）上，獲得了PCN@TA/PEI?Rh 這種核殼結(jié)構(gòu)的光催化劑。在可見光照射下，電子從PCN 核被激發(fā)，然后通過TA/PEI 殼轉(zhuǎn)移，最后被表面錨定的銠絡(luò)合物捕獲，用于NADH 的再生。核殼結(jié)構(gòu)促進(jìn)了電子轉(zhuǎn)移，將電子利用效率提高了約1.3 倍。將該NADH 再生系統(tǒng)與甲酸脫氫酶耦合，實(shí)現(xiàn)了從二氧化碳到甲酸的生產(chǎn)。之后，他們進(jìn)一步優(yōu)化了該核殼的光催化體系，以石墨碳氮化物（GCN）內(nèi)核作為光敏劑，將銠氫絡(luò)合物包埋在二氧化鈦涂層（MH/TiO2）中作為氧化還原介質(zhì)，用于乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）催化的乙醇生產(chǎn)［45］。其中MH/TiO2涂層起到兩個(gè)重要作用：①保護(hù)乙醇脫氫酶不被涂層中的GCN 核和MH 影響而失活；②允許電子從GCN轉(zhuǎn)移到NAD+，然后在ADH催化下轉(zhuǎn)移到甲醛。該光酶系統(tǒng)能以（1.78±0.21）μmol/（min·mgADH）的速率產(chǎn)生甲醇，比不含涂層的ADH?GCN 系統(tǒng)高了420%。

除了核殼結(jié)構(gòu)，受類囊體顆粒堆疊結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，姜忠義/石家福團(tuán)隊(duì)［46］還設(shè)計(jì)了堆疊管狀聚合氮化碳（st?PCN*）負(fù)載氯過氧化物酶（chloroperoxidase， CPO）的光酶耦合系統(tǒng)--st?PCN*@CPO?PECCS，前者既是光氧化還原再生H2O2的模塊，也是酶的載體。該結(jié)構(gòu)克服了傳統(tǒng)光酶耦合系統(tǒng)中由于使用游離的酶所導(dǎo)致的輔因子擴(kuò)散距離長、利用效率低的缺點(diǎn)，使整體光酶耦合催化效率顯著提高。在模擬陽光照射下，該系統(tǒng)可以向CPO 原位、連續(xù)和可控地供應(yīng)H2O2，以完成后續(xù)的單氯二酮（MCD）轉(zhuǎn)化為二氯二酮（DCD）的氧化氯化反應(yīng)，MCD 的最終轉(zhuǎn)化率可達(dá)39.5%。該系統(tǒng)的初始反應(yīng)速率（MCD 的轉(zhuǎn)化速率）可達(dá)0.29 mmol/（L·h），是具有非堆疊結(jié)構(gòu)對應(yīng)PECCS的20倍以上。進(jìn)一步，姜忠義/石家福團(tuán)隊(duì)［47］開發(fā)了一種基于類囊體膜的膠囊結(jié)構(gòu)的光?酶耦合催化系統(tǒng)（圖3），重點(diǎn)增強(qiáng)輔因子穿梭模塊的效率，從而提高整體光酶耦合催化的效率。在該系統(tǒng)中，酶和光催化劑分別固定在膜的外表面和內(nèi)表面上，而NAD+/NADH輔因子被限制在膜中，并在酶和光催化劑之間快速穿梭，NAD（H）的表觀和固有穿梭數(shù)是非集成PECCS 的8～12 倍。將該系統(tǒng)用于丙醛還原為丙醇的反應(yīng)，轉(zhuǎn)化頻率（TOF）可達(dá)（38 000±365） h-1。

圖3 類囊體膠囊啟發(fā)的光酶耦合系統(tǒng)及輔因子穿梭過程示意圖Fig. 3 Illustration of the thylakoid membrane?inspired capsule (TMC) and the NAD+/NADH shuttling process

2 光催化劑-酶的協(xié)同或串聯(lián)

由于光催化反應(yīng)通常在室溫下進(jìn)行，并且可以通過光引發(fā)的電子轉(zhuǎn)移或能量轉(zhuǎn)移［48］生成水相中穩(wěn)定的中間體，這使得光與酶的協(xié)同或串聯(lián)組合成為可能。通過光催化劑?酶的協(xié)同或串聯(lián)，可以設(shè)計(jì)多種新穎的反應(yīng)，同時(shí)避免分離中間產(chǎn)物的步驟，有利于簡化操作并提高效率［49］。但是由于光化學(xué)反應(yīng)和酶催化反應(yīng)的條件通常不完全相符，且兩個(gè)體系有可能互相干擾，因此開發(fā)動(dòng)力學(xué)匹配、兼容耐受的光酶協(xié)同體系［50］，或是通過酶固定化等方法避免體系間的不利影響，是開發(fā)新型光催化劑?酶的協(xié)同或串聯(lián)系統(tǒng)的重點(diǎn)。根據(jù)外加光催化劑發(fā)揮的不同作用，本節(jié)分以下四部分內(nèi)容展開討論。

2.1 光能量轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)底物異構(gòu)化

2018 年，趙惠民、Hartwig 等［51］報(bào)道了基于光能量轉(zhuǎn)移和烯烴還原酶的協(xié)同催化反應(yīng)［圖4（a）］。作者利用［Ir（dmppy）2（dtbbpy）］PF6或FMN 作為光催化劑，通過光誘導(dǎo)能量轉(zhuǎn)移促進(jìn)烯烴的E/Z異構(gòu)化；同時(shí)結(jié)合烯烴還原酶和煙酰胺輔因子再生系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)酶催化優(yōu)選的E?構(gòu)型烯烴的高對映選擇性還原，從而富集得到單一構(gòu)型的還原產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上，2020 年趙惠民團(tuán)隊(duì)［52］通過利用光氧化還原再生FMNH2的系統(tǒng)，在不使用NADPH 再生系統(tǒng)的情況下（以EDTA 或TEOA 為終端還原劑），也實(shí)現(xiàn)了活化烯烴的協(xié)同立體匯聚式還原。

圖4 光引發(fā)的能量/電子轉(zhuǎn)移生成酶優(yōu)選底物En-烯胺催化；H·-氫原子轉(zhuǎn)移催化Fig. 4 Convert substrate into enzyme?preferred ones by photoinduced energy/electron transferEn-enamine catalysis; H·-hydrogen atom transfer catalysis

2.2 光電子轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)底物消旋化

動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分（dynamic kinetic resolution，DKR）依賴于底物對映體間的快速相互轉(zhuǎn)化，結(jié)合立體選擇性鍵形成，可以將外消旋底物轉(zhuǎn)化為對映體純的產(chǎn)物［53?54］。

2018 年周少林等［55］利用可見光引發(fā)的單電子轉(zhuǎn)移（single electron transfer， SET）實(shí)現(xiàn)底物消旋，并協(xié)同脂肪酶催化的選擇性酰胺化，實(shí)現(xiàn)了一例溫和條件下的胺類化合物的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分［圖4（b）上］。機(jī)理上，光激發(fā)的雙環(huán)金屬化銥絡(luò)合物首先氧化硫醇，生成相應(yīng)的硫自由基，通過可逆的氫原子轉(zhuǎn)移（hydrogen atom transfer，HAT）實(shí)現(xiàn)氨基鄰位的立體中心的快速消旋化。另外，作者使用商品化的脂肪酶Novozyme 435，能夠選擇性識別某一個(gè)構(gòu)型的胺，在酰基供體存在的條件下，完成動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)酰胺化轉(zhuǎn)化。

2020 年MacMillan、Hyster 等［56］結(jié)合光?小分子胺催化的酮羰基β?C-H 鍵的消旋和酶催化的對映選擇性羰基轉(zhuǎn)化，成功實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)程惰性C-H 鍵的動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分［圖4（b）下］?；贛acMillan前期有關(guān)小分子胺催化和光催化的研究［57］，作者利用激發(fā)態(tài)光催化劑單電子氧化烯胺中間體，得到相應(yīng)的自由基陽離子中間體，從而使得原羰基的惰性β?C-H 鍵酸性增強(qiáng)；經(jīng)由去質(zhì)子化過程，轉(zhuǎn)變成5π 電子的自由基中間體；該5π 電子中間體為平面型中間體，在后續(xù)的氫原子轉(zhuǎn)移重構(gòu)β?CH鍵過程中，完成羰基化合物β?位靜態(tài)立體中心的外消旋化。與此同時(shí)，協(xié)同利用酮還原酶（或轉(zhuǎn)氨酶）選擇性識別R-構(gòu)型的羰基底物，不斷地將原料立體選擇性地還原為具有雙手性中心的醇（或胺）。作者提出的這一光?化學(xué)小分子催化劑結(jié)合的策略，構(gòu)建了一類特有的外消旋化平臺，突破了傳統(tǒng)上對于靜態(tài)立體中心的定義，通過與其他催化羰基官能團(tuán)轉(zhuǎn)化的生物催化過程聯(lián)用，有望開發(fā)更多立體匯聚式轉(zhuǎn)化。

2.3 光催化劑選擇性還原酶活化的底物

除了通過光能量/電子轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)底物的異構(gòu)化/外消旋化，還可以利用酶活口袋對于底物的氫鍵活化作用，降低底物還原電勢，從而使光催化劑可以選擇性還原酶結(jié)合的底物，再結(jié)合酶活性口袋的立體化學(xué)控制能力，開發(fā)高選擇性的非天然生物催化反應(yīng)。

2018 年，Hyster 等［58］利用光氧化還原催化劑與酶的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了氧化還原酶新的催化功能［圖5（a）］。在可見光照射下，激發(fā)態(tài)的光催化劑Rose Bengal 將酶口袋中通過氫鍵結(jié)合的底物單電子還原，脫去乙酸根陰離子后生成α?羰基碳自由基中間體，接著與酶口袋中的NADPH 發(fā)生HAT，最終實(shí)現(xiàn)煙酰胺依賴的雙鍵還原酶催化的對映選擇性脫乙酰氧基反應(yīng)。此外，以曙紅Y 為光催化劑，酮還原酶還可以催化α?溴酰胺的自由基脫鹵化反應(yīng)。該策略展示了通過光氧化還原催化與生物催化的結(jié)合拓展天然酶反應(yīng)性的巨大潛力。

圖5 光催化劑選擇性還原酶活化的底物以完成非天然轉(zhuǎn)化NtDBR-來自煙草的煙酰胺依賴性雙鍵還原酶DBR；RB-孟加拉玫瑰紅；MorB-來自普氏瘧原蟲的嗎啡酮還原酶；RuⅡ-Ru（bpy）；NostocER-來自點(diǎn)型念珠藍(lán)細(xì)菌的烯烴還原酶； YqjM?S/R-來自枯草芽孢桿菌的（S/R選擇性）烯烴還原酶；OBzF5-五氟苯甲酰氧基Fig. 5 Selected reductions of the enzyme activated substrates by photocatalysts to achieve unnatural transformationsRB-Rose Bengal; MorB-morphinone reductase from P. putida; RuⅡ-Ru(bpy); NtDBR-Double bond reductase from Nicotiana tabacum;NostocER-Ene?Reductase from N. punctiforme; YqjM?S/R-Ene?Reductase from Bacillus subtili; OBzF5-perfluorobenzoyloxy

黃素依賴性烯烴還原酶是催化烯烴不對稱還原的高選擇性酶催化劑，然而該酶的天然底物僅限于有吸電子取代基（如醛基、羧基、酯基、酮基、腈基和硝基等）的烯烴。2019 年Hyster 課題組［59］利用Ru（bpy）3Cl2在光照下選擇性單電子還原與烯烴還原酶結(jié)合的酮類底物，通過酮基自由基（ketyl radical）和FMNhq之間的HAT，實(shí)現(xiàn)烯烴還原酶對非天然的酮類底物的對映選擇性還原［圖5（b）］。之后在2020 年，Hyster 等［60］利用類似的策略實(shí)現(xiàn)了乙烯基吡啶類底物的對映選擇性還原［圖5（c）］，進(jìn)一步證明了光酶協(xié)同催化對于開發(fā)天然酶新功能的重要作用。

Hyster 組［61］近期的一個(gè)相關(guān)工作描述了通過在蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)內(nèi)生成氮自由基，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)不對稱氫胺化反應(yīng)的例子［圖5（d）］。首先，外源光催化劑Ru（bpy）3Cl2被激發(fā)后產(chǎn)生長壽命三重態(tài)激發(fā)態(tài)絡(luò)合物*RuⅡ，其被酶中的輔因子FMNsq還原為RuⅠ，后者將電子轉(zhuǎn)移給與酶結(jié)合的肟酯底物，脫去苯甲酸陰離子后，生成氮中心自由基。生成的氮自由基與分子內(nèi)（或另一分子）的烯烴加成，得到的前手性碳自由基中間體與還原態(tài)輔因子FMNhq發(fā)生立體選擇性的HAT過程，最終生成對映體富集的環(huán)化產(chǎn)物。該文報(bào)道了5?exo、6?endo、7?endo和8?endo以及分子間氫胺化產(chǎn)物，并通過定向進(jìn)化得到了兩種對映選擇性互補(bǔ)的酶催化劑。

2.4 光生反應(yīng)中間體參與后續(xù)酶促反應(yīng)

2018 年Castagnolo 等［62］報(bào)道了將光催化硫代Michael 加成與生物催化酮還原相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)1，3?巰基烷醇對映選擇性合成的光生物催化級聯(lián)反應(yīng)。2019 年，何延紅、官智等報(bào)道的三聯(lián)吡啶釕和脂肪酶［63］的結(jié)合體系，實(shí)現(xiàn)了2，2?二取代吲哚?3?酮的直接不對稱合成［圖6（a）］［64］。首先，2?苯基吲哚被激發(fā)態(tài)的光敏劑*RuⅡ單電子氧化為自由基陽離子中間體；而經(jīng)歷單電子轉(zhuǎn)移得到的RuⅠ被O2氧化回基態(tài)RuⅡ，以完成光氧化還原催化循環(huán)。在此過程中O2被還原為超氧自由基陰離子O·-2，O·-2與吲哚自由基陽離子經(jīng)過加成、分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移、脫水過程后形成亞胺酮中間體。最后，小麥胚芽脂肪酶（wheat germ lipase， WGL）的催化三聯(lián)體［Asp（or Glu）?His?Ser］質(zhì)子化亞胺酮中間體；與此同時(shí)，丙酮在酶活性口袋中形成烯醇化陰離子；烯醇化陰離子進(jìn)攻亞胺離子中間體以生成最終的對映體富集產(chǎn)物。

圖6 光生反應(yīng)中間體參與后續(xù)酶促反應(yīng)Fig. 6 Photogenerated intermediates take part in subsequent enzyme?catalyzed reactions

H2O2是多種過氧化物酶與過氧合酶的共底物，能夠直接參與酶催化的氧化還原反應(yīng)，避免漫長復(fù)雜的電子傳遞鏈，提高反應(yīng)效率［65?66］。但是高濃度的H2O2或者使用葡萄糖/葡萄糖氧化酶生成H2O時(shí)產(chǎn)生的副產(chǎn)物改變體系pH 值［13］，均可能引起生物催化劑的失活。Frank Hollmann 等［27］利用無機(jī)光催化劑金?二氧化鈦（Au?TiO2），將甲醇和氧氣轉(zhuǎn)化為CO2和H2O2，為過氧合酶rAaeUPO 原位提供H2O2，克服了該酶在高濃度H2O2存在下穩(wěn)健性差的缺陷，使得酶在催化過程中保持高度活性和穩(wěn)定性。通過使用該策略，rAaeUPO 將乙苯立體選擇性羥化為R?1?苯乙醇，并實(shí)現(xiàn)了高對映體選擇性（＞98% ee）和優(yōu)異的催化轉(zhuǎn)化率（TTN＞71 000）。類似地，Hollmann 課題組［67］還開發(fā)了以水為最終犧牲電子供體的Au?TiO2?H2O2?rAaeUPO 耦合系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了可見光驅(qū)動(dòng)的C-H 對映選擇性氧化。進(jìn)一步，張武元、Hollmann等［68］在2020年利用光引發(fā)的蒽醌?2?磺酸鈉催化過氧化氫的原位生成，與鹵素過氧化物酶（或過氧合酶）協(xié)同，實(shí)現(xiàn)了多種底物的鹵化和羥基化轉(zhuǎn)化［圖6（b）］。

3 光激發(fā)已知酶實(shí)現(xiàn)新轉(zhuǎn)化

上述光催化劑?酶的協(xié)同或串聯(lián)反應(yīng)，需要外加光催化劑以完成光激發(fā)過程，與酶催化的非光過程是相對獨(dú)立的。除此之外，能夠直接被光激發(fā)的一些酶或酶?底物絡(luò)合物將在本節(jié)重點(diǎn)介紹。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的4類天然光酶催化中：光合系統(tǒng)是地球上最重要也最早出現(xiàn)的光酶過程，由光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ組成，是自然界有機(jī)物生產(chǎn)的基礎(chǔ)［31?32］；光裂合酶作為一種DNA 修復(fù)酶，可以利用藍(lán)光催化光解環(huán)丁烷嘧啶二聚體（紫外線照射導(dǎo)致鄰近的胸腺嘧啶或胞嘧啶二聚），修復(fù)受損DNA［33］；原葉綠素酸酯氧化還原酶是一種依賴NADPH的光促酶，通過將原葉綠素還原為葉綠素a，參與葉綠素的合成［34］；以及從變異小球藻（Chlorella variabilis）中發(fā)現(xiàn)的FAD 依賴的脂肪酸光脫羧酶CvFAP［35?36］。前三類發(fā)現(xiàn)較早，酶的底物特異性也很高，難以用于開發(fā)新反應(yīng)。本部分重點(diǎn)介紹CvFAP 的光催化新轉(zhuǎn)化以及光激發(fā)自然界中的非光酶而產(chǎn)生的非天然光反應(yīng)。

3.1 CvFAP

2017 年， Beisson 及其同事首次報(bào)道了CvFAP，證明其可以在可見光激發(fā)下，催化一系列中長鏈（C12～C18）游離脂肪酸脫羧生成相應(yīng)的烷烴或烯烴［35］，之后又對其機(jī)理進(jìn)行了更詳細(xì)的研究［圖7（a）］［36］。藍(lán)光激發(fā)生成FAD*與脂肪酸陰離子發(fā)生迅速的單電子轉(zhuǎn)移過程，隨后CO2脫去，留下烷基自由基和FAD 自由基陰離子；之后從FAD 自由基陰離子到烷基自由基發(fā)生反向電子轉(zhuǎn)移（back electron transfer， BET），然后通過精氨酸給質(zhì)子生成產(chǎn)物烷烴，并留下紅移態(tài)的FADRS。脫去的CO2大約有75%形成碳酸氫鹽，用于隨后的FAD再生和精氨酸質(zhì)子化，以完成整個(gè)催化循環(huán)。

圖7 CvFAP的催化機(jī)理及其應(yīng)用實(shí)例Arg-精氨酸；FAD-核黃素腺嘌呤二核苷酸；FADRS-紅移態(tài)的核黃素腺嘌呤二核苷酸；Rac-外消旋Fig. 7 Photobiocatalytic mechanism of CvFAP and the application exampleArg-Arginine; FAD-flavin adenine dinucleotide; FADRS-red?shifted oxidized flavin; Rac-racemic

自發(fā)現(xiàn)CvFAP 以來，研究者們通過酶工程等策略，實(shí)現(xiàn)了更多種類的光酶轉(zhuǎn)化。Hollmann等［69］設(shè)計(jì)了一種誘餌分子接入酶的活性口袋，以實(shí)現(xiàn)短鏈脂肪酸的更有效脫羧，使CvFAP 的底物范圍突破長鏈脂肪酸的限制，實(shí)現(xiàn)H2、甲烷、烯烴等燃?xì)獾闹苽洹Ｔ诹硪豁?xiàng)研究中，吳起等［70］根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)和分子動(dòng)力學(xué)模擬，通過位點(diǎn)特異性突變在關(guān)鍵位點(diǎn)引入大位阻氨基酸，修飾底物結(jié)合通道，使其變得更窄，從而通過疏水相互作用更好地穩(wěn)定其中一個(gè)構(gòu)型的底物?；诖?，他們開發(fā)出了CvFAP 的突變體G462Y，能夠選擇性地催化多種S?構(gòu)型的α?氨基酸和α?羥基酸的光脫羧反應(yīng)［圖7（b）］，以最高達(dá)99% ee的對映選擇性獲得未反應(yīng)的R?產(chǎn)物，即實(shí)現(xiàn)消旋的α?官能化羧酸底物的動(dòng)力學(xué)拆分。這項(xiàng)工作是通過酶工程實(shí)現(xiàn)CvFAP 不對稱催化的第一個(gè)例子，同時(shí)作者所采用的理性設(shè)計(jì)［71］的思路可以大大減少酶工程面臨的篩選工作的困難。此外，吳起、徐鑒等還報(bào)道了將CvFAP 通過酶工程化用于光脫羧氘化［72］和反式脂肪酸的選擇性光脫羧［73］的研究，進(jìn)一步拓展了CvFAP 的催化功能。2022 年，張武元課題組［74］報(bào)道了利用CvFAP 將環(huán)氧脂肪酸轉(zhuǎn)化成脂肪環(huán)氧化物的反應(yīng)，使用所得脂肪環(huán)氧化物進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)化，可以生產(chǎn)高附加值脂肪醇、醚和二醇等增值化合物。而偶合脂肪酶、過氧化物酶和光脫羧酶的三酶級聯(lián)系統(tǒng)，還能以甘油三酯為原料獲得脂肪環(huán)氧化物。

Scrutton 等［75］利用大腸桿菌和鹵單胞菌等底盤表達(dá)CvFAP 的突變體，利用生物質(zhì)或工業(yè)廢物的脂肪酸生物制造燃料丙烷/丁烷，描繪了一幅規(guī)?；G色生產(chǎn)氣體燃料的生物工廠藍(lán)圖，有助于為現(xiàn)有化石能源供應(yīng)提供經(jīng)濟(jì)、可持續(xù)、安全和清潔的替代品（圖8）。而Kabisch 等［76］通過在產(chǎn)油酵母中異源表達(dá)CvFAP，整合了甘油轉(zhuǎn)化為脂肪酸和脂質(zhì)的代謝通路和CvFAP 催化脫羧的新反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了可再生資源到生物燃料的生物制造。此外，吳起、徐鑒等［77］最近還開發(fā)了一種光化學(xué)?酶多步組合策略：串聯(lián)了脂肪酶催化的甘油酯水解、CvFAP 催化的油酸脫羧、長鏈烯烴的光催化氧化裂解以及CvFAP 突變體催化的中短鏈脂肪酸的最終脫羧，實(shí)現(xiàn)了從三油酸甘油酯到短鏈烷烴的生物燃料制造。這些工作初步展示出光微生物細(xì)胞工廠的巨大應(yīng)用前景。

圖8 整合了CvFAP突變體的光微生物細(xì)胞工廠在生產(chǎn)生物燃料中的應(yīng)用Fig. 8 Light?driven microbial cell factories integrating CvFAP mutant for biofuel production

3.2 煙酰胺依賴酶

除了上述天然光酶外，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)自然界存在的其他氧化還原酶也可以被光激發(fā)，從而誘導(dǎo)酶的混雜反應(yīng)性。含有煙酰胺和黃素的酶如酮還原酶、烯烴還原酶等在自然界中普遍存在，參與生物體中非光驅(qū)動(dòng)的雙電子氧化還原代謝過程［78?79］。這些酶的輔因子可以通過與非天然底物形成電子供體?受體復(fù)合物（electron donor?acceptor complex， EDA 復(fù)合物）［80?81］，接著通過可見光激發(fā)誘發(fā)SET 生成自由基物種，實(shí)現(xiàn)光誘導(dǎo)的酶的非天然反應(yīng)。EDA 復(fù)合物產(chǎn)生于電子受體和供體之間的前線軌道（HOMO/LUMO）的電子耦合，并可吸收可見光以引發(fā)SET，隨后生成自由基離子對，通過在底物中添加離去基團(tuán)以促進(jìn)該過程向生成自由基的方向不可逆地進(jìn)行。

2016 年，Hyster 等［82］報(bào)道了第一個(gè)使用光激發(fā)天然非光酶，實(shí)現(xiàn)非天然單分子反應(yīng)的例子（圖9）。作者使用的酮還原酶是一類NADPH 依賴的氧化還原酶，通常催化羰基的還原，而在該案例中，鹵代內(nèi)酯底物與酶口袋中的NADPH 形成EDA 復(fù)合物，并通過光激發(fā)的單電子轉(zhuǎn)移以及隨后的氫原子轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)了鹵代內(nèi)酯的不對稱自由基脫鹵化反應(yīng)。最近，吳起、徐鑒等［83］報(bào)道了光誘導(dǎo)黃素依賴的環(huán)己酮單加氧酶（CHMO）的還原脫鹵混雜反應(yīng)性，可以將α-鹵代?α?氟代酮對映選擇性地還原為手性α?氟代酮。通過機(jī)理實(shí)驗(yàn)和模擬計(jì)算揭示了其電子轉(zhuǎn)移/質(zhì)子轉(zhuǎn)移機(jī)制（ET/PT），與以往報(bào)道的天然還原酶的光誘導(dǎo)脫鹵反應(yīng)不同，該文提出脫鹵后生成的自由基中間體不是通過HAT 生產(chǎn)最終產(chǎn)物，而是經(jīng)歷ET/PT 過程分別從輔酶和溶劑中獲得電子和質(zhì)子，從而生成最終產(chǎn)物。

圖9 光誘導(dǎo)醇脫氫酶實(shí)現(xiàn)鹵代內(nèi)酯的脫鹵化LKADH-來自克菲里乳桿菌的短鏈脫氫酶；RasDH-來自雷氏菌屬的短鏈脫氫酶Fig. 9 Dehalogenation of halogenated lactones by light?induced alcohol dehydrogenaseLKADH-short?chain dehydrogenase from Lactobacillus kefiri;RasDH-short?chain dehydrogenase from Ralstonia species

2022 年，趙惠民、王斌舉等報(bào)道了光誘導(dǎo)的酮還原酶催化的分子間自由基共軛加成反應(yīng)（圖10）［84］。作者借鑒了聚焦理性迭代位點(diǎn)特異性突變策略（focused rational iterative site?specific mutagenesis， FRISM）［71，85］對商品化的酮還原酶P2?D12 進(jìn)行了半理性改造，篩選出具有高產(chǎn)率和對映選擇性的酶突變體。通過理論計(jì)算和機(jī)理研究，作者對該反應(yīng)的機(jī)理和立體選擇性的起源進(jìn)行了較全面的解釋：與酮還原酶結(jié)合的NADPH 和相鄰的自由基前體鄰苯二甲酰亞胺活化的酯通過π?π堆疊相互作用形成EDA 復(fù)合物，在光激發(fā)下經(jīng)歷SET 過程，后續(xù)經(jīng)歷N-O 鍵斷裂并脫羧產(chǎn)生烷基自由基。富電子的烷基自由基對有缺電子基團(tuán)的α，α?二取代末端烯烴進(jìn)行共軛加成，生成前手性自由基中間體，最后通過立體選擇性的HAT 步驟，實(shí)現(xiàn)α?羰基立體中心的構(gòu)建。

圖10 光誘導(dǎo)酮還原酶催化的對映選擇性分子間自由基共軛加成反應(yīng)Fig. 10 Enantioselective intermolecular radical conjugate addition by light?induced ketoreductase

3.3 黃素依賴的烯烴還原酶

2019 年，Hyster 課題組［86?87］報(bào)道了一例光激發(fā)烯烴還原酶實(shí)現(xiàn)的分子內(nèi)自由基環(huán)化反應(yīng)，構(gòu)建出對映體富集的五元、六元、七元和八元內(nèi)酰胺［圖11（a）］。機(jī)理研究表明，通過光激發(fā)底物與酶活性位點(diǎn)內(nèi)的還原態(tài)黃素輔因子FMNhq之間形成的EDA 復(fù)合物，發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，底物脫去離去基團(tuán)氯離子后生成碳自由基，對分子內(nèi)的烯烴基團(tuán)進(jìn)行exo?加成或endo?加成，得到β?或γ?前手性立體中心，再通過FMNsq對后者進(jìn)行氫原子轉(zhuǎn)移，得到最終的環(huán)化產(chǎn)物。立體化學(xué)控制是由酶口袋對于自由基加成方向以及后續(xù)HAT 步驟的限制實(shí)現(xiàn)的。這個(gè)案例有力證明了利用可見光激發(fā)口袋內(nèi)的底物?輔因子絡(luò)合物，能開發(fā)出基態(tài)無法進(jìn)行的自由基化學(xué)，實(shí)現(xiàn)天然酶的新催化活性。2022 年，Hyster 等［87］利用類似的策略實(shí)現(xiàn)了自由基分子內(nèi)環(huán)化及烯丙基化反應(yīng)。

圖11 光誘導(dǎo)烯烴還原酶實(shí)現(xiàn)的非天然轉(zhuǎn)化OPR1-12?氧代二甲酸還原酶；OYE1 F298G-老黃酶1的F298G突變體Fig. 11 Light?induced ene?reductase catalyzed unnatural transformationsOPR1-12?oxophytodienoate reductase; OYE1 F298G-mutants F298G of OYE1

2019年，Hyster課題組報(bào)道了一例光激發(fā)黃素依賴的烯烴還原酶催化的氧化還原中性的不對稱自由基環(huán)化反應(yīng)［圖11（b）］［88］。與之前的例子不同在于，這個(gè)例子中沒有使用NADPH 輔因子再生系統(tǒng)，而是用了還原性的三（羥甲基）甲基甘氨酸緩沖體系（tricine buffer）。在光照下，tricine 將一個(gè)電子轉(zhuǎn)移給FMN，生成FMNsq，基態(tài)的FMNsq將底物單電子還原，脫去離去基團(tuán)氯離子后生成前手性的三級烷基自由基，后續(xù)的前手性自由基對苯環(huán)的加成過程受酶口袋環(huán)境的調(diào)控。然后進(jìn)一步單電子轉(zhuǎn)移和去質(zhì)子化，完成重新芳構(gòu)化得到最終的環(huán)化產(chǎn)物。

2020 年，Hyster 等［89］報(bào)道了一例機(jī)理與以往通過EDA 復(fù)合物介導(dǎo)的光酶反應(yīng)不同的案例［圖11（c）］。作者使用紫外光直接激發(fā)烯烴還原酶口袋內(nèi)的還原態(tài)FMNhq，使其能夠還原天然生物催化中低反應(yīng)性的酰胺取代的烯烴，再經(jīng)過質(zhì)子化和酶控制的HAT 過程，實(shí)現(xiàn)非天然的α，β?不飽和酰胺的對映選擇性還原。該策略通過直接激發(fā)酶分子中的輔因子，拓寬了天然酶促烯烴還原反應(yīng)的底物范圍。

2020 年，趙惠民等［90］報(bào)道了第一例光誘導(dǎo)酶催化的非天然兩分子交叉偶聯(lián)反應(yīng)［圖12（a）］。從烯烴與α?鹵代羰基化合物出發(fā)，通過可見光誘導(dǎo)的烯烴還原酶催化的自由基氫烷基化途徑進(jìn)行分子間偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)γ?手性羰基化合物的構(gòu)建。在優(yōu)化條件下，老黃酶OYE1可以以優(yōu)異的產(chǎn)率和對映異構(gòu)體選擇性合成多種含有γ?立體中心的羰基化合物。在不加烯烴底物的情況下能夠觀測到大量脫鹵副產(chǎn)物，這表明FMNhq和α?鹵代羰基化合物在酶口袋內(nèi)形成的EDA 絡(luò)合物，在光激發(fā)條件下足以引發(fā)單電子轉(zhuǎn)移的過程。2021 年，Hyster 課題組［91］報(bào)道了一例相似的分子間氫烷基化反應(yīng)。作者通過瞬態(tài)吸收光譜等機(jī)理實(shí)驗(yàn)，提出該反應(yīng)中烯烴還原酶、酶口袋中的FMNhq、鹵代酰胺以及另一底物α?甲基苯乙烯生成的四元復(fù)合物，是可見光激發(fā)的物種。其中α?甲基苯乙烯的存在可以提高FMNhq電子轉(zhuǎn)移到氯代酰胺底物的量子產(chǎn)率。隨后，Hyster課題組利用煙酰胺依賴型環(huán)己烯酮還原酶（NCR）的變體，報(bào)道了一例基于基態(tài)單電子轉(zhuǎn)移機(jī)制完成的烯烴氫烷基化反應(yīng)［92］。

圖12 光激發(fā)烯烴還原酶實(shí)現(xiàn)的分子間烯烴氫烷基化反應(yīng)（a）和Csp3-Csp3親電交叉偶聯(lián)反應(yīng)（b）Fig. 12 Photoactivated ene?reductases enabled intermolecular reductive coupling couplings for alkene hydroalkylations (a) and Csp3-Csp3 bond formations (b)

2022 年，Hyster 課題組［93］報(bào)道了一例光酶催化的鹵代烷烴和硝基烷烴的不對稱Csp3-Csp3親電交叉偶聯(lián)反應(yīng)［圖12（b）］。α?鹵代羰基化合物和烯烴還原酶口袋中的FMNhq形成EDA 復(fù)合物，在光激發(fā)后優(yōu)先于硝基烷烴被化學(xué)選擇性地單電子還原，進(jìn)一步脫鹵形成烷基自由基。關(guān)鍵的C-C鍵形成步驟是硝基烷烴去質(zhì)子化原位生成的碳負(fù)中心捕獲缺電子的α?羰基碳自由基，然后經(jīng)過亞硝酸根離子脫去步驟，形成前手性碳自由基中間體，最后經(jīng)過酶控制的HAT 實(shí)現(xiàn)立體中心的構(gòu)建。作者篩選出兩種烯烴還原酶CsER 和GluER?T36A，分別催化S?對映體和R-對映體富集產(chǎn)物的生成。值得注意的是，與之前常用的偏中性的緩沖體系不同，該反應(yīng)的緩沖液pH調(diào)到了9.0，有利于硝基烷烴的去質(zhì)子化。

4 人工光酶

人工光敏基團(tuán)和/或人工催化基團(tuán)可以與蛋白骨架結(jié)合，以賦予酶蛋白全新的反應(yīng)性；反過來，酶骨架可以穩(wěn)定在水相中的人工輔因子，并可能為反應(yīng)提供受限環(huán)境或氫鍵作用，從而促進(jìn)反應(yīng)發(fā)生或?qū)崿F(xiàn)選擇性，這是人工光酶的優(yōu)勢。人工光酶的構(gòu)建目前主要有兩種策略：①通過將光敏基團(tuán)與（非天然）氨基酸共價(jià)連接構(gòu)建，利用光敏基團(tuán)促進(jìn)反應(yīng)底物的直接SET過程；②在蛋白質(zhì)骨架內(nèi)，通過密碼子擴(kuò)增技術(shù)引入非天然光敏基團(tuán)，并通過光引發(fā)的電子或能量轉(zhuǎn)移來促進(jìn)反應(yīng)的發(fā)生。

4.1 共價(jià)交聯(lián)酶和光催化劑

2015 年，Lewis 等［94］通過疊氮化物?炔環(huán)加成的點(diǎn)擊化學(xué)策略，將9?甲磺基?10?甲基吖啶（9?mesityl?10?methylacridinium， Acr+?Mes）光敏基團(tuán)共價(jià)連接到脯氨酰寡肽酶（POP）內(nèi)的非天然氨基酸殘基上，構(gòu)建了一種人工光酶，用于硫茴香醚的氧化生成亞砜［圖13（a）］。為了更好地引入人工輔因子，研究者在該酶的活性口袋內(nèi)引入4?疊氮基?L?苯丙氨酸，同時(shí)將附近4 個(gè)氨基酸殘基突變?yōu)楸彼幔瑥亩_發(fā)一個(gè)可以容納大空間位阻的人工輔因子的口袋。機(jī)理研究表明，該反應(yīng)通過酶活性位點(diǎn)內(nèi)硫醚底物的電子攫取開始，蛋白骨架延長了吖啶輔因子的熒光壽命。然而對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然光敏劑成功修飾到生物催化劑上，但與單獨(dú)的Acr+?Mes 相比，人工光酶催化的產(chǎn)率并無提高，甚至有的更低。后來他們又將RuⅡ多吡啶絡(luò)合物引入POP 蛋白骨架，通過修飾吡啶上的取代基以及篩選不同的引入位點(diǎn)，得到了能夠催化二烯酮的分子內(nèi)還原環(huán)化，以及肉桂?；溥蚝??甲氧基苯乙烯之間的［2+2］光環(huán)加成反應(yīng)的人工光酶［圖13（b）］［95］。該酶相比于游離的Ru（bpy）有更高的產(chǎn)率和反應(yīng)速率，但是無法控制反應(yīng)的立體化學(xué)選擇性。

圖13 通過點(diǎn)擊化學(xué)將吖啶類光敏劑（a）、三聯(lián)吡啶釕（b）引入蛋白POP?Z-引入非天然4?疊氮基?L?苯丙氨酸脯氨酰寡肽酶Fig. 13 Introduction of acridine photosensitizer (a) and tris(2,2'?bipyridyl) rutheniumⅡ (b) into protein by clicking chemistryPOP?Z-p?azido?L?phenylalanine (Z) incorporated prolyl oligopeptidase (POP)

2018 年，Cheruzel 等［96］通過蛋白表面的半胱氨酸殘基與碘代乙酰胺衍生物的共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)，構(gòu)建了一種P450 BM3 和釕（Ⅱ）光催化劑的雜合體。通過可見光激發(fā)引發(fā)單電子轉(zhuǎn)移，提供P450催化所必需的還原當(dāng)量，從而實(shí)現(xiàn)了光引發(fā)的P450 催化的天然反應(yīng)--C-H 鍵羥基化。2020年，Brustad 等［97］通過碘代乙酰胺手柄將2 種Acr+?Mes 輔因子與3 類穩(wěn)定且具有大空腔的蛋白質(zhì)骨架中的半胱氨酸結(jié)合，開發(fā)出12 種人工光酶，用于硫茴香醚的氧化（圖14）。作者發(fā)現(xiàn)這些人工光酶的催化性能取決于多種因素，包括Mes?Acr+光敏輔因子、蛋白質(zhì)骨架、輔因子固定的位置以及不同底物等，但由于是在酶表面的凹槽處引入的非天然光敏基團(tuán)，因此亞砜產(chǎn)物并沒有任何立體選擇性，同時(shí)反應(yīng)效率與未結(jié)合的Mes?Acr+相比并沒有顯著優(yōu)勢。

圖14 通過半胱氨酸殘基與碘代乙酰胺衍生物共價(jià)交聯(lián)引入光敏劑構(gòu)建不同人工光酶Fig. 14 Construction of different artificial photoenzymes by introducing photosensitizers through covalent cross?linking of cysteine residues with iodoacetamide derivatives

2022 年，Schlau?Cohen 等［98］通過將商品化的紅藻光合作用捕光蛋白R?藻紅蛋白（R?phycoerythrin， R?PE）與多個(gè)［Ru（bpy）3］2+光催化劑通過酰胺鍵連接，形成新的生物雜化光催化劑，能夠利用630 nm 的紅光，催化硫醇與烯烴的偶聯(lián)以及半胱氨酸的脫硫反應(yīng)等（圖15）。光譜學(xué)等機(jī)理研究表明，該雜化光催化劑中，紅光的能量也能夠從RPE 蛋白有效轉(zhuǎn)移至光催化劑，以增強(qiáng)化學(xué)反應(yīng)性，提高產(chǎn)率。此外，該生物雜化催化劑雖然是一種均相催化劑，卻能夠通過超濾管離心過濾實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用。該策略為開發(fā)獨(dú)特的生物雜化光催化劑提供了新的思路。之后，Hyster、Schlau?Cohen 等［99］共價(jià)連接了烯烴還原酶與經(jīng)典的有機(jī)染料光催化劑，獲得了能夠被低能長波長可見光激發(fā)的新人工光酶，能夠有效催化分子內(nèi)的自由基環(huán)化反應(yīng)。

圖15 通過光合吸光蛋白與光催化劑結(jié)合構(gòu)建吸收低能光的光酶RPE-R?藻紅蛋白，PDB 1EYXFig. 15 Construction of low energy absorption photoenzyme via the combination of photosynthetic light?harvesting protein and photocatalystRPE-R?phycoerythrin, PDB 1EYX

4.2 通過基因密碼子擴(kuò)增技術(shù)插入非天然光敏氨基酸+共價(jià)交聯(lián)催化活性基團(tuán)

王江云及其合作者［100］使用基因密碼子擴(kuò)增技術(shù)將非天然氨基酸插入熒光蛋白（photosensitizer protein， PSP），得到具有二苯甲酮核心骨架的光敏基團(tuán)［101?102］，進(jìn)一步在蛋白表面特定位置，通過半胱氨酸與碘代乙酰胺衍生物共價(jià)交聯(lián)的方式，引入小分子鎳絡(luò)合物，構(gòu)筑了一類新穎的人工光酶。2018 年，基于光引發(fā)的單電子還原和三聯(lián)吡啶鎳絡(luò)合物，實(shí)現(xiàn)了光驅(qū)動(dòng)的二氧化碳還原反應(yīng)［圖16（a）］［103］。2020 年王江云、鐘芳銳、劉曉紅和吳鈺周等［104］將二苯甲酮光敏基團(tuán)與PSP 蛋白表面修飾的二聯(lián)吡啶鎳絡(luò)合物相結(jié)合，基于紫外光引發(fā)的能量轉(zhuǎn)移過程和過渡金屬催化的交叉偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了人工光酶催化的鹵代芳烴脫鹵羥化反應(yīng)以及C-N 鍵構(gòu)建反應(yīng)［圖16（b）］。研究發(fā)現(xiàn)，通過精確調(diào)控光敏基團(tuán)與催化基團(tuán)之間的空間距離，有望提高雙催化的協(xié)同作用。

圖16 具有二苯甲酮光敏基團(tuán)的人工光酶催化二氧化碳的還原（a）；鹵代芳烴的脫鹵羥化反應(yīng)（b）Fig. 16 Artificial photoenzymes with benzophenone photosensitive groups catalyze the reduction of carbon dioxide (a) and the dehalogenation and hydroxylation of aryl halides (b)

4.3 通過基因密碼子擴(kuò)增技術(shù)插入非天然光敏氨基酸催化立體化學(xué)控制的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)

2022年，吳鈺周、鐘芳銳和陳希等［105］報(bào)道了一類新穎的人工光酶，能夠在紫外光引發(fā)下，催化立體選擇性的三線態(tài)能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)［圖17（a）］。作者通過遺傳密碼子擴(kuò)增技術(shù)，在多藥耐藥性調(diào)節(jié)蛋白LmrR［106］骨架中插入二苯甲酮類光敏基團(tuán)，構(gòu)建的人工光酶能夠通過三線態(tài)能量轉(zhuǎn)移機(jī)制，催化吲哚衍生物的對映選擇性分子內(nèi)［2+2］環(huán)加成去芳構(gòu)化反應(yīng)。通過4 次計(jì)算機(jī)輔助的理性誘變，作者將該酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化，最終得到了一種高效的人工光酶突變體，有著顯著的底物通用性和優(yōu)異的對映體選擇性。

圖17 人工光酶實(shí)現(xiàn)對映選擇性的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)Fig. 17 Enantioselective energy transfer reactions realized by artificial photoenzymes

同一時(shí)間，Green 等［107］報(bào)道了相似策略構(gòu)建的人工光酶，通過三線態(tài)能量轉(zhuǎn)移促進(jìn)對映選擇性［2+2］環(huán)加成反應(yīng)［圖17（b）］。作者利用遺傳密碼子擴(kuò)展技術(shù)將含有二苯甲酮光敏基團(tuán)的非天然氨基酸引入計(jì)算機(jī)從頭設(shè)計(jì)的一種DA 酶［108］疏水口袋中的173號位，得到能夠催化三線態(tài)能量轉(zhuǎn)移的人工光酶母本。定向進(jìn)化改造后得到的人工光酶突變體，可實(shí)現(xiàn)最高達(dá)99%的轉(zhuǎn)化率和99%的對映異構(gòu)體過量值。

這兩項(xiàng)研究利用遺傳密碼子擴(kuò)增技術(shù)，將三線態(tài)能量轉(zhuǎn)移機(jī)制與蛋白質(zhì)相結(jié)合，并通過高通量篩選的酶工程，開發(fā)出具有更高反應(yīng)活性和選擇性的人工光酶變體，為開發(fā)新一代具有類似于天然酶的效率和特異性的可進(jìn)化光酶催化劑建立了框架。

5 展 望

盡管光酶催化剛剛興起，但是該策略已經(jīng)在合成科學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。表1總結(jié)了目前報(bào)道的光酶催化反應(yīng)的主要案例。光催化能夠產(chǎn)生高活性的中間體，而生物催化在控制立體選擇性方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，光酶催化很好地綜合了兩者的優(yōu)勢，能夠完成眾多非天然化學(xué)轉(zhuǎn)化。光與酶的協(xié)同體現(xiàn)在多個(gè)方面：光催化可以實(shí)現(xiàn)生物催化中輔因子的循環(huán)，達(dá)到節(jié)約成本或者更高效的電子傳遞等目的；具有光活性的輔因子的利用以及輔因子?底物EDA 復(fù)合物形成的策略，進(jìn)一步拓寬了生物催化的化學(xué)轉(zhuǎn)化邊界，也實(shí)現(xiàn)了部分傳統(tǒng)化學(xué)催化劑無法完成的不對稱轉(zhuǎn)化；酶可以通過定向進(jìn)化來進(jìn)行工程化改造，內(nèi)部的氫鍵網(wǎng)絡(luò)及其他相互作用力可以穩(wěn)定活潑的開殼中間體、控制反應(yīng)的立體化學(xué)過程；為了探索更廣闊的應(yīng)用前景，人工光酶逐漸出現(xiàn)，并進(jìn)一步突破了現(xiàn)有酶的應(yīng)用范圍，使得人們可以根據(jù)反應(yīng)需求設(shè)計(jì)新的生物催化劑。

過去的幾十年，我們見證了現(xiàn)代可見光催化合成的蓬勃發(fā)展和應(yīng)用，以及蛋白質(zhì)工程和合成生物學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)。因此，光與酶的結(jié)合方興未艾，具有巨大的機(jī)遇，同時(shí)也面臨著眾多挑戰(zhàn)：

（1）當(dāng)前可被可見光激發(fā)的酶的種類比較少，多局限于黃素和煙酰胺依賴的氧化還原酶，這也導(dǎo)致了光酶催化的非天然轉(zhuǎn)化面臨機(jī)理途徑較單一（多是基于EDA復(fù)合物引發(fā)的凈還原體系）、依賴于活潑的自由基前體等問題。因此，急需創(chuàng)制可被可見光激發(fā)的新生物催化劑，比如具有多種價(jià)態(tài)變化的金屬酶與人工光酶等，進(jìn)而開發(fā)更多的光酶協(xié)同機(jī)理路徑，實(shí)現(xiàn)更多更廣的非天然底物到高附加值光學(xué)純手性產(chǎn)品的合成。

（2）人工光酶用于催化非天然的不對稱轉(zhuǎn)化剛剛開始，亟待創(chuàng)制更多種類豐富、催化性能強(qiáng)大、構(gòu)建方法簡潔高效、光量子效率更高的新型人工光酶。除了自上而下的酶工程，從頭設(shè)計(jì)全新的人工光酶，通過在蛋白質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生全新的催化中心和/或光敏中心，可以為人工光酶的創(chuàng)制提供更快更有效的解決方案，從而為新的不對稱光酶催化轉(zhuǎn)化提供更多機(jī)會。

（3）不同于經(jīng)典酶，光酶通常面臨氧氣不耐受的問題，即氧氣的存在可能會猝滅光誘導(dǎo)的反應(yīng)中間體或產(chǎn)生使蛋白質(zhì)失活的活性氧物種。此外光酶催化的非天然新反應(yīng)，往往還存在著立體選擇性不高、活性差等問題，而傳統(tǒng)的酶進(jìn)化方法只對蛋白局部優(yōu)化，面臨活性和穩(wěn)定性不可兼得等問題。因此，綜合利用機(jī)器學(xué)習(xí)和高通量自動(dòng)化生物制造平臺，建立光酶的多目標(biāo)協(xié)同的、高效標(biāo)準(zhǔn)化的定向進(jìn)化平臺，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其功能全面提升，是光酶催化合成領(lǐng)域待研究的方向之一。

（4）目前的光生物催化體系多數(shù)僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模研究，更多有價(jià)值的新反應(yīng)無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。這是由于光的穿透性差以及光酶催化劑用量較大等問題，阻礙了光酶催化合成的放大。未來可用的解決方案包括引入內(nèi)部照明或者連續(xù)流光反應(yīng)裝置進(jìn)行生產(chǎn)、進(jìn)一步改造蛋白提高光酶的TOF、固定化光酶、發(fā)展高效光微生物細(xì)胞工廠等。

通過交叉整合生物合成與化學(xué)合成，我們相信人們會發(fā)現(xiàn)更多有趣、有用的新光酶催化轉(zhuǎn)化，并且開發(fā)出用于規(guī)模化生物制造的光酶催化工藝與光微生物細(xì)胞工廠，逐步推進(jìn)“綠色光生物制造”時(shí)代的到來。