姜莉莉,孫瑞紅,張甘雨,張文升,宮慶濤,武海斌

(山東省果樹研究所,山東泰安 271000)

果園土壤管理是果業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。行間生草是近年來國內(nèi)興起的果園管理新模式,改變了傳統(tǒng)的果園清耕管理方式[1]。大量研究表明,果園生草有利于改善果園生態(tài)環(huán)境,改良土壤結(jié)構(gòu)[2],促進(jìn)保水保土[3],增加土壤有機(jī)質(zhì)及各種養(yǎng)分元素含量[4],提高果園綜合效益[5]。

不同生草制度對果園土壤的改良效果存在明顯差異[6]。目前果園生草有自然生草和人工種草2種模式。王艷廷等[7]報(bào)道,自然生草能夠降低黃河三角洲果園土壤的含鹽量,提高有機(jī)質(zhì)含量。秦景逸等[8]報(bào)道,與清耕相比,蘋果園間作紅豆草、紫花苜蓿等綠肥可提高土壤速效氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)含量。楊野等[9]報(bào)道,蘋果園種植黑麥草可使土壤速效磷和速效鉀含量分別較對照增加82.1%和20.4%。

長柔毛野豌豆(ViciavillosaR.)屬于1a生豆科植物,其有冬小麥特性,春季迅速爬蔓生長、覆滿地面,具有涵養(yǎng)水源的作用,在果園生草中應(yīng)用較廣[10]。白三葉(TrifoliumrepensLinn)又名白車軸草,其莖葉細(xì)軟、匍匐生長特性強(qiáng),被廣泛用于水土保持、園林綠化及果園生草[11]。黑麥草(LoliumperenneL)屬禾本科1a生或多年生優(yōu)良牧草,具有培肥土壤的作用[12]。

本研究以自然生草(Natural Grass, NG)為對照,研究蘋果園行間連續(xù)3a種植黑麥草(LoliumperenneL., LPL)、白三葉(TrifoliumrepensLinn., TRL)和長柔毛野豌豆(ViciavillosaR., VVR)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及堿解氮(Alkali-hydrolyzable nitrogen,AN)、有效磷(Available phosphorus,AP)、速效鉀(Available kalium,AK)、有機(jī)質(zhì)(Organic matter,OM)和pH的影響,并進(jìn)行相關(guān)性分析,以期為果園生草制度的科學(xué)制定和果園種植業(yè)的綠色健康發(fā)展提供理論 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于山東省聊城市陽谷縣蘋安耶果農(nóng)業(yè)科技有限公司矮砧立架密植蘋果園(36°10′54″N,115°54′3″E)。試驗(yàn)地南北向,地勢平坦,地貌、土質(zhì)等自然條件基本一致。土壤為砂壤土,pH 7.8。供試蘋果為2 a生‘煙富三號’,砧木為M9T337,株行距為1 m×3.5 m。自然生草群落為稗草、馬唐、狗尾草、蒲公英、馬齒莧及苦荬菜等。

園區(qū)肥水措施基本一致,2017-2020年,每年采收后秋施有機(jī)肥500 kg/667m2(含有機(jī)質(zhì)40%,芽孢桿菌0.2 億/g)。通過水肥一體化追肥處理見表1。

表1 試驗(yàn)果園追肥記錄

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì),以自然生草為對照,設(shè)置種植黑麥草(LPL)、白三葉(TRL)和長柔毛野豌豆(VVR)3個(gè)人工生草處理。每個(gè)處理重復(fù)3次,每個(gè)小區(qū)面積350 m2。分別于2017年、2018年和2019年10月進(jìn)行行間機(jī)械播種,播種密度22.5 kg/hm2,播種深度1～2 cm,各處理的生態(tài)條件及蘋果的田間管理措施一致。

1.3 樣品采集

分別于2018、2019和2020年蘋果采收后施基肥之前進(jìn)行土壤采樣。在各小區(qū)兩行樹間均勻布設(shè)15～20個(gè)采樣點(diǎn),清除表層凋落物,用土鉆采集5～15 cm土層土樣。將每個(gè)處理的土樣充分混勻,去除根系等雜質(zhì),過1 mm篩后分成2份。一份經(jīng)液氮凍干處理后,以干冰保存并送樣,用于測定土壤微生物群落結(jié)構(gòu);另一份風(fēng)干后,用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.4 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的高通量測序分析由北京諾禾致源科技股份有限公司代理完成。

提取樣本基因組 DNA 并檢測純度和濃度后,以無菌水稀釋至1 ng/μL。以此為模板,分別采用帶Barcode的引物515F/806R和ITS5-1737F/ITS2-2043R進(jìn)行16S和ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增,用于鑒定細(xì)菌和真菌多樣性。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測和酶標(biāo)定量,根據(jù)濃度進(jìn)行等量混樣,以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,回收目的條帶。構(gòu)建文庫,經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量檢測合格后,使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測序。

拆分出樣本數(shù)據(jù),截去Barcode和引物序列,進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控,去除嵌合體序列,得到最終有效數(shù)據(jù)。利用Uparse算法進(jìn)行聚類分析,以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。依據(jù)其算法原則,篩選出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對OTUs序列進(jìn)行物種注釋,用Qiime軟件(v1.9.1)中的blast方法與Unite(v8.2)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析,并分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理,并基于此進(jìn)行后續(xù)的Alpha和Beta多樣性分析。

使用Qiime軟件計(jì)算Observed-otus,Chao1,Shannon,Simpson,ace,Goods-coverage,PD_whole_tree 指數(shù),使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線。進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,以pheatmap函數(shù)進(jìn)行可視化。

1.5 土壤理化性質(zhì)測定

土壤堿解氮(Alkali-hydrolyzable nitrogen,AN)含量測定方法采用堿解擴(kuò)散法,有效磷 (Available phosphorus,AP)含量測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法,速效鉀(Available kalium,AK)含量測定采用醋酸銨浸提-火焰光度法。土壤pH測定采用電極電位法,有機(jī)質(zhì)(Organic matter,OM)含量測定采用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法[13]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,并進(jìn)行Duncan’s差異顯著性分析和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)3 a生草處理對果園土壤理化性狀的影響

由表2可以看出,隨著生草時(shí)間的延長,除有效磷外,各生草處理的土壤養(yǎng)分含量總體呈上升趨勢,pH呈下降趨勢。連續(xù)生草3 a,白三葉和長柔毛野豌豆處理的蘋果園土壤堿解氮含量均顯著提高,分別由2018年的18.38 mg/kg和42.26 mg/kg提升至2020年的70.16 mg/kg和61.94 mg/kg;黑麥草和長柔毛野豌豆處理的土壤速效鉀含量均顯著提高;黑麥草、白三葉和長柔毛野豌豆處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量均顯著提高;自然生草處理的土壤養(yǎng)分含量隨著生草年限的延長呈現(xiàn)波動趨勢。

表2 連續(xù)3 a生草處理的蘋果園土壤理化性狀

2.2 連續(xù)3 a生草對果園土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

2.2.1 連續(xù)3 a生草處理對果園土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響 由表3可以看出,連續(xù)3 a生草,各生草處理的土壤細(xì)菌Shannon和Simpson指數(shù)差異不大, Chao1和ACE指數(shù)呈先上升后下降的趨勢,且3個(gè)人工生草處理的Chao1和ACE指數(shù)整體高于自然生草處理。

表3 連續(xù)3 a生草處理土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)的變化

2.2.2 連續(xù)3 a生草處理對果園土壤真菌多樣性指數(shù)的影響 由表4可以看出,連續(xù)生草3 a,自然生草(NG)處理的真菌Shannon指數(shù)變化不大,3個(gè)人工生草處理的Shannon指數(shù)隨著年份的推移逐漸下降。其中長柔毛野豌豆(VVR)處理的下降幅度最小,由7.77降至6.91,白三葉處理降低幅度最大,由7.24降至4.65。各處理Simpson指數(shù)總體差異不大。長柔毛野豌豆處理的Chao1和ACE指數(shù)整體高于其他處理。

表4 連續(xù)3 a生草處理土壤真菌多樣性指數(shù)的變化

2.3 連續(xù)3 a生草處理對果園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 連續(xù)3 a生草處理對果園土壤細(xì)菌相對豐度的影響 由圖1可以看出,連續(xù)3 a生草處理,各處理的芽孢桿菌Bacillus相對豐度呈下降趨勢,鞘氨醇單胞菌Sphingomonas相對豐度整體呈上升趨勢,溶桿菌Lysobacter呈先上升后下降趨勢。

A.Acidibacter酸桿菌;B.Bacillus芽孢桿菌;C.Subgroup_10未識別;D.Sphingomonas鞘氨醇單胞菌;E.Bryobacter未識別;F.unidentified_Chloroplast未識別葉綠體;G.Lysobacter溶桿菌;H.UTCFX1未識別;I.RB41未識別;J.MND1未識別

2.3.2 連續(xù)3 a生草處理對果園土壤真菌相對豐度的影響 由圖2可以看出,連續(xù)生草處理 3 a,白三葉(TRL)和長柔毛野豌豆(VVR)處理可顯著提高果園土壤木霉屬Trichoderma真菌的相對豐度。黑麥草(LPL)、白三葉和自然生草(NG)可在一定程度上提高果園土壤白粉菌屬Blumeria的相對豐度。

A.Battarrea未識別;B.Fusarium鐮刀菌屬;C.Sarocladium帚枝霉屬;D.Mortierella被孢霉屬;E.Mycena小菇屬;F.Ramicandelaber未識別;G.Conocybe錐蓋傘屬;H.Unidentified未識別;I.Blumeria白粉菌屬;J.Trichoderma木霉屬

2.4 果園生草處理土壤微生物相對豐度與理化性質(zhì)的相關(guān)性

2.4.1 果園生草處理土壤細(xì)菌相對豐度與理化性質(zhì)的相關(guān)性 由圖3可以看出,在生草條件下,蘋果園土壤氣單胞菌屬Arenimonas相對豐度與有效磷(AP)呈顯著正相關(guān);青枯菌屬Ralstonia相對豐度與有效磷和pH呈顯著正相關(guān);鞘氨醇單胞菌Sphingomonas相對豐度與pH呈顯著負(fù)相關(guān);芽孢桿菌Bacillus相對豐度與有效磷呈顯著正相關(guān),與pH呈極顯著正相關(guān);溶桿菌Lysobacter相對豐度與有效磷呈顯著正相關(guān)。

A.Nocardioides類諾卡氏屬;B.Opitutus豐佑菌屬;C.Flavobacterium黃桿菌屬;D.Unidentified_Vicinamibaceriaies未識別;E.Pir4_lineage未識別;F.Ohtaekwangia未識別;G.Skermanella未識別;H.Solirubrobacter未識別;I.AKYG587未識別;J.SWB02未識別;K.Arenimonas氣單胞菌屬;L.Polycyclovorans未識別;M.Microvirga微小桿菌;N.Hassallia未識別;O.Arthrobacter節(jié)細(xì)菌屬;P.Adhaeribacter未識別;Q.Ralstonia青枯菌屬;R.Terrimonas未識別;S.Ramlibacter分枝菌;T.Ellin6067未識別;U.Sphingomonas鞘氨醇單胞菌;V.Pirellula小梨形菌屬;W.Dongia未識別;X.Steroidobacter未識別;Y.Bacillus芽孢桿菌;Z.Gaiella未識別;AA.Haliangium未識別;AB.Acidibater酸桿菌;AC.Subgroup_10未識別;AD.Bryobacter未識別;AE.unidentified_Chloroplast未識別葉綠體;AF.Lysobacter溶桿菌;AG.UTCFX1未識別;AH.RB41未識別;AI.MND1未識別

2.4.2 果園生草處理土壤真菌相對豐度與理化性質(zhì)的相關(guān)性 由圖4可以看出,鏈格孢屬Alternaria相對豐度與pH呈顯著正相關(guān),巨孢囊霉屬Gigaspora相對豐度與速效鉀(AK)呈顯著正相關(guān),與堿解氮(AN)呈極顯著正相關(guān),與pH呈顯著負(fù)相關(guān),與有效磷呈極顯著負(fù)相關(guān);刺盤孢屬Colletotrichum相對豐度與有機(jī)質(zhì)(OM)呈顯著負(fù)相關(guān),與速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān);葡萄穗霉屬Stachybotrys相對豐度與有機(jī)質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān);假裸囊菌屬Pseudogymnoascus相對豐度與pH呈顯著正相關(guān);帚枝霉屬Sarocladium相對豐度與速效鉀呈顯著負(fù)相關(guān);錐蓋傘屬Conocybe相對豐度與有效磷呈顯著正相關(guān),與堿解氮呈顯著負(fù)相關(guān);被孢霉屬M(fèi)ortierella相對豐度與pH呈顯著正相關(guān);白粉菌屬Blumeria相對豐度與堿解氮呈極顯著正相關(guān),與有效磷呈極顯著負(fù)相關(guān)。

3 討 論

3.1 果園生草對土壤肥力的影響

中國果園面積位居世界首位,早在1998年便將果園生草作為綠色果品生產(chǎn)的主要技術(shù)措施在全國推廣[14]。吳家森等[15]和錢進(jìn)芳等[16]報(bào)道,山核桃林生草能夠有效提高土壤養(yǎng)分含量和微生物功能多樣性,促進(jìn)土壤修復(fù)。岳泰新等[17]報(bào)道,行間生草可以改善葡萄園土壤的微生物學(xué)指標(biāo),其中以白三葉和紫花苜蓿效果較為明顯。王倩等[18]報(bào)道,旱地蘋果園生草覆蓋可以顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)含量和微生物數(shù)量。孫計(jì)平等[19]報(bào)道,長期生草可以有效增加梨園表層土壤的微生物數(shù)量和腐殖酸含量。

生草模式和草種選擇是果園生草成功的前提和基礎(chǔ)[20]。錢雅麗等[21]報(bào)道,隴東旱作果園種植鴨茅Dactylisglomerata可以促進(jìn)土壤氮素積累,種植白三葉和紫花苜蓿Medicagosativa的芽孢桿菌相對豐度較高。Wang等[22]報(bào)道,人工種植白三葉處理對果樹根際微生物增殖和堿解氮積累的促進(jìn)效果高于自然生草。Pott等[23]報(bào)道,覆蓋植物長柔毛野豌豆可以降低作物對土壤氮素養(yǎng)分的消耗,且在一定程度上提高作物產(chǎn)量。

同一生草模式的不同生草年限對土壤養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響也并不完全相同。付學(xué)琴等[24]報(bào)道,南豐蜜橘園自然生草2 a堿解氮、速效磷、速效鉀含量明顯低于清耕對照,而生草8 a則較對照增加了25.98%、3.1%和90.57%。王艷廷等[7]報(bào)道,梨園自然生草處理4 a的土壤碳源利用高于生草6 a和9 a處理。

本研究以自然生草為對照,系統(tǒng)評價(jià)連續(xù)3 a種植黑麥草、白三葉和長柔毛野豌豆處理對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的影響。發(fā)現(xiàn)隨著生草年限的延長,各生草處理的土壤堿解氮、速效鉀及有機(jī)質(zhì)含量總體呈上升趨勢,pH呈下降趨勢。連續(xù)生草3 a,白三葉和長柔毛野豌豆處理的蘋果園土壤堿解氮含量均顯著提高,其中白三葉處理的堿解氮含量由2018年的18.38 mg/kg提升至2020年70.16 mg/kg,這可能與豆科植物的固氮作用有關(guān);黑麥草和長柔毛野豌豆處理的土壤速效鉀含量均顯著提高;人工生草處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著提高;自然生草處理的土壤養(yǎng)分含量隨著生草年限的延長波動較大,這可能與覆蓋植物種類及覆蓋度變化有關(guān)。

3.2 果園生草對土壤微生物群落的影響

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,其參與調(diào)節(jié)大部分土壤生物化學(xué)過程,在養(yǎng)分循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[25]。微生物多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)是表征群落多樣性的常用指數(shù),可以揭示土壤微生物種類和功能的差異[26]。Shannon和Simpson指數(shù)主要反映樣品中物種分布的多樣性和均勻度,群落多樣性越高,物種分布越均勻,Shannon和Simpson指數(shù)越大。Chao1指數(shù)主要用于估計(jì)樣品中包含的物種總數(shù)[27]。ACE指數(shù)反映了樣品中物種的豐度和物種在樣品中出現(xiàn)的概率[28]。

姚城城等[29]報(bào)道,自然生草能夠提高蘋果園土壤細(xì)菌多樣性,改良群落結(jié)構(gòu)和組成。徐惠昌等[30]報(bào)道,栗園種植鼠茅草可促進(jìn)土壤紅菇屬的增殖,光葉紫花苕可促進(jìn)粒毛盤菌屬和單頂孢屬的增殖。本研究發(fā)現(xiàn),對細(xì)菌而言,蘋果園連續(xù) 3 a生草,各處理的土壤Shannon和Simpson指數(shù)差異不大, 3個(gè)人工生草處理的Chao1和ACE指數(shù)整體高于自然生草處理;對真菌而言,自然生草處理的真菌Shannon指數(shù)隨生草年限變化不大,3個(gè)人工生草處理的Shannon指數(shù)隨著年份的推移逐漸下降,長柔毛野豌豆處理的Chao1和ACE指數(shù)整體高于其他處理。可見人工生草對土壤細(xì)菌的多樣性和均一性影響不大,但在一定程度上降低真菌的多樣性和均一性,長柔毛野豌豆處理可在一定程度上提高蘋果園土壤的真菌 總數(shù)。

微生物相對豐度分析發(fā)現(xiàn),連續(xù)3 a生草處理,各處理的鞘氨醇單胞菌Sphingomonas相對豐度整體呈上升趨勢,溶桿菌Lysobacter呈先上升后下降趨勢;白三葉和長柔毛野豌豆處理可顯著提高果園土壤木霉屬Trichoderma真菌的相對豐度;黑麥草、白三葉和自然生草可在一定程度上提高果園土壤白粉菌屬Blumeria的相對豐度?？傮w比較可以發(fā)現(xiàn),長柔毛野豌豆生草處理可在一定程度上提高鞘氨醇單胞菌、木霉菌等有益菌的相對豐度,但對白粉菌等有害菌不表現(xiàn)刺激作用,對果園土壤微生態(tài)環(huán)境有益。

土壤微生物相對豐度與理化性質(zhì)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),青枯菌屬Ralstonia與有效磷和pH呈顯著正相關(guān);鞘氨醇單胞菌Sphingomonas與pH呈顯著負(fù)相關(guān);芽孢桿菌Bacillus與有效磷呈顯著正相關(guān),與pH呈極顯著正相關(guān);溶桿菌Lysobacter與有效磷呈顯著正相關(guān);鏈格孢屬Alternaria相對豐度與pH呈顯著正相關(guān);白粉菌屬Blumeria相對豐度與堿解氮呈極顯著正相關(guān),與有效磷呈極顯著負(fù)相關(guān)。同時(shí),刺盤孢屬Colletotrichum相對豐度與有機(jī)質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān),與速效鉀呈極顯著負(fù)相關(guān);葡萄穗霉屬Stachybotrys相對豐度與有機(jī)質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)?？梢?在生草條件下,適當(dāng)提高果園土壤有效磷含量、降低pH,可在一定程度上降低青枯菌、白粉菌等病原菌的相對豐度,提高芽孢桿菌、溶桿菌等有益菌的相對豐度;適當(dāng)提高土壤有機(jī)質(zhì)含量,可在一定程度上降低刺盤孢屬、葡萄穗霉屬等病原菌的相對豐度,進(jìn)一步改良土壤微生態(tài)環(huán)境。

4 結(jié) 論

土壤理化性狀測定發(fā)現(xiàn),蘋果園連續(xù)生草 3 a,可顯著提高果園土壤養(yǎng)分含量、降低土壤pH。其中長柔毛野豌豆處理可以顯著提高土壤堿解氮、速效鉀含量,白三葉處理可以顯著提高堿解氮含量,黑麥草處理可以顯著提高土壤速效鉀含量。

微生物相對豐度分析發(fā)現(xiàn),長柔毛野豌豆生草處理可在一定程度上提高鞘氨醇單胞菌、木霉菌等有益菌的相對豐度,對果園土壤微生態(tài)環(huán)境有益。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),在生草條件下,適當(dāng)提高果園土壤有效磷和有機(jī)質(zhì)含量及降低pH,可在一定程度上降低青枯菌、白粉菌、刺盤孢屬、葡萄穗霉屬等病原菌的相對豐度,提高芽孢桿菌、溶桿菌等有益菌的相對豐度,有助于改良土壤微生態(tài) 環(huán)境。