俞林雙,金萬慧,周 穎,楊悅悅,雷彩虹,3,朱海霖,3,陳建勇

(1.浙江理工大學(xué)紡織科學(xué)與工程學(xué)院(國際絲綢學(xué)院),杭州 310018; 2.湖北省纖維檢驗局,武漢 430000;3.浙江省現(xiàn)代紡織技術(shù)創(chuàng)新中心,浙江紹興 312000)

突發(fā)性創(chuàng)傷出血在日常生活中不可避免,大量的失血和傷口感染可能會危及生命,因此開發(fā)具有抗菌止血的創(chuàng)傷愈合材料具有重要意義。絲素蛋白是一種從蠶絲中提取的天然高分子蛋白,具有良好的生物相容性和可降解性,同時具有一定的止血能力和抗菌性能[1-2],在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域得到了很多研究與應(yīng)用[3-4]。但單一的絲素蛋白材料止血、抗菌性能不足,限制了其在創(chuàng)面敷料中的應(yīng)用[5]。因此,構(gòu)建兼具抗菌、止血功能的絲素基敷料成為研究熱點?？咕鷦┮话阌袩o機抗菌劑、有機抗菌劑和天然抗菌劑三大種類。無機抗菌劑有Ag、Cu、ZnO等金屬及金屬化合物[6];有機抗菌劑有季銨鹽、鹵胺類等[7]。這兩類抗菌劑雖應(yīng)用廣泛、抑菌效率高[8],但仍難以避免化學(xué)合成中造成的環(huán)境問題以及存在危害人體健康的弊端[9],這使得天然抗菌劑在醫(yī)藥材料領(lǐng)域成為了更好的選擇[10]。茜草素是采用乙醇為溶劑從茜草的根中提取得到,是天然藥用植物茜草的主要有效成分,屬于蒽醌類化合物,具有止血、抑菌抗炎等作用[11-12],并且對人體副作用小,除了在現(xiàn)代醫(yī)療領(lǐng)域中有極其廣泛的應(yīng)用外,還被廣泛用作天然食用色素和天然染發(fā)劑[13]。

靜電紡絲是一種制備功能性纖維膜的高效方法[14],制備的纖維膜具有較好的生物相容性能和可調(diào)節(jié)的孔隙率,不僅有益于細胞呼吸增殖加速創(chuàng)面愈合,其較大的比表面積又能增加吸水量,能夠有效地提高止血效率[15]。本文以茜草素為止血抗菌劑,以六氟異丙醇為溶劑制備一定質(zhì)量比的絲素蛋白/茜草素紡絲溶液,再通過靜電紡絲法制備復(fù)合纖維膜。分析不同質(zhì)量比下所得絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的微觀形貌、吸水率、止血性能和抗菌性能,探究茜草素含量對絲素蛋白纖維膜止血抗菌性能的影響。希望能制備出一種具有良好抗菌效果絲素基止血材料,為今后開展絲素基創(chuàng)面敷料的研究奠定基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 實驗材料和儀器

實驗材料:蠶繭,浙江米賽絲綢有限公司;六氟異丙醇(99.5%),上海晶純生化科技股份有限公司;茜草素,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;無水碳酸鈣,無水氯化鈣,無水乙醇,氯化鈉,杭州高晶化工有限公司;磷酸鹽緩沖液(pH=7.2～7.4),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;新西蘭兔血,杭州賽洛進生物科技有限公司;營養(yǎng)瓊脂,酵母浸粉,蛋白胨,杭州百思生物技術(shù)有限公司;金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC6538),大腸桿菌標準菌株(ATCC 11229),上海魯微科技有限公司;滅菌級醫(yī)用紗布敷料,南昌市奧康醫(yī)療器械有限公司;去離子水,實驗室自制。

實驗儀器:SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司);真空冷凍干燥機FD-80(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);凱特TG18G臺式高速離心機(上海晚成醫(yī)療器械有限公司);HJ-4A磁力攪拌器(上海路晨科學(xué)儀器有限公司);JDF05型靜電紡絲機(長沙納儀儀器科技有限公司);GI54DWS高壓滅菌鍋(廈門致微儀器有限公司);DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱,恒溫振蕩器(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);SW-CJ-1D(實用型)單人單面垂直凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.2 絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的制備

絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的制備步驟包括絲素蛋白的制備、紡絲液的制備和絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的制備,實驗流程圖如圖1所示。

圖1 實驗流程Fig.1 Experimental procedure

1.2.1 絲素蛋白的制備

蠶繭在98 ℃的2%的碳酸鈉溶液中脫膠,脫膠時間3 h。脫膠后用去離子水沖洗蠶絲至無粘膩感。將蠶絲60 ℃烘干,再按質(zhì)量比1∶50的浴比在98 ℃的三元溶液CaCl2/CH3CH2OH/H2O(物質(zhì)的量比 1∶2∶8)中溶解3 h,室溫冷卻后置于離心機中以1200 r/min的速度離心,15 min后取上清液抽濾后倒入透析袋中在去離子水中透析3 d,每隔12 h更換一次去離子水。-80 ℃冷凍干燥3 d,獲得純絲素蛋白。

1.2.2 紡絲液的制備

以六氟異丙醇為溶劑,配制成質(zhì)量分數(shù)為12%的絲素蛋白溶液,再根據(jù)絲素蛋白/茜草素的質(zhì)量比(60∶1、30∶1、15∶1、10∶1),加入相應(yīng)質(zhì)量的茜草素配制出不同質(zhì)量比的絲素蛋白/茜草素混合紡絲液。

1.2.3 絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的制備

將制得的紡絲液裝入10 mL的一次性注射器內(nèi),安裝上內(nèi)徑為18 G規(guī)格的不銹鋼點膠針頭的噴射口,固定在注射泵上,采用硅油紙收集復(fù)合纖維膜,以便更好分離復(fù)合纖維膜與接收輥。實驗中,注射泵推進的速度為0.5 mL/h,針頭到滾軸的距離為10 cm,電壓箱設(shè)置參數(shù)15 kV,時間2 h。并對制得的纖維膜采用75%乙醇浸泡1 h,常溫自然干燥后得到絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜。將純絲素蛋白纖維膜樣品記為SF,不同質(zhì)量比絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜樣品(60∶1、30∶1、15∶1、10∶1)分別記為SF-A1、SF-A2、SF-A3、SF-A4。

1.3 絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的性能測試

1.3.1 表面形貌測試

用 JSM-5610LV 型場發(fā)射掃描電鏡(JEOL,日本)對鍍金處理后的復(fù)合纖維膜樣品進行表面形貌的觀測。通過 Image-Pro Plus 6.0 軟件對電鏡照片進行分析,隨機選取100根纖維進行測量并計算平均直徑及方差。

1.3.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)測試

用 Nicolet is50 型傅里葉變換紅外光譜儀(ATR-FTIR)測定不同復(fù)合纖維膜樣品的紅外光譜,500～4000 cm-1。

1.3.3 吸水率測試

用稱重法測量復(fù)合纖維膜的吸水率[16]。將樣品裁切成邊長3 cm的方形并記重。將樣品置于 10 mL 的PBS(pH=7.2～7.4)中,并室溫放置24 h后,移除樣品表面多余的水并記重。以止血紗布為對照,測量3次取平均值。由式(1)計算吸水率。

(1)

式中:A為吸水率,%;Wd為復(fù)合纖維膜干燥時的重量,g;WW為復(fù)合纖維膜吸水后的重量,g。

1.3.4 體外凝血指數(shù)測試

(2)

式中:BCI為體外凝血指數(shù),%;A1為各組樣品測得的紫外吸光度;A0為陰性對照組的紫外吸光度。

1.3.5 抗菌性能測試

用平皿擴散法[18]和平板計數(shù)法[19]測定復(fù)合纖維膜的抗菌性能,試驗方法參照 GB/T 20944.1—2007《紡織品 抗菌性能的評價 第1部分:瓊脂平皿擴散法》和 GB/T 20944.3—2008 《紡織品 抗菌性能的評價 第三部分:振蕩法》,測試菌種選用金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。樣品的抗菌性能以抑菌圈直徑和抑菌率表征。

抑菌圈:將液態(tài)無菌瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中,待其冷卻固化后,取適量菌液在平板上均勻地涂板,并將復(fù)合纖維膜制成直徑6 mm的圓形試樣,將其分別置于培養(yǎng)皿的中間位置,37 ℃恒溫密封培養(yǎng)。24 h后,用游標卡尺測定抑菌圈直徑的大小,每組進行3次測量。

抑菌率:將50 mg的樣品置于已培養(yǎng)的菌懸液中,振蕩菌懸液使細菌均勻分布。24 h以后進行稀釋,再移取10 μL菌液涂平板并密封。將平板倒置于37 ℃恒溫箱中,24 h后計數(shù)平板上的菌落數(shù)。每組進行3次測量。由式(3)計算抑菌率。

(3)

式中:R為抑菌率,%;Nm為各組樣品平板上的菌落數(shù),個;N0為未放樣的空白對照平板上的菌落數(shù),個。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面形貌表征

不同質(zhì)量比的絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的形貌特征如圖2所示。從圖2中可以看出,與未浸泡乙醇的純絲素纖維膜SF(圖2(a))相比,浸泡后的純絲素蛋白纖維膜SF(圖2(b))呈致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),從圖2(c)—(f)可以看出,絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜中的纖維均呈光滑致密、無串珠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。與純絲素蛋白纖維膜SF(0.61±0.22) μm相比,SF-A1、SF-A2、SF-A3、SF-A4的平均直徑分別為(0.63±0.20)、(0.60±0.21)、(0.61±0.19)、(0.63±0.18) μm,說明加入茜草素后復(fù)合纖維膜的纖維直徑?jīng)]有明顯的變化。但當絲素蛋白與茜草素質(zhì)量比為15∶1時,纖維網(wǎng)中出現(xiàn)明顯的纖維斷裂,復(fù)合纖維膜的機械性能降低。

圖2 絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM photos of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.2 化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

不同質(zhì)量比的絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的紅外光譜測試結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出,復(fù)合纖維膜在1625 cm-1處左右對應(yīng)絲素蛋白酰胺I的吸收峰,呈現(xiàn)出典型的β折疊結(jié)構(gòu),這種構(gòu)造使得復(fù)合纖維膜在水中不溶解[20]。與純絲素蛋白纖維膜SF相比,復(fù)合纖維膜在1380、1100、930 cm-1處出現(xiàn)新的特征吸收峰,對應(yīng)的可能是茜草素苯環(huán)上的碳氫鍵的面外彎曲振動、C—H面內(nèi)彎曲振動和C—H面外彎曲振動。此外,隨著茜草素含量增加,復(fù)合纖維膜在3280 cm-1處的O—H和N—H基團重疊的伸縮振動峰的強度減弱。以上峰值變化說明絲素膜中存在茜草素(1,2-二羥基-9,10-蒽二酮)[21],且沒有新物質(zhì)產(chǎn)生。

圖3 絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的紅外譜圖Fig.3 FTIR spectra of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.3 吸水率分析

圖4 絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的吸水率Fig.4 Water absorption of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.4 體外凝血指數(shù)分析

不同質(zhì)量比的絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的體外凝血指數(shù)(BCI)測試結(jié)果如圖5所示。從圖5(a)中可以看出,復(fù)合纖維膜可以吸收血液使其凝固成血凝塊并沉降在離心管的底部,隨著茜草素含量的增加,上清液的顏色逐漸變淡,表明復(fù)合纖維膜吸收血液使其凝固的能力增強。從圖5(b)可以看出,與止血紗布對照樣的BCI值(80.01±1.38)%相比,SF(70.95±0.49)%、SF-A1(54.27±0.74)%、SF-A2(42.27±0.38)%、SF-A3(31.15±0.60)%和SF-A4(22.74±0.74)%的BCI值逐步減少,數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明制得的復(fù)合纖維膜的體外促凝血能力均優(yōu)于止血紗布。其中SF-A4能夠在很短的時間內(nèi)使血液凝固,表現(xiàn)了極好的凝血能力。這歸因于茜草素可以縮短凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶的時間,使血液凝固時間縮短,有效提高止血效果[24]。同時復(fù)合纖維膜具有較高的吸水率(圖4),與血液接觸時能夠快速吸收水分子加速血液凝固,因此SF-A4復(fù)合纖維膜有較低的體外凝血指數(shù),止血作用明顯增強。

圖5 絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的體外凝血性能Fig.5 In vitro coagulation activity of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane

2.5 抗菌性能分析

不同質(zhì)量比的絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的抑菌圈測試結(jié)果如圖6所示。平皿擴散法是衡量抑菌效果的定性方法[18]。從圖6中可以看出,純絲素蛋白纖維膜SF對金黃色葡萄球菌(6.81±0.31)mm和大腸桿菌(6.43±0.22) mm都僅具有輕微的抗菌性能。SF-A1、SF-A2、SF-A3和SF-A4對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別是(7.90±0.01)、(9.27±0.04)、(10.57±0.01)、(12.23±0.01) mm;SF-A1、SF-A2、SF-A3和SF-A4對大腸桿菌的抑菌圈直徑分別是(7.53±0.01)、(8.73±0.04)、(9.30±0.04)、(11.47±0.09) mm,數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可知,在相同的實驗條件下,復(fù)合纖維膜對金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于大腸桿菌,而且隨著茜草素含量的增加,復(fù)合纖維膜的抗菌性越好。茜草素具有一定的抗菌效果,其抑菌機制主要是通過抑制細菌的細胞壁合成、抑制細菌蛋白質(zhì)合成等方式來阻止細菌的生長和繁衍[24]。

圖6 絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈大小Fig.6 Inhibitory zone size of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane against S.aureus and E.coli

不同質(zhì)量比的絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的抑菌率測試結(jié)果如圖7所示。平板計數(shù)法是一種定量判斷材料抗菌率的方法[19]。從圖7(a)—(b)可以看出,與空白對照相比,純絲素蛋白纖維膜SF的瓊脂平板上菌落數(shù)量減少但仍能觀察到大量菌落,說明純絲素蛋白纖維膜SF對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的抑制作用但效果并不明顯。隨著茜草素含量的增加,SF-A1、SF-A2、SF-A3、SF-A4瓊脂平板上生長的菌落數(shù)量逐漸減少,表明復(fù)合纖維膜抗菌性能與茜草素的含量呈正相關(guān)。其中在復(fù)合纖維膜SF-A4的瓊脂平板上僅觀察到少量菌落,抑制了大部分菌落的形成,對金黃色葡萄球菌(98.03±0.28)%和大腸桿菌(92.02±1.03)%均有很強的抑制作用。但當絲素蛋白/茜草素質(zhì)量比超過15∶1時復(fù)合纖維膜的機械性能變差,纖維出現(xiàn)斷裂(圖2),因此綜合茜草素用量、凝血效果和抗菌性,本文實驗沒有進一步制備更高質(zhì)量比的絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜。

圖7 絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性能Fig.7 Bacteriostatic performance of the silk fibroin/alizarin composite fiber membrane against S.aureus and E.coli

3 結(jié) 論

本文以茜草素為止血抗菌劑,通過靜電紡絲法制備了絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜,并探討分析了不同質(zhì)量比條件下得到的絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的微觀形貌、吸水率、止血性能、抑菌性能。得到的主要結(jié)論如下:

a)絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜止血性能實驗表明,采用靜電紡絲制得的復(fù)合纖維膜具有較高的吸水率,有利于快速吸收水分子加速血液凝固,不同質(zhì)量比絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜的體外促凝血能力均優(yōu)于止血紗布。其體外凝血指數(shù)較小,體外凝血時間較短,止血性能優(yōu)于止血紗布。

b)絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜抗菌性能與茜草素的含量成正相關(guān),當絲素蛋白與茜草素的質(zhì)量比為10∶1時,絲素蛋白/茜草素復(fù)合纖維膜具有較好的抗菌性能,對大腸桿菌的抑菌率為(92.02±1.03)%,對金黃色葡萄球菌的抑菌率為(98.03±0.28)%。