馬婭楠,李繼平,,3,鄭 果,,3,張金奎,馬生彪,惠娜娜,3,王 立,3,張自強(qiáng)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,蘭州 730070;2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所,蘭州 730070;3.農(nóng)業(yè)部天水作物有害生物科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站,甘肅天水 741299)

赤芍(PaeoniaveitchiiLynch)為毛茛科(Ranunculaceae)多年生草本植物,是中國(guó)傳統(tǒng)野生中藥材,應(yīng)用歷史悠久[1],種質(zhì)資源豐富,在中國(guó)四川、甘肅、陜西、云南、貴州、青海等地有大面積栽培[2]。

赤芍入藥部位為根部,具有抗腫瘤[3]、散瘀止痛[4]、清肝火[5-6]等功效。此外,赤芍花色艷麗,花香四溢,是花壇和公園的首選觀賞植物,適合生態(tài)綠化及林地經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)。

2021年5月,在甘肅省定西市渭源縣赤芍種植示范田發(fā)現(xiàn)一種新的赤芍根部病害。受侵染植株地上部出現(xiàn)葉片發(fā)黃、植株瘦弱矮小、近地部腐爛及整株干枯死亡等癥狀,根部組織變色腐爛且有異味,嚴(yán)重影響赤芍的生產(chǎn)量、藥用品質(zhì)及觀賞價(jià)值。

據(jù)報(bào)道芍藥屬病害有炭疽病、葉斑病、銹病、灰霉病、白粉病、白絹病等[7-9],但未見(jiàn)赤芍根部病害的詳細(xì)調(diào)查及病原菌鑒定報(bào)道。為明確赤芍根腐病病原菌及相關(guān)特性,遂對(duì)其進(jìn)行了病原菌分離鑒定及生物學(xué)特性研究,以期為該病害的田間診斷及有效防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 病害樣品的采集及病原菌分離

2021年5月,從甘肅省定西市渭源縣赤芍種植示范田隨機(jī)采集典型根腐病根部病樣。

采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離[10]:縱切發(fā)病根部,在病健交界處切取大小為5 mm×5 mm的組織塊,浸入75%酒精溶液中消毒10 s,然后投入3%次氯酸鈉溶液中消毒45 s,再用滅菌水清洗3次,晾干后移入PDA 平板,25 ℃黑暗條件下培養(yǎng),待邊緣長(zhǎng)出菌絲后,根據(jù)顏色和形態(tài),挑取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA平板進(jìn)行純化,純化后置于PDA斜面上,4 ℃保存。

1.2 致病性測(cè)定

采用室內(nèi)離體接種法進(jìn)行致病性測(cè)試[11]:純化菌培養(yǎng)15 d后,洗脫孢子以制備懸浮液,利用紐鮑爾血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子濃度,孢懸液稀釋至107mL-1。選取健康赤芍根部,用75%的酒精擦拭表面,將其切成8～10 cm長(zhǎng)的小根段,移液槍吸取10 μL接種于表面,進(jìn)行刺傷與未刺傷兩個(gè)處理,無(wú)菌水作為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次。接菌后保濕置于25 ℃下黑暗培養(yǎng),逐日觀察發(fā)病 情況。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察記錄病原菌在PDA平板上的菌落形態(tài)、顏色變化、菌絲生長(zhǎng)速率等,并對(duì)分生孢子形態(tài)、大小及顏色進(jìn)行顯微觀察、拍照。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

采用真菌基因組提取試劑盒(Solarbio)提取基因組DNA,利用引物ITS1/ ITS4[12]、LROR/LR7[13]、EF1-728F/EF1-986R[14]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取5 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂凝膠上檢測(cè)出陽(yáng)性后,將合成引物和PCR產(chǎn)物委托生工生物工程(上海 )有限公司完成測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI中已知的序列進(jìn)行Nucleotide Blast同源性比對(duì),下載相關(guān)的屬種序列(表1)。利用 MAFF v7．037b軟件進(jìn)行多重比較,GBLOCKS 0.91b軟 件 進(jìn) 行 保 守 區(qū) 域 選擇,ACOPTools軟件將各基因串聯(lián)成數(shù)據(jù)集并用PAUP v4.0b10軟件和最大簡(jiǎn)約法(Maximum Parsimony,MP)構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1 參考菌株信息和GenBank登錄號(hào)

1.5 病原菌的生物學(xué)特性測(cè)定

1.5.1 光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 光照條件設(shè)置為全黑暗(24 D)、全光照(24 L)、16 h光照+ 8 h黑暗(16 L/8 D)和12 h光照+12 h黑暗 (12 L/12 D)。

1.5.2 pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 培養(yǎng)基pH設(shè)定為4、5、6、7、8、9、10、11、12共9個(gè)梯度。

1.5.3 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 設(shè)定5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃共7個(gè)溫度條件。

1.5.4 培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 選擇PDA、Czapek、OA、NA、黑麥培養(yǎng)基共5種培 養(yǎng)基。

1.5.5 碳源和氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 以Czapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將蔗糖替換成等量的(以碳元素的質(zhì)量計(jì)算)麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇;將硝酸鈉替換成等量的(以氮元素的質(zhì)量計(jì)算)蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、硝酸納、甘氨酸。同時(shí),以不加碳源和氮源作為對(duì)照(CK)。

將病原菌菌餅(d=5 mm)接種在不同培養(yǎng)基平板中央,除溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響外,所有處理均在25 ℃下黑暗培養(yǎng),5 d后測(cè)量菌落直徑,15 d后測(cè)量產(chǎn)孢量,每個(gè)處理重復(fù)3次。用Excel 2016和SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析,Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤芍根部病害癥狀及病原菌分離

田間自然發(fā)病植株根部變色腐爛,根皮表面有黑褐色病斑,根皮與韌皮部脫離,橫切面木質(zhì)部有黑色擴(kuò)散,并有異臭味,地上部分葉片褪綠皺縮變小,枝條枯死,發(fā)育不全,后期嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全株死亡(圖1-A～1-B)。從采集的赤芍發(fā)病根部,分離純化獲得6株菌落顏色及形態(tài)一致的菌株,編號(hào)為CS-1～CS-6,隨機(jī)選取菌株CS-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

A.田間發(fā)病植株;B.發(fā)病植株近地部;C.赤芍根腐病發(fā)病根部(紅色圓圈區(qū)域?yàn)榉蛛x樣部位);D.病原菌孢子懸浮液接種7 d根段(左為根段表面發(fā)病癥狀,右為病原菌擴(kuò)展?fàn)顩r); E.孢子懸浮液接種10 d后病原菌擴(kuò)展根段; F.對(duì)照

2.2 致病性測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明CS-1可使刺傷根部發(fā)病。接菌7 d后,根部表面有明顯棕褐色病變并附著白色菌絲,10 d后接種部位變黑并伴有腐爛發(fā)生,切開(kāi)侵染根段后發(fā)現(xiàn),病原菌已向木質(zhì)部擴(kuò)散,與田間發(fā)病癥狀一致。再分離已發(fā)病的接菌病根,可獲得與原接種菌一致的菌落形態(tài)與分生孢子,符合柯赫氏法則,進(jìn)一步證實(shí)了CS-1為赤芍根腐病的致病菌(圖1)。

2.3 形態(tài)鑒定結(jié)果

病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快,7 d后直徑可達(dá)90 mm,菌落初呈白色或乳白色,具輪紋,由內(nèi)向外呈放射狀,背面呈白色(圖2-A～2-B)。15 d后,培養(yǎng)基表面變成橘黃色并開(kāi)始產(chǎn)生黑棕色油狀分生孢子團(tuán)。分生孢子團(tuán)為球形或近球形,直徑為231.5 ～ 512.4 μm,最初透明,后期逐漸變?yōu)楹谧厣?圖2-C)。分生孢子梗形態(tài)明顯,透明呈近柱狀,頂端著生有一至兩個(gè)分生孢子,分生孢子大小為(7.5～11.0) μm×(5.5～7.5) μm,褐色,厚壁,球形至近球形(圖3-D～3-F)。通過(guò)形態(tài)學(xué)特征比較,可初步鑒定該病原菌為Coniella屬[15]。

A-B.PDA上菌落形態(tài)(正反面);C.PDA上的分生孢子團(tuán);D-E.分生孢子器;F.分生孢子

圖3 基于ITS、LSU、TEF-α多基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建結(jié)果

PCR擴(kuò)增后獲得大小分別為601 bp(ITS)、 1 327 bp(LSU)和373 bp(TEF1-α)的DNA片段,將測(cè)序結(jié)果置于GenBank獲得登錄號(hào)分別為OP824764(ITS)、OP824767(LSU)和OP903926(TEF1-α)。Blastn分析結(jié)果顯示,供試菌株CS-1與Coniellafragariae的相似度為99%～100%。選用其近源相關(guān)序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(表1),結(jié)果表明:CS-1與C.fragariae遺傳距離最近,聚于同一分支上,區(qū)別于其他Coniella屬(圖3)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,確定該病原菌為草莓墊殼孢(C.fragariae)。

2.5 生物學(xué)特性測(cè)定

2.5.1 光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 病原菌在24D、24L、16L/8D和12L/12D條件下均能生長(zhǎng),菌絲生長(zhǎng)速率表現(xiàn)為24D>16L/8D>12L/12D>24L,在24L條件下測(cè)得的菌落直徑最小,為62.38 mm,顯著低于其他處理。在4種光照條件下均可產(chǎn)孢,除24L外,其余光照條件下產(chǎn)孢量無(wú)顯著差異(圖4)。

圖中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05),下同

2.5.2 溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 病原菌在 10 ℃～30 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng),最適菌絲生長(zhǎng)溫度為20 ℃～25 ℃,25 ℃時(shí)產(chǎn)孢量達(dá)最高。在 5 ℃和35 ℃溫度下,菌落大小無(wú)變化,菌絲無(wú)生長(zhǎng),未見(jiàn)產(chǎn)孢(圖5)。

圖5 不同溫度下的病原菌菌絲和產(chǎn)孢量

2.5.3 培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 病原菌在供試的5種培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng),菌落從大到小依次為PDA、OA、黑麥培養(yǎng)基、Czapek和NA,其中在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快,平均菌落直徑為 63.92 mm,顯著大于其他培養(yǎng)基中的菌落直徑。在黑麥培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高,在Czapek和NA上不產(chǎn)孢(圖6)。

Ⅰ.PDA培養(yǎng)基;Ⅱ.黑麥培養(yǎng)基;Ⅲ.OA培養(yǎng)基;Ⅳ.NA培養(yǎng)基; Ⅴ.Czapek培養(yǎng)基

2.5.4 pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 適宜病原菌生長(zhǎng)的pH為6～7,且pH為7時(shí)菌落直徑和產(chǎn)孢量達(dá)到最大。過(guò)酸或過(guò)堿均不利于該菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢(圖7)。

圖7 不同pH下病原菌菌絲和產(chǎn)孢量

2.5.5 碳源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 病原菌菌絲在供試的6種培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng),表明該菌能夠利用多種碳源。以乳糖為碳源時(shí),菌落直徑最大,為50.48 mm,顯著大于以麥芽糖、甘露醇、葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí)的菌落直徑。該菌在供試的6種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)孢(表2)。

表2 不同碳源下病原菌的生長(zhǎng)

2.5.6 氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 由表3可見(jiàn),病原菌在以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑最大,顯著大于以牛肉膏、甘氨酸、硝酸鈉、硫酸銨為氮源的菌落直徑。該菌在供試的7種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)孢。不同碳源與氮源下病原菌的菌落形態(tài)見(jiàn)圖8。

表3 不同氮源下病原菌的生長(zhǎng)

A.乳糖;B.甘露醇;C.麥芽糖;D.葡萄糖;E.蔗糖;F.無(wú)碳源;G.酵母膏;H.蛋白胨;I.牛肉膏;J.甘氨酸;K.硝酸鈉;L.硫酸銨

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)一種新的赤芍根部病害,經(jīng)病原菌分離純化、致病性檢測(cè)、形態(tài)特征觀察和多基因序列分析,確定該病原菌為草莓墊殼孢(Coniellafragariae)。據(jù)報(bào)道,C.fragariae可侵染薔薇屬(Rosasp.)、小麥屬(Triticumsp.)、歐洲草莓(FragariavescaL.)、草莓屬(Fragariasp.)、豌豆(PisumsativumL.)、碗豆屬(Pisumsp.)、葉下珠屬(Phyllanthussp.)、榆綠木屬(Anogeissussp.)、展葉松(PinuspatulaSchlecht.et Cham)、柏木屬(Cupressussp.)等[16],但未見(jiàn)病原菌分離鑒定及生物學(xué)特性方面的研究報(bào)道。2020年,張智博等[17]從赤芍根部分離出C.fragariae,但并未將其作為致病菌進(jìn)行研究,而是以?xún)?nèi)生菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。本研究首次發(fā)現(xiàn)C.fragariae侵染赤芍根部導(dǎo)致根腐病,但致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該菌不能侵染無(wú)傷的赤芍根部,說(shuō)明該菌致病性或寄生性較弱,只能通過(guò)傷口侵入[18]。因此,該病的防控方面,應(yīng)避免根部受傷,預(yù)防地下害蟲(chóng),該病害侵染是否存在復(fù)合侵染尚需進(jìn)一步研究。

病原菌的生物學(xué)特性與其生長(zhǎng)環(huán)境有著密切聯(lián)系,根據(jù)生物學(xué)特性研究可以更好地預(yù)測(cè)病情發(fā)生時(shí)期以及對(duì)病害的防控[19-21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明:病原菌在供試的多種培養(yǎng)基上都能生存,OA和黑麥培養(yǎng)基可促進(jìn)其產(chǎn)孢,全光照不利于病原菌生長(zhǎng),最適溫度為20～25 ℃,這與5月份當(dāng)?shù)爻嗌指〉陌l(fā)生趨勢(shì)相符。該病發(fā)生最適pH為6～7,喜好中性偏酸環(huán)境,與赤芍多年性生長(zhǎng)、連作導(dǎo)致土壤偏酸有關(guān)。病原菌在不同的碳氮源條件下均可存活,但對(duì)碳源的利用率較低,生長(zhǎng)至后期也未見(jiàn)有明顯的菌落形成,且不產(chǎn)孢,但在不同氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)差異顯著,酵母膏為氮源時(shí)菌絲茂密且菌落形態(tài)明顯,缺氮時(shí)該菌停止生長(zhǎng)。該結(jié)果與赤芍田間施肥管理有無(wú)直接關(guān)系,有待進(jìn)一步研究。