惠林沖,潘美紅,陳 微,李威亞,何林玉,張仕林,繆美華,陳振泰,楊海峰

(連云港市農(nóng)業(yè)科學院,江蘇連云港 222000)

洋蔥(AlliumcepaL.)的葉色為綠色,外葉表面有角質(zhì)層蠟粉覆蓋,角質(zhì)層蠟保護植物并影響許多生理特征,被認為參與角質(zhì)形成以及針對非生物和生物脅迫的防御反應,如病原菌[1]、昆蟲[2]、干旱及低溫等[3]。洋蔥蠟粉缺失突變體是由普通有蠟粉突變而來,肉眼觀察植株表面蠟粉缺失,顏色油綠,有光澤,在蔥屬植物洋蔥[4]、大蔥均有突變植株產(chǎn)生,無蠟粉突變受單個隱性基因控制[5-6]。按洋蔥表面蠟質(zhì)含量的多少分為“蠟質(zhì)型”和“光澤型”[7]。在視覺上介于蠟質(zhì)和光澤之間的表型,稱為“半光澤”,“光澤型”相對于蠟質(zhì)型具有很少的蠟,并且顯示出對洋蔥薊馬的抗性[8],但是易受噴霧農(nóng)藥損害,病原體侵入[9]和過度蒸騰的影響[10]。

洋蔥的最外層由角質(zhì)層和表皮蠟組成,蠟主要由植物表皮中的超長鏈脂肪酸(VLCFAs)及其衍生物組成。這些化合物由兩條途徑合成,一種途徑是酰基還原途徑,涉及初級醇和蠟酯的生產(chǎn)[11];另一種途徑是脫羰化,包括醛、烷、酮和仲醇的合成,參與種子甘油酯,鞘脂和脂質(zhì)生物膜的合成,并為蠟質(zhì)角質(zhì)層的生物合成提供前體[12]。洋蔥5號染色體上的區(qū)域可能影響角質(zhì)層蠟生物合成的脫羰途徑[10]。Liu等[13]對大蔥無蠟粉突變體轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn),長鏈脂肪酸代謝,超長鏈脂肪酸代謝,蠟生物合成和氧化還原,可能參與蠟前體的合成。

自2014年開始田間收集洋蔥無蠟粉材料,擬對洋蔥無蠟粉田間表型特征、超微結(jié)構(gòu)及蠟質(zhì)成分進行初步研究,為研究洋蔥保持系可視化標記、雜交種純度及抗蔥薊馬調(diào)控機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 無蠟粉突變體材料田間性狀統(tǒng)計

洋蔥試驗材料的生態(tài)類型為中日照,全部來自于連云港市農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究室。2017年11月在資源圃中挑選出無蠟粉突變體洋蔥苗,2018年5月收獲種球,10月種球種植,2019年5月花期進行單株套袋自交,收獲的種子于9月份全部播種育苗,11月定植。選取3個黃皮和3個紫皮品種有蠟粉洋蔥為對照,正常使用農(nóng)藥管理,無蠟粉20份材料,正常肥水管理,全程不使用任何農(nóng)藥,2020年4月統(tǒng)計洋蔥膨大初期株高、葉片開展度、葉形、薊馬數(shù)量,5月中下旬統(tǒng)計熟期、平均單球質(zhì)量。每個小區(qū)15 m2,重復3次,隨機分布。5月下旬洋蔥膨大末期,觀察薊馬危害洋蔥葉片情況,統(tǒng)計洋蔥受害葉面積,建立無蠟粉突變體抗薊馬評價體系。

對19212、19238、19061 3份材料與有蠟粉采用人工去雄與輔助授粉的方式進行正反雜交,每花球留15～25朵花,套羊皮紙袋,重復3次。收獲的F1進行自交,檢測F2代分離比。

1.2 葉綠素含量的測定

在洋蔥球膨大初期,取新葉組織0.05 g,在液氮下研磨,放入50 mL試管中,加25 mL的95%乙醇混勻置于黑暗條件下,2 h后,取上清液于652 nm波長下比色測OD值,重復3次[14]。

葉綠素含量(鮮質(zhì)量%)=(OD652×V)/34.5×W

式中:V為提取液總量(mL);W為葉片鮮質(zhì)量(mg)。

1.3 洋蔥葉片超微結(jié)構(gòu)觀察及蠟質(zhì)成分分析

取19061材料有蠟粉和無蠟粉的葉片進行超微結(jié)構(gòu)觀察。將葉片橫切成面積5 mm×5 mm大小,然后用2%的鋨酸熏蒸 24 h,自然風干 24 h,用銀膠固定在樣品臺上,噴金,于SEM掃描電鏡下進行觀察[15]。

將葉片浸沒在裝有15 mL 正己烷的玻璃試管中提取30 s,再在每個樣品中加入20 μg 正24碳烷烴(C24,SUPELCO,Sigma)標樣作為內(nèi)標,然后用氮氣吹干。加入100 μL N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA,SUPELCO,Sigma),90 ℃恒溫箱衍生30 min。然后用氮氣吹干衍生劑,加入1 mL 正己烷溶解樣品,過濾轉(zhuǎn)移至新的色譜瓶。采用氣相色譜儀質(zhì)譜儀(Thermo Trace1310 ISQ)分析樣品,色譜柱:30 m×0.25 mm×0.25 μm;柱溫:初溫60 ℃保持5 min,以 3.5 ℃/min升至100 ℃,保持5 min;再以 8 ℃/min升至200 ℃,保持5 min;再以 15 ℃/min升至280 ℃,保持15 min;進樣口溫度:280 ℃;載氣流速:1.2 mL/min;不分流;質(zhì)譜條件:離子源溫度:280 ℃,傳輸線溫度:250 ℃;質(zhì)譜:EI源 轟擊電壓:70 eV。自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù),對照標準譜圖及參考相關(guān)文獻對機檢結(jié)果進行核對,確定成分,按面積歸一化法計算各組分含量[16]。

1.4 洋蔥無蠟粉突變材料SSR篩選及差異分析

利用前期無蠟粉與有蠟粉轉(zhuǎn)錄組測序獲得的SSR引物進行篩選分析,隨機選取335對引物對同一株有蠟粉植株自交分離的無蠟粉和有蠟粉材料驗證,取新鮮葉片,液氮研磨,采用北京天根DNA試劑盒(型號:DP350-03)提取洋蔥基因組DNA,引物由福州白鯨生物科技有限公司合成(表1),PCR擴增試劑購置于TAKARA公司,反應體系為25 μL,包括:2 μL DNA(0.1 μg), 2.5 μL 10× PCR buffer,1.25 μL(10 μmol/L)正向引物,1.25 μL(10 μmol/L)反向引物,2 μL dNTPs(10 mmol/L),0.25 μLTaq酶和 15.8 mL ddH2O,95 ℃預變性 5 min;95 ℃變性 30 s、58 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s,35個循環(huán);72 ℃再延伸 10 min。擴PCR產(chǎn)物采用9%的聚丙烯酰氨凝膠垂直電泳檢測,電壓100 V,電泳 3 h,硝酸銀染色,相機在膠片燈上拍照記錄[14]。對篩選出有差異位點的引物,選用19212、19238、19061 3份材料有蠟粉和無蠟粉的材料進行標記驗證。

表1 洋蔥SSR標記引物

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥突變材料形態(tài)特征及主要農(nóng)藝性狀

2.1.1 洋蔥無蠟粉突變株葉片顏色鑒定 無蠟粉洋蔥苗期因葉片小很難發(fā)現(xiàn),葉片顏色較正常植株呈亮綠色,有光澤(圖1-B),種球秋季種植發(fā)芽后全株葉片均表現(xiàn)無蠟粉特征(圖1-A左),花薹表面無明顯白色蠟粉,但有一層薄薄的透明粉層(圖1-B);正常植株葉片表面覆蓋白色蠟粉層(圖1-A右),花薹顏色綠色表面泛白(圖1-C)。

對19212、19238、19061 3份材料與有蠟粉正反授粉,F1均有蠟粉,套袋單株自交后F2苗期葉片出現(xiàn)分離,有蠟粉與無蠟粉分離比為約為3∶1(表2),表明洋蔥葉片蠟粉受隱性單基因控制。

2.1.2 洋蔥無蠟粉突變株農(nóng)藝性狀 對洋蔥球型、皮色、熟期、葉形、莖高、葉片開展角度、平均單球質(zhì)量、使用殺蟲劑和未使用殺蟲劑后薊馬數(shù)量等農(nóng)藝性狀統(tǒng)計觀察,前期在紫皮、黃皮和白皮均有收集到無蠟粉突變株,但白皮和黃皮材料突變數(shù)量比較少。無蠟粉洋蔥苗期長勢比正常的要弱,葉片細長,熟期較晚,但對產(chǎn)量的影響不大,與自身的材料有關(guān),19212、19233單球質(zhì)量分別達326 g、352 g(表3),已達到市場商品種的單球質(zhì)量。另外由于苗期長勢弱,達不到春化抽薹的標準,因此無蠟粉突變體均未發(fā)生抽薹,對照組抽薹在3%～5%。不同洋蔥球膨大初期葉綠素含量之間差異顯著,有蠟粉772、1924、1937 3份總?cè)~綠素含量較高,952、1870、1922有蠟粉與無蠟粉葉綠素含量差異顯著,另外葉綠素含量多少與洋蔥單球質(zhì)量之間無相關(guān)性,田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)洋蔥19212雖然葉片直立,葉綠素含量少,但單球質(zhì)量高達326 g,說明葉片生物學轉(zhuǎn)化率高,適合高密度栽培提高產(chǎn)量,同時莖桿高達11.5 cm,適合未來發(fā)展機械化去秧。盡管19233單球質(zhì)量最高352 g,單葉片粗、葉片頂部彎,開展度也達最大60°,田間整體效果不適合高密度栽培和機械化 發(fā)展。

表3 洋蔥生物學數(shù)據(jù)統(tǒng)計

莖高和葉片開展度對薊馬影響不大,對照正常有蠟粉材料772、952、1870、1922、1924、1937在未使用殺蟲劑的情況下,薊馬數(shù)量顯著高于無蠟粉材料,與使用殺蟲劑后的效果差不多,表明無蠟粉突變體材料在不使用殺蟲劑的情況下能夠達到抗蔥薊馬的效果(表3)。

薊馬主要危害洋蔥葉片表面結(jié)構(gòu),啃食過后會在洋蔥葉表面留下白色傷斑(圖2),無蠟粉洋蔥葉片薊馬數(shù)量少,說明無蠟粉葉片對薊馬無吸引力,或者薊馬對其產(chǎn)生抵觸。根據(jù)無蠟粉洋蔥葉片被薊馬危害情況,建立評價田間自然條件下無蠟粉突變體對不同薊馬的抗性級別標準 (表4)。

表4 洋蔥無蠟粉突變體抗薊馬評價標準

2.2 洋蔥葉片表面超微結(jié)構(gòu)觀察

洋蔥膨大初期葉片快速生長,突變型與正常葉片視覺光滑度差異極為顯著,正常洋蔥葉片覆有蠟粉層,突變體葉片光滑,顏色亮綠。電鏡觀察(圖3)發(fā)現(xiàn)正常葉片表面有蠟質(zhì)晶體,以顆粒狀為主,分散均勻;無蠟粉葉片表面有少量細小的顆粒狀晶體、無聚集,說明無蠟粉突變體葉片并不是沒有蠟質(zhì),而是蠟質(zhì)晶體非常少,肉眼不足以觀 察到。

箭頭指向為蠟質(zhì)晶體;A.正常有蠟粉洋蔥;B.無蠟粉突變體洋蔥

洋蔥盛花期間,整個花薹的蠟粉會越來越多,形成白色蠟粉霜層,用手輕輕擦拭會露出綠色組織(圖4-A,4-C),手上留有白色蠟粉;而無蠟粉突變體葉片生長過程中觀察均無明顯白色蠟粉,但在花薹后期表面有一層光亮的蠟質(zhì),用手擦拭明顯感覺到一層透明蠟粉被擦拭下來(圖4-B, 4-D),說明無蠟粉突變體并不是絕對無蠟粉。

A.有蠟粉花薹; B.無蠟粉洋蔥花薹;C.有蠟粉花薹表面蠟粉層被擦除后;D.無蠟粉花薹表面蠟粉被擦除后

2.3 洋蔥葉片蠟質(zhì)成分分析

采用氣相質(zhì)譜儀對洋蔥膨大初期葉片表面蠟質(zhì)成分進行分析,正常葉片與無蠟粉葉片分別離鑒定出46和41種化合物,兩者相同化合物有20種,其他均不同。相同的化合物均占總量的92%以上,兩者不同的化合物占比非常少,兩種洋蔥葉片蠟質(zhì)成分相對含量高的9種化合物,有蠟粉與無蠟粉葉片蠟質(zhì)化合物分別占總量的96.07%、91.47%,表明洋蔥無蠟粉葉片的表面并不缺乏蠟質(zhì)成分。洋蔥有蠟粉與無蠟粉葉片蠟質(zhì)主要成分含量對比發(fā)現(xiàn),16-三十一酮在無蠟粉葉片中由相對含量52.66%降低到2.79%,芥酸酰胺和和2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)兩種化合物含量在無蠟粉葉片中均增加。其他化合物含量占比均差異不明顯,另外在各自含量較多的9種化合物中,二十五烷和14-二十九烷酮在無蠟粉單獨檢測出,兩者相對含量占7.77%;二十八烷和醚菌酯在有蠟粉葉片單獨有檢測出,兩者相對含量占4.17%(表5),表明這幾種增加和獨有的化合物對洋蔥葉片蠟粉的視覺表型可能無影響,而蠟粉中含量最高的16-三十一酮含量的減少是影響洋蔥無蠟粉突變體表型的主要化合物。

表5 洋蔥葉片蠟質(zhì)成分化合物相對含量

2.4 洋蔥無蠟粉突變材料SSR篩選及差異分析

利用355對SSR引物對洋蔥19061材料單株自交分離無蠟粉和有蠟粉葉片混合DNA進行篩選,有19對引物未擴增出條帶,在剩余的336對引物中篩選出兩對引物196和引物304擴增有差異條帶,196引物在無蠟粉中缺200 bp條帶的差異,差異條帶清晰明顯(圖5),引物304條帶較為淡,其他引物均無差異或差異不明顯。為驗證兩對引物是否能夠區(qū)分其他無蠟粉與有蠟粉植株,發(fā)現(xiàn)并不能夠區(qū)分有蠟粉與無蠟粉植株,而對19061材料的有蠟粉與無蠟粉單株DNA檢測發(fā)現(xiàn),同樣是不能夠區(qū)分無蠟粉與有蠟粉,而只能區(qū)分其中的一株材料具有差異位點,所以引物196和304不能作為分子標記來區(qū)分洋蔥有蠟粉與無蠟粉材料,作為單株特異性標記。

3 討 論

植物表面蠟質(zhì)具有防止非氣孔的水分散失、病蟲害的侵入和太陽輻射的生物學功能[17],洋蔥葉片無蠟粉突變體在整個生育周期中,葉片均表現(xiàn)出無蠟粉的特征,葉片表現(xiàn)亮綠色,能夠明顯區(qū)分正常洋蔥;正反交遺傳表明受隱性單基因控制,與前人研究大蔥[5]、洋蔥[18]、小青菜[19]和甘藍[20]等葉片無蠟粉突變遺傳規(guī)律一致。

從收集到的無蠟粉材料中,部分洋蔥球產(chǎn)量達到商品種的標準,尤其是無蠟粉材料苗期長勢弱,從而避免返春先期抽薹的情況。從表型觀察到無蠟粉葉色為亮綠色,但總?cè)~綠素含量相對正常有蠟粉洋蔥低,也進一步解釋苗期相對弱的情況。

植物角質(zhì)層蠟參與角質(zhì)形成以及針對非生物和生物脅迫的防御反應[21]。甘藍葉表皮蠟質(zhì)含量與跳蚤甲蟲、卷心蟲生物造成的傷害程度之間均存在明顯的負相關(guān)[22],研究表明甘藍表皮蠟是抗蟲的重要物質(zhì)[23]。但洋蔥無蠟粉突變體表現(xiàn)出抗蔥薊馬的特征,在不使用農(nóng)藥的情況下無蠟粉突變體上薊馬數(shù)量和有蠟粉使用殺蟲劑效果基本相同,另外不同的材料之間的抗薊馬程度也不相同。與國外研究洋蔥無蠟粉突變體抗薊馬結(jié)果基本一致,發(fā)現(xiàn)不同基因型的洋蔥葉的顏色和蠟質(zhì)對薊馬抗性有關(guān):淺綠色至綠色的葉子,葉片蠟含量少,葉子光滑的基因型具有抗性,而葉子不光滑、有蠟粉的基因型易感薊馬[24-25]。另外,研究發(fā)現(xiàn)洋蔥的葉片表皮可以作為取食的引誘劑,因此,更薄的表皮厚度可以減少薊馬的危害[26]。

在有蠟粉(非突變體)洋蔥研究抗薊馬中發(fā)現(xiàn),具有封閉(緊密)葉腋紋(開展度),藍色至深綠色葉色和蠟質(zhì)葉是洋蔥薊馬的優(yōu)選,而具有開放葉腋形圖案,淺綠色葉色和光澤(非蠟質(zhì))葉子對薊馬具有一定的抗性[27]。在本研究洋蔥無蠟粉突變體中,薊馬數(shù)量多少與葉片開張度關(guān)系不大,因為本身無蠟粉具有抗薊馬特征,薊馬數(shù)量相對少,同時薊馬是晝伏夜出,所以開張度越小越有利于薊馬的躲藏。不同作物中蔥薊馬對顏色的吸引有所不同,馬鈴薯田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)蔥薊馬表現(xiàn)出對中綠色的偏愛,而不是紅色、藍色和白色[28]。在白、黃、藍、熒光黃誘捕劑對蔥薊馬的引誘作用,發(fā)現(xiàn)熒光黃誘捕的薊馬最多[29],洋蔥無蠟粉突變體葉片顏色的變化,可能對蔥薊馬有一定的影響。

本研究對無蠟粉突變和有蠟粉洋蔥膨大初期的葉片蠟質(zhì)成分進行檢測分析,發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)主要成分為酮、脂肪醇和烷三大類,盡管鑒定有46種化合物,但洋蔥蠟質(zhì)主要成分是16-三十一酮,而無蠟粉葉片16-三十一酮的大量減少導致葉片表現(xiàn)出無蠟粉的特征,與前人研究一致,16-三十一酮是負責洋蔥葉片上的視覺蠟質(zhì)。在視覺上介于蠟質(zhì)和光澤之間的 “半光澤”[7],可以保護葉子免受疾病或環(huán)境脅迫,同時仍然賦予對洋蔥薊馬的抗性。Munaiz等[30]研究蠟質(zhì)成分檢測也發(fā)現(xiàn)無蠟粉突變體并不缺失主要蠟質(zhì)成分,只是部分含量的減少,尤其的洋蔥抽薹開花后期,大量的白色蠟質(zhì)集中在花薹上形成白霜層,無蠟粉突變體也產(chǎn)生少量的白色蠟質(zhì)晶體,與電鏡掃描觀察結(jié)果相一致,進一步說明16-三十一酮在表型蠟粉中起關(guān)鍵作用。

研究發(fā)現(xiàn)16-三十一酮是控制蠟粉的主要成分,酮類化合物代謝合成途徑中cer1基因被鑒定為控制甘藍光澤表型的候選基因,39 bp缺失導致mRNA破壞并降低BrCER1基因的表達。序列分析表明,Brcer1基因的功能缺失突變與Cgl1不同,Cgl1之前已被證明是甘藍中光澤表型的原因[19],顯示了典型的平行選擇,對洋蔥表皮蠟生物合成途徑提供研究思路。

為了進一步開發(fā)洋蔥無蠟粉突變體分子相關(guān)標記,利用無蠟粉突變體測序獲得的轉(zhuǎn)錄組SSR進行篩選,在混和DNA樣品19061中比較有蠟粉與無蠟粉差異位點,初步篩選出196和304兩對有差異位點的引物,但利用其他無蠟粉材料的DNA進行驗證,并不是無蠟粉特異分子標記,需要進一步通過測序分析堿基情況。 為直接應用洋蔥無蠟粉突變體抗蔥薊馬特性,后期課題組將會從綜合性狀優(yōu)良的材料中,利用jnurf13分子標記篩選保持株做父本,創(chuàng)制抗蟲不育系,直接應用生產(chǎn)全不育型洋蔥無蠟粉抗蟲雜交新品系,為國內(nèi)洋蔥自主創(chuàng)新育種奠定基礎。