張新業(yè),李文靜,閆訓(xùn)友,鄭 京,朱 姝,王聰艷,周志國

(1.廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,河北廊坊 065000;2.河北省動物多樣性重點(diǎn)實驗室,河北廊坊 065000;3.廊坊市細(xì)胞工程與應(yīng)用研究重點(diǎn)實驗室,河北廊坊 065000)

木質(zhì)素是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的重要大分子,能夠起到機(jī)械支撐、保證水分運(yùn)輸?shù)淖饔?并能協(xié)助植物抵御病蟲害[1]。木質(zhì)素作為非糖類膳食纖維,廣泛分布于谷物、水果和蔬菜中,具有多種生理調(diào)節(jié)功能[2]。但木質(zhì)素含量過高會導(dǎo)致肉質(zhì)根類蔬菜“糠心”,并嚴(yán)重影響其食用和營養(yǎng)價值[3-4]。因此,木質(zhì)素含量已成為肉根類蔬菜重要改良方向。

苯丙烷代謝是植物木質(zhì)素單體及類黃酮合成的共同途徑。4-香豆酰CoA連接酶(4-coumaroyl-CoA ligase,4CL)位于苯丙烷代謝末端,能夠催化對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸生成相應(yīng)的輔酶A酯,是木質(zhì)素和類黃酮合成的關(guān)鍵酶之一[5]。4CL氨基酸序列中存在2個保守的多肽序列-BoxⅠ(SSGTTGLPKGV)和BoxⅡ(GEICIRG),前者為AMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域,后者在催化反應(yīng)過程中的作用未知[6]。植物中的4CL多以基因家族的形式存在,不同物種間4CL基因數(shù)目差異較大,根據(jù)參與物質(zhì)合成途徑的不同,可將其分為ClassⅠ和ClassⅡ兩類,前者參與木質(zhì)素單體合成,后者主要參與類黃酮的生物合成[7]。4CL基因表達(dá)水平的變化能夠調(diào)節(jié)苯丙烷代謝及植物對逆境脅迫的響應(yīng)。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中,成員At4CL1對4CL酶活的貢獻(xiàn)較大,其功能缺失后導(dǎo)致木質(zhì)素含量降低,而At4CL3的突變會減少類黃酮的積累[8]。柑橘(Citrusclementina)4CL1的表達(dá)水平與類黃酮含量呈顯著正相關(guān)[9]。棉花(Gossypiumhirsutum)中Gh4CL7基因沉默后,木質(zhì)素含量降低20%,在擬南芥中過表達(dá)Gh4CL7后,木質(zhì)素含量提高10%,且Gh4CL7表達(dá)量的變化與植物抗旱性正相關(guān)[5]。禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)侵染后會誘導(dǎo)小麥(Triticumaestivum)4CL1的表達(dá),而棉花4CL的表達(dá)則能夠響應(yīng)鏈格孢菌(Alternariaalternata)誘導(dǎo)[10-11]。楊樹(Populusdeltoides×Populuseuramericana)木質(zhì)部導(dǎo)管中4CL的表達(dá)被抑制后,可引起木質(zhì)素含量降低,但提高了其對干旱脅迫的敏感性[12]。Wen等[13]研究表明,輕度蔭蔽脅迫能夠誘導(dǎo)大豆(Glycinemax)4CL基因的表達(dá),并提高4CL的酶活性。Xiong等[14]利用VIGS技術(shù)沉默棉花Gh4CL30基因后,引起類黃酮及木質(zhì)素含量降低,而咖啡酸和阿魏酸等物質(zhì)含量升高,并增強(qiáng)了棉花的黃萎病抗性。

胡蘿卜(Daucuscarota)屬傘形科2a生植物,其營養(yǎng)豐富,是一種廣泛種植的根用蔬菜[15]。肉質(zhì)根作為胡蘿卜可食用部位,木質(zhì)素含量過高會降低其口感及品質(zhì)[16]。胡蘿卜基因組測序的完成[17],為在全基因組水平上鑒定和挖掘木質(zhì)素代謝相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。到目前為止,胡蘿卜4CL(Dc4CL)基因家族缺乏研究。本研究擬從胡蘿卜基因組中鑒定4CL基因,分析其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系等,并利用熒光定量PCR技術(shù)對其進(jìn)行組織表達(dá)特性及脅迫響應(yīng)分析,以期為闡明4CL在胡蘿卜木質(zhì)素生物合成中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用胡蘿卜品種‘黑田五寸’為試驗材料。于2021年8月7日,將‘黑田五寸’種子播種于廊坊師范學(xué)院校內(nèi)試驗基地(河北廊坊,39°31′N,116°41′E),生長約100 d后,采集胡蘿卜葉片及肉質(zhì)根,用于分析Dc4CL基因的組織表達(dá)模式。將‘黑田五寸’種子催芽后播種于含有培養(yǎng)基質(zhì)(體積比為1∶3的蛭石和營養(yǎng)土)的塑料花盆內(nèi),置于廊坊師范學(xué)院人工氣候室,培養(yǎng)條件為:光照時長14 h/d,光照強(qiáng)度300 μmol/(m2·s),晝/夜溫度25/17 ℃。播種后50 d進(jìn)行低溫脅迫和鹽脅迫處理。將胡蘿卜幼苗轉(zhuǎn)移至4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(其他條件同前),進(jìn)行4 ℃低溫脅迫,以正常溫度培養(yǎng)作為對照。向花盆內(nèi)澆灌600 mL 200 mmol/L NaCl溶液,進(jìn)行鹽脅迫處理,以蒸餾水處理作為對照。脅迫處理12 h后采集胡蘿卜葉片,用于檢測Dc4CL基因脅迫處理后的表達(dá)情況。試驗均設(shè)3次重復(fù)。

1.2 Dc4CL基因的鑒定

研究中用到的胡蘿卜基因組、CDS、蛋白質(zhì)、GFF3等數(shù)據(jù)文件均下載自EnsemblPlants網(wǎng)站(http://plants.ensembl.org/index.html)。利用HMMER軟件,根據(jù)Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中AMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PF00501)的隱馬爾可夫模型文件在胡蘿卜蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行篩選,初步獲得Dc4CL基因。在Excel中剔除冗余序列,利用Pfam數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫中的 CD-Search工具對非冗余序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析,最終得到Dc4CL基因,根據(jù)其在染色體上的排列順序進(jìn)行命名和編號。

1.3 Dc4CL的生物信息學(xué)分析

利用在線工具ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析基因編碼蛋白的殘基數(shù)(aa)、分子質(zhì)量和等電點(diǎn);從EnsemblPlants網(wǎng)站獲取Dc4CL基因位置及所在染色體長度,利用TBtools繪制染色體定位圖[18];利用在線工具CELLO v.2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測[19];利用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP- 4.1/)進(jìn)行信號肽預(yù)測[20];利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測。

1.4 Dc4CL進(jìn)化關(guān)系及結(jié)構(gòu)分析

自EnsemblPlants網(wǎng)站下載水稻(Oryzasativa)、擬南芥、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、高粱(Sorghumbicolor)、大白菜(Brassicarapa)的4CL蛋白序列,利用CLUSTALW進(jìn)行多序列比對,并通過MEGA6基于鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹,自展值(Bootstrap)設(shè)為1 000,分析Dc4CL的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

將Dc4CL蛋白序列提交到MEME網(wǎng)站(https://meme-suite.org/meme/tools/meme),進(jìn)行保守基序motif分析,并在Pfam數(shù)據(jù)庫中對檢測到的motif進(jìn)行功能注釋。

從基因組注釋GFF3文件中提取Dc4CL的結(jié)構(gòu)信息,利用在線軟件Gene Structure Display Server(GSDS2.0)(http://gsds.gao-lab.org/) 繪制基因結(jié)構(gòu)圖[21]。

1.5 Dc4CL家族成員的表達(dá)分析

利用植物RNA提取試劑盒(天根公司,北京)分別提取胡蘿卜葉片、肉質(zhì)根及脅迫處理、對照材料的總RNA,電泳檢測RNA質(zhì)量,利用超微量分光光度計測定RNA濃度及純度。利用GoScriptTMReverse Transcription System(Promega,USA)將各材料的總RNA反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,適當(dāng)稀釋后,-20 ℃保存,備用。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫在線工具Primer-BLAST設(shè)計Dc4CL家族成員的定量引物,以胡蘿卜DcActin基因[22]作為內(nèi)參(表1),利用熒光定量PCR技術(shù)分析Dc4CL家族成員Dc4CL3、Dc4CL8、Dc4CL12的組織表達(dá)模式及脅迫響應(yīng)情況。反應(yīng)體系:2×Sybr Green qPCR Mix 10 μL,cDNA 1 μL,正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 25 s,循環(huán)40次;55.0～95.0 ℃制作熔解曲線。利用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

表1 引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜 4CL基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

在胡蘿卜基因組中共鑒定到12個4CL基因,均勻分布于除9號染色體外的其余8條染色體上(圖1),分別命名為Dc4CL1～Dc4CL12。Dc4CL基因ORF長度介于1 350～3 363 bp,編碼蛋白質(zhì)長度介于449～1 120 aa,Dc4CL蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為48.92～123.73 ku和 5.34～8.82。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明,Dc4CL在細(xì)胞內(nèi)的分布部位多樣,細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞器(線粒體、葉綠體)均有定位。信號肽及跨膜區(qū)分析結(jié)果表明,Dc4CL蛋白均不含信號肽,Dc4CL3、 Dc4CL4、Dc4CL5中均存在2個跨膜區(qū),分別位于100 aa和200～300 aa處,而在Dc4CL2和Dc4CL10中只存在1個跨膜區(qū),位于100 aa處,其余的 Dc4CL成員則不含有跨膜區(qū)(表2,圖2)。

圖1 Dc4CL基因染色體定位

表2 胡蘿卜 4CL基因基本信息

2.2 Dc4CL系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)及保守基序 分析

為了研究Dc4CL的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,利用MEGA6軟件,以來自胡蘿卜、水稻、擬南芥、二穗短柄草、高粱、大白菜的4CL蛋白序列構(gòu)建多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。該進(jìn)化樹中含有12個Dc4CL、5個Os4CL、3個At4CL、5個Bd4CL、5個Sb4CL和15個Br4CL。45個4CL蛋白可分為兩個個類群:GroupⅠ、GroupⅡ。GroupⅠ包含9個Dc4CL成員(Dc4CL1、Dc4CL2、Dc4CL3、Dc4CL4、Dc4CL5、Dc4CL6、Dc4CL7、Dc4CL10、Dc4CL11)及8個Br4CL成員;GroupⅡ包含3個Dc4CL成員(Dc4CL8、Dc4CL9、Dc4CL12)及全部的Os4CL、At4CL、Bd4CL、Sb4CL及7個Br4CL蛋白。GroupⅠ中只包含胡蘿卜及大白菜4CL蛋白成員,而GroupⅡ中4CL蛋白的物種來源豐富,既有單子葉植物,又有雙子葉植物,但Dc4CL成員較少。

為了進(jìn)一步闡明Dc4CL蛋白的保守基序及基因結(jié)構(gòu),分別利用MEME及GSDS鑒定Dc4CL中的保守基序,并繪制基因結(jié)構(gòu)圖(圖4)。結(jié)果表明,Dc4CL蛋白中存在10個motif,分別為motif1～motif10。除Dc4CL6、Dc4CL11中含有8個motif外,其余成員均含有10個motif。Motif5中包含4CL蛋白保守序列BoxⅠ(SSGTTGLPKGV),motif2中包含保守序列BoxⅡ(GEICIRG),但不同成員在這兩處的序列已發(fā)生變異。Motif1和3中分別包含催化活性位點(diǎn)-Lys-438、Gln-443、Lys-523,其中,Lys-438、Gln-443參與硫酯合成反應(yīng),而Lys-523參與半腺苷化反應(yīng)[9,23]。其余鑒定到的motif則被注釋為能夠參與AMP結(jié)合過程;不同的Dc4CL基因結(jié)構(gòu)差異明顯,均含有內(nèi)含子,外顯子數(shù)目為4～11個,其中Dc4CL2外顯子數(shù)目最少(4個),Dc4CL7外顯子數(shù)目最多(11個)。

2.3 Dc4CL家族成員的表達(dá)分析

利用熒光定量PCR技術(shù)分析Dc4CL3、Dc4CL8、Dc4CL12的組織表達(dá)模式及其對鹽脅迫和低溫脅迫的響應(yīng)情況。結(jié)果表明,Dc4CL3、Dc4CL12在胡蘿卜葉片及肉質(zhì)根中均有表達(dá),且無顯著差異,Dc4CL8則主要在葉片中表達(dá)(圖5-A～5-C);200 mmol/L NaCl溶液處理12 h后,Dc4CL3、Dc4CL12表達(dá)量下降不明顯,而Dc4CL8表達(dá)量顯著下調(diào),約為對照的31%;4 ℃處理12 h后,Dc4CL8表達(dá)量下降不顯著,而Dc4CL3、Dc4CL12表達(dá)量下調(diào),分別達(dá)到顯著和極顯著水平,約為對照的42%和23%(圖5-D～ 5-F)。

A～C. Dc4CL3、 Dc4CL8、 Dc4CL12組織表達(dá)模式分析;D～F. Dc4CL3、 Dc4CL8、 Dc4CL12脅迫響應(yīng)分析;不同的大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);不同的小寫字母分別表示差異顯著(P<0.05)

3 討 論

木質(zhì)素為植物生長發(fā)育所必需,并參與構(gòu)成膳食纖維,調(diào)理人體健康狀況,但其含量增加后,會導(dǎo)致細(xì)胞壁增厚,組織木質(zhì)化程度增高,進(jìn)而影響蔬菜作物的口感,并降低食用品質(zhì)[24-25]。木質(zhì)素的生物合成過程復(fù)雜,多種酶參與其中。4CL位于苯丙烷代謝的分支點(diǎn),是將苯丙烷代謝引入木質(zhì)素單體合成途徑的關(guān)鍵酶,在植物木質(zhì)素合成過程中具有重要作用[26]。

4CL基因家族已在毛果楊(Populustrichocarpa)[27]、水稻[28]、擬南芥[8]、柑橘[9]、水曲柳(Fraxinusmandschurica)[29]、棉花[5]及毛竹(Phyllostachysedulis)[7]等物種內(nèi)被鑒定,成員數(shù)目為3～34個。本研究從胡蘿卜基因組中共鑒定到12個Dc4CL基因,表明不同來源的4CL基因數(shù)目差異較大,這可能與不同物種在進(jìn)化過程中經(jīng)歷的染色體加倍事件有關(guān)[7]。蛋白亞細(xì)胞定位情況是研究其生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。經(jīng)預(yù)測,Dc4CL蛋白在細(xì)胞內(nèi)的存在范圍廣泛,可分布于細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞器(葉綠體、線粒體)中,棉花4CL蛋白的分布范圍亦很廣泛[5],而柑橘4CL蛋白、毛竹4CL蛋白則僅分別定位于細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體中[7,9],這可能與4CL蛋白發(fā)揮功能的場所不同有關(guān)。在后續(xù)工作中,筆者還將通過試驗手段對Dc4CL的亞細(xì)胞定位結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。蛋白質(zhì)中跨膜區(qū)的存在往往表明該蛋白為膜蛋白,且在細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞過程中可能發(fā)揮一定的作用?？缒^(qū)預(yù)測結(jié)果顯示,Dc4CL3、Dc4CL4、Dc4CL5中均存在2個跨膜區(qū),與苧麻Bn4CL3中跨膜區(qū)的數(shù)目及位置均一致[30]。序列分析表明,所有的Dc4CL蛋白均包含保守序列BoxⅠ(SSGTTGLPKGV)、BoxⅡ(GEICIRG)及3個保守的催化殘基(Lys-438、Gln-443、Lys-523),并且不同的成員在BoxⅠ、BoxⅡ處的序列有所變化,這種現(xiàn)象在毛竹、鈍鱗紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)及苧麻中均有出現(xiàn),但其對Dc4CL的催化作用是否有影響還需通過試驗進(jìn)行分析[7,30-31]。前人研究通常將4CL分為ClassⅠ和ClassⅡ兩個類群,二者在木質(zhì)素及類黃酮合成過程中發(fā)揮的作用不同且有重疊[26,32]。本試驗利用Dc4CL與其他物種的共45個4CL蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,所有蛋白亦被分為兩個類群,類群Ⅰ中含有9個Dc4CL成員,類群Ⅱ中含有3個Dc4CL成員。不過,另有研究表明4CL蛋白類群的劃分可能會受到參與建樹物種多寡的影響[8]。此外,Dc4CL的生物學(xué)功能未知,還需通過試驗進(jìn)行深入研究。

通過分析基因的表達(dá)模式,對研究其生物學(xué)功能具有重要意義[33]。4CL基因的物種來源不同,其組織表達(dá)模式亦有所不同。本研究表明,Dc4CL3、Dc4CL12在胡蘿卜葉片及肉質(zhì)根中均有表達(dá),而Dc4CL8則主要在葉片中表達(dá),推測Dc4CL8發(fā)揮功能的主要部位可能是葉片。水稻中5個4CL基因的表達(dá)在不同發(fā)育階段有差異,但組織特異性不明顯[28]。在水曲柳中鑒定到的12個4CL基因其表達(dá)具有明顯的組織特異性[29]。毛竹的15個4CL基因中,有7個成員在各組織中均能檢測到,為組成型表達(dá),另外8個成員在不同組織間的表達(dá)量差異較大,具有一定的特異性[7]。前人研究表明,植物4CL基因能夠響應(yīng)逆境脅迫[6]。Sun等[5]研究了棉花4CL基因家族在冷、熱、干旱和鹽4種脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄情況,發(fā)現(xiàn)有26個Gh4CL基因可受到一種或多種脅迫處理的誘導(dǎo)。桑樹(Morusalba)4個4CL基因(Ma4CL1～Ma4CL4)的表達(dá)可受到UV誘導(dǎo),但在NaCl脅迫后其根中Ma4CL4則下調(diào)表達(dá)[32]。低溫處理可使黃瓜(Cucumissativus)4CL基因(CsaV3_7G031620、CsaV3_7G031610)表達(dá)升高[34]。鹽脅迫處理6 h后,毛白楊(Populuspruinosa)4CL2基因表達(dá)升高,而在毛果楊中,該基因表達(dá)顯著降低[35]。同一材料的不同4CL家族成員在應(yīng)對脅迫條件時的響應(yīng)可能存在差異。如對橙子(Citrussinensis)進(jìn)行缺硼處理后,其Cs4CL1、Cs4CL2、Cs4CL3基因的表達(dá)變化情況各不相同[36]。另外,即使是同一植株的不同部位對同一脅迫條件的反應(yīng)亦可能不同。如在接種大麗輪枝菌12 h后,棉花感病品種根中Gh4CL30基因的表達(dá)量有輕微升高,而在莖中該基因的表達(dá)量降低[14]。本研究對胡蘿卜幼苗進(jìn)行了鹽脅迫和4 ℃脅迫處理,兩種處理均可使Dc4CL3、Dc4CL8、Dc4CL12的表達(dá)量降低。本研究在全基因組水平上對胡蘿卜4CL基因進(jìn)行了鑒定,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析,對胡蘿卜木質(zhì)素含量的分子調(diào)控及遺傳改良具有參考價值。