張敏敏,裴懷弟,朱天地, 陳 琛,李守強

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術(shù)研究所,蘭州 730070;2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所,蘭州 730070)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是茄科1 a生草本植物,具有營養(yǎng)豐富、適應性強、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等特點,是全世界重要的糧食作物之一[1-3]。近年來,隨著中國新型糧食戰(zhàn)略和農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的實施及馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的持續(xù)推進,中國馬鈴薯的種植面積和產(chǎn)量均大幅增加[4-5],并成為中國重要的糧、菜、飼、藥兼用作物,在保障糧食安全和社會經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[6]。

霧培馬鈴薯原原種是通過霧培法生產(chǎn)的高質(zhì)量馬鈴薯脫毒原原種,霧培法生產(chǎn)馬鈴薯原原種,具有生產(chǎn)自動化程度高、成本低、效率高的特點,近年來被廣泛應用于馬鈴薯原原種的生產(chǎn)[7],但該方法所生產(chǎn)的種薯由于長期生長在封閉保水的空間內(nèi),致使塊莖含水量高,表面皮孔較大,在采后貯藏期間極易失水、染病,影響種薯品質(zhì)[8]。因此,提高霧培馬鈴薯原原種的貯藏品質(zhì)對確保種薯質(zhì)量及馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

糖苷生物堿(Steroidal glycoalkaloids,SGAs) 作為一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物,主要存在于茄科(Solanaceae)和百合科(Liliaceae)植物中[9-12]。馬鈴薯中的SGAs也叫龍葵素,主要由α-茄堿(α-solanine)和α-卡茄堿(α-chaconine)組成,占SGAs總量的95%以上[13-16],是一種有苦味的毒性淄類生物堿。Molner等[17]和Barceloux[18]的研究表明,若按體質(zhì)量口服一定含量的SGAs會引起嚴重中毒反應甚至死亡。但正常情況下,馬鈴薯中SGAs含量非常低,不會導致人中毒,只有在馬鈴薯生長、貯存過程中發(fā)生創(chuàng)傷、發(fā)芽、蟲蛀、腐爛、干旱等脅迫或在其幼嫩組織中,SGAs會急劇增加[14,19-21]。因此,相關(guān)研究表明植物產(chǎn)生SGAs是為了抵抗外界環(huán)境中病蟲害等的侵襲,其含量與植株的抗逆性有顯著相關(guān)性[11,22]。如1980年,Sinden等[23]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯糖苷生物堿具有抵御昆蟲侵襲的作用;Dinkins等[24]、Smith等[25]證明,其不僅對蝗蟲和馬鈴薯象甲具毒性,對軟體動物蝸牛的取食也具有驅(qū)拒作用;Allen等[26]、Fewell等[27]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯糖苷生物堿具有抵御真菌侵染的作用,Andrivon等[28]進一步證明,其含量與其晚疫病和軟腐病發(fā)病率呈顯著負相關(guān);Bejarano等[14]對處在干旱脅迫條件下不灌溉處理的馬鈴薯塊莖糖苷生物堿含量進行測量,發(fā)現(xiàn)其顯著高于灌溉對照;Koffi等[20]對轉(zhuǎn)綠、發(fā)芽、腐爛的馬鈴薯糖苷生物堿含量進行測定,糖苷生物堿含量均顯著增高;Nahar等[21]的研究表明,機械損傷也能顯著提高馬鈴薯塊莖糖苷生物堿含量。因此,SGAs對提高馬鈴薯的抗逆性具有重要意義。

目前,關(guān)于馬鈴薯SGAs的研究主要集中在致毒機理、病蟲害防治、醫(yī)藥開發(fā)等方面[4,11,16],而其對種薯萌發(fā)的影響研究較少,有研究表明馬鈴薯發(fā)芽后其幼芽和芽眼部分的SGAs含量激增[29],也有研究表明馬鈴薯SGAs合成PGA1、PGA2與16DOX基因的低表達在降低龍葵素表達同時阻礙了馬鈴薯塊莖萌芽[30-31],但SGAs含量的增加對馬鈴薯萌芽的影響效果,卻鮮有報道。根據(jù)Haddadin等[32]的研究,光照時間、光照度均會影響塊莖中SGAs的含量,因此本試驗設(shè)置不同光照條件對霧培馬鈴薯原原種進行貯藏前預處理,研究光照對霧培馬鈴薯原原種SGAs含量及發(fā)芽率的影響,探究SGAs含量與薯皮綠變程度的關(guān)系,以期通過控制貯藏前預處理條件,改善種薯抗逆性品質(zhì),提高發(fā)芽率,為霧培馬鈴薯原原種的采后預處理提供科學依據(jù),并探索通過判斷原原種的薯皮綠變程度達到快速判斷種薯光照預貯處理完成情況的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇由定西馬鈴薯研究所采用霧培法生產(chǎn)的‘大西洋’馬鈴薯原原種為試驗材料,盡量保持一致的生長條件和收獲期,選擇大小一致、無破損和無腐爛的種薯。

1.2 試驗處理

根據(jù)前期研究篩選出原原種適宜的預貯溫度為20 ℃,在該溫度條件下,保持相對濕度為75%±5%。參照Yamaguchi等[33]光照度的設(shè)置并作適當調(diào)整,設(shè)定3個光照度:1 000 lx、6 000 lx、 12 000 lx,光源為功率為60 W的LED燈,同時設(shè)置黑暗預貯和室溫散射光預貯,將供試驗原原種放入上述條件的環(huán)境中,依次在第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天、第18天,分別取樣測定葉綠素(葉綠素a和葉綠素b)、SGAs糖苷生物堿(α-茄堿和α-卡茄堿)、薯皮色度(a*值)、失重率,然后將不同光照處理種薯放入3～5 ℃冷庫中貯藏,待休眠期結(jié)束后在室溫條件下進行發(fā)芽率和芽長測定(表1)。

表1 不同處理溫光設(shè)置

1.3 測定指標與方法

1.3.1 失重率 每個處理(D、S、L1、L6、L12)各隨機取30粒種薯,分別稱量記錄原始質(zhì)量,并依次與處理后第3天、第6天、第9天、第12天、第15天、第18天再稱量,計算失重率。

1.3.2 表皮葉綠素含量 參照趙世杰等[34]的方法,略有改動。準確稱取2 g樣品,加入15 mL 95%的乙醇,靜置浸提12 h,過濾到25 mL的棕色容量瓶中,使用95%乙醇洗滌濾紙及濾渣直至無綠色,濾液全部洗入容量瓶中,最后用95%乙醇定容搖勻。分別測定提取液在665 nm和649 nm下的吸光度,計算葉綠素含量。

1.3.3 表皮顏色 馬鈴薯表皮顏色測定采用CR-400色差計進行測定。每個處理隨機選取10個馬鈴薯,在每個馬鈴薯上均勻找出3個點測定表皮的L*(亮度)、a*(紅和綠)與b*(黃與藍)的值,每3天測定一次,a*值表示從綠(-a)到紅(+a),a*值越小,表示馬鈴薯表皮綠變程度越高[35]。

1.3.4 SGAs含量 用5%的乙醇作為提取劑,HPLC法進行測定,色譜條件參照肖文軍等[36]的方法。樣品提取:稱取馬鈴薯薯皮樣本約0.5 g,加入1 mL 5%的乙酸水溶液,研磨儀研磨成漿,超聲提取1 h,離心取上清,加入0.5 mL 5%乙酸水溶液復提1次,合并兩次上清液,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至堿性,正丁醇萃取3次,合并正丁醇相,氮吹吹干,甲醇定容至0.2 mL,針頭式過濾器過濾后待測。

1.3.5 發(fā)芽率和芽長 經(jīng)不同光照預貯前處理的霧培馬鈴薯原原種貯存于種薯正常環(huán)境下度過休眠期后,分別于第0天、第3天、第6天、第9天、第12天、第15天、第18天測定馬鈴薯發(fā)芽率(以塊莖第1個芽長達2 mm為發(fā)芽標準)和芽長,芽長用游標卡尺測量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS7.05、SPASS25.0和Datagraph4.6軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照處理對霧培馬鈴薯原原種預貯期失重率的影響

如圖1所示,隨著預貯處理時間的增加,不同光照處理下的霧培馬鈴薯原原種的失重率均逐漸增加;黑暗處理下(D)的種薯失重率最低,散射光(S)處理下次之,均低于其他光照組(L1、L6和L12)處理;光照處理組L1、L6和L12隨著光照增強的增加,失重率在整個處理階段基本保持L12>L6>L1的趨勢;且同一處理時期,光照組S、L1、L6、L12與黑暗組D相比均存在顯著差異 (P<0.05),而光照組之間無顯著差異。

同一時間下不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同

黑暗處理的種薯由于預貯在紙箱中,薯塊周圍的空氣流速降低,其蒸騰速率下降,能較好地保持種薯的水分,因此黑暗貯藏的種薯(D)失重率最低。光照處理中,散射光(S)失重率最低,說明相較于散射光,直射光更易促進馬鈴薯種薯失水,且光線越強失重率越高。這可能是光照增強了馬鈴薯的呼吸作用,促進了物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

2.2 不同光照處理對霧培馬鈴薯原原種預貯期間葉綠素含量的影響

如圖2所示,隨著預貯處理時間的延長,不同光照處理下(S、L1、L6、L12)種薯塊莖表皮的葉綠素含量均呈現(xiàn)上升趨勢,黑暗條件下(D)預貯的種薯表皮葉綠素含量整體趨勢變化不大,薯皮沒有發(fā)生綠化現(xiàn)象,這可能是因為黑暗條件下無法進行光合作用而產(chǎn)生葉綠素,黑暗處理的葉綠素含量比初始含量略有降低,可能是因為取樣具有隨機性的影響。

圖2 不同光照處理的霧培馬鈴薯葉綠素含量

從光照第3天開始,同一處理時期葉綠素含量均呈現(xiàn)出光照組S、L1、L6、L12大于黑暗組D的趨勢,差異顯著(P<0.05),且隨著光照度的增強葉綠素含量呈增高趨勢(D

2.3 不同光照處理對霧培馬鈴薯原原種預貯期間薯皮色度的影響

由圖3可知,隨著光照度的增大和處理時間的延長,光照處理組(L12、L6、L1)及散射光S處理組的a*值均呈下降趨勢(a*值越低綠變程度越高),薯皮綠變程度加大。預貯處理前6天,L12、L6、L1、S組的a*值均大幅度下降,與D組相比差異顯著(P<0.05);L6與L12下降幅度接近,差異性不顯著。第6天后,L6的a*值下降速度則低于L12,下降趨于平緩,但差異性仍不顯著。從整體處理過程看, L12的a*值下降幅度最大,從7.39降低至0.30,L6、L1、S組依次低于L12;黑暗處理(D)的a*值變化不明顯,預貯處理第18天,a*值始終在7.31與8.03之間浮動,但無明顯變化趨勢,這可能是因為測定a*值時種薯選擇的隨機性而導致的差異?；贚ab表色系統(tǒng)對霧培馬鈴薯薯皮色度變化進行了動態(tài)模擬,如圖4所示?？奢^為直觀地看到光照度及光照時間對霧培馬鈴薯薯皮色度變化的影響,便于對生產(chǎn)應用中的種薯薯皮色變給予更直觀的指導和判斷。

圖3 不同光照處理的霧培馬鈴薯薯皮色度a*值

圖4 不同光照處理的霧培馬鈴薯薯皮色度

2.4 不同光照處理對霧培馬鈴薯原原種預貯期間SGAs含量的影響

由圖5可知,隨著預貯光照時間的延長,所有處理組SGAs含量均為整體上升趨勢,同一處理時期,L12、L6組較其他處理組含量增加明顯,差異顯著(P<0.05);處理第6天,L12、L6組SGAs含量分別比其初期值增加了78.7%、57.8%,其他處理組SGAs增量均在35.1%以下;處理第12天,L12、L6組SGAs含量均比初始值增加約100%左右,L12組增加量略大于L6組; L1組SGAs含量在處理至第15天時,比初始值增加了108.2%;其他2個處理組S、D隨著處理時間的推進,SGAs含量均大于初期含量,且S組總體含量大于D組,但兩組直至處理結(jié)束時,SGAs含量比初始值的增加量均低于100%。

由此可見,光照度會影響種薯塊莖中SGAs的生成,且直射光的影響大于散射光,光照度越大,預貯時間越長,種薯塊莖中SGAs含量增加越多;黑暗預貯的SGAs含量增幅均低于光照處理組,但總體仍呈上升趨勢,也就是說馬鈴薯塊莖在黑暗條件下貯藏后,其SGAs含量相比貯藏前也會有所增加,這與Machado等[37]的研究結(jié)果一致。試驗期間,有些處理組種薯中的SGAs含量整體呈現(xiàn)出上升趨勢,但在有些取樣點會出現(xiàn)忽高忽低的波動現(xiàn)象,可能是由于種薯塊莖個體差異和取樣不均勻所導致的。

2.5 不同光照處理對霧培馬鈴薯原原種發(fā)芽率和芽長的影響

由圖6和圖7可知,經(jīng)不同光照度處理的霧培馬鈴薯原原種度過休眠期后,所有處理組的發(fā)芽率和芽長均隨著時間的增加而呈上升趨勢;同一觀測時間下,隨著光照度的增加,發(fā)芽率和芽長均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢。與其他處理組相比,L6處理組在所有處理中的發(fā)芽率和芽長均穩(wěn)居最高,且在發(fā)芽初期發(fā)芽率優(yōu)勢明顯,與其他處理組差異顯著(P<0.05);第9天時發(fā)芽率優(yōu)勢逐漸縮小,各處理組之間沒有明顯差異;至第9天時,L6組的發(fā)芽率達90.67%,比D組 (74.67%)、S組(78.67%)、L1組(84.67%)和L12組(75.33%)處理的發(fā)芽率分別提高 21.43%、 15.25%、7.09%和20.36%;第18天時L6組發(fā)芽率達99.33%,仍然優(yōu)于其他處理組。且同一觀測時間下,L6組的芽長均大于其他處理組,發(fā)芽第9～12天時差異性顯著(P<0.05)。說明L6組處理有利于提高霧培馬鈴薯原原種的發(fā)芽率。

圖7 不同光照處理的霧培馬鈴薯芽長

2.6 相關(guān)性分析

根據(jù)光照處理對霧培馬鈴薯種薯發(fā)芽率及芽長的影響,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同光照預貯處理下的種薯,在同一觀測時間 L6處理組的發(fā)芽率及芽長均具有較為明顯的優(yōu)勢,處理第9天,發(fā)芽率達到 90.67%,處理第18天,發(fā)芽率接近100%,顯著高于其他處理。因此在實際生產(chǎn)中可利用L6組(6 000 lx)光照對霧培馬鈴薯原原種進行預處理,以提高種薯發(fā)芽率及發(fā)芽整齊度。

為了進一步探究各指標對原原種發(fā)芽率的影響,表2對經(jīng)L6光照預處理組的霧培馬鈴薯各指標進行兩兩變量間的相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率和葉綠素含量呈極顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)0.968 (P<0.01), 發(fā)芽率和SGAs含量呈顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.845(P<0.05),葉綠素和SGAs含量呈極顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.929(P<0.01)。這說明,經(jīng)過L6條件預貯處理的霧培馬鈴薯,隨著葉綠素和SGAs含量的變化,可顯著影響其發(fā)芽率的變化,并呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢。為了進一步探究SGAs含量與葉綠素含量對發(fā)芽率的影響,表3對經(jīng)黑暗預貯處理的D組進行了相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率與葉綠素含量并無顯著相關(guān),但與SGAs含量呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.894 (P<0.01)。由此可說明,SGAs含量是影響馬鈴薯發(fā)芽率的因素之一,其與發(fā)芽率、芽長呈正相關(guān),這與霍權(quán)恭等[29]的試驗結(jié)論一致。而L6組表現(xiàn)出葉綠素含量與發(fā)芽率的正相關(guān),可能是光照在促進SGAs含量積累的過程中,也加速了葉綠素的合成。

表2 各指標間相關(guān)性分析(L6處理組)

表3 各指標間相關(guān)性分析(D處理組)

3 結(jié) 論

霧培法作為一種高效生產(chǎn)馬鈴薯脫毒微型薯的新方法,采用其方法生產(chǎn)的種薯品質(zhì)對全國馬鈴薯種薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有非常重要的作用。本試驗結(jié)果表明:①通過對各預貯處理組發(fā)芽率、芽長的觀測,發(fā)現(xiàn)各處理組霧培馬鈴薯原原種度過休眠期后,發(fā)芽率和芽長均隨著時間的增加而呈上升趨勢,但經(jīng)L6(6 000 lx)光照預貯過的霧培馬鈴薯原原種相較于其他處理組,發(fā)芽率和芽長均具有明顯優(yōu)勢,因此該條件可作為提高霧培馬鈴薯種薯發(fā)芽率、增強霧培馬鈴著種薯品質(zhì)的預貯處理條件。②對L6處理組(表2)、D處理組(表3)各指標進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),SGAs含量與霧培馬鈴薯原原種的發(fā)芽率、芽長呈顯著正相關(guān),提高SGAs含量可促進種薯發(fā)芽率和芽長的增長,由于是初步的試驗結(jié)果,今后還需做進一步的試驗驗證。同時,對比不同處理組SGAs含量和發(fā)芽率的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)D 、S、 L1 、L6、L12處理組中的SGAs總含量依次呈現(xiàn)由低到高的趨勢,同時D 、S、 L1 、L6處理組的發(fā)芽率也對應呈現(xiàn)出依次升高的趨勢,但L12組發(fā)芽率卻明顯低于L6和L1處理組,這可能是L12組預貯處理后失重率高,影響了種薯發(fā)芽率,通過表2、表3相關(guān)性分析也可發(fā)現(xiàn)發(fā)芽率與失重率呈現(xiàn)極顯著負相關(guān),這與上述推斷相符合。同時,根據(jù)王宇[38]研究不同濃度SGAs含量對種薯發(fā)芽的影響,結(jié)果表明高濃度的SGAs含量反而抑制了種薯的發(fā)芽,這也與本試驗結(jié)果相吻合。③通過設(shè)置不同光照條件對霧培馬鈴薯原原種SGAs含量和葉綠素含量的分析發(fā)現(xiàn),各處理組隨著預貯時間的延長,SGAs和葉綠素含量均呈現(xiàn)上升趨勢,但黑暗處理組的SGAs和葉綠素含量明顯低于光照處理組(S、L1、L6、L12),且直射光處理組(L1、L6、L12)的影響作用明顯強于散射光處理組(S),而直射光處理組(L1、L6、L12)也呈現(xiàn)出隨著光照度的增加,其SGAs和葉綠素含量增加趨勢越明顯。因此,在實際生產(chǎn)中可通過設(shè)置不同光照條件對種薯進行預貯處理,增加SGAs含量,以提高種薯發(fā)芽率。④根據(jù)圖4中不同光照預貯處理下薯皮色度的變化動態(tài)圖,可以直觀看出隨著光照時間、光照度的改變,薯皮色度綠變明顯,這與圖2、圖3中所測得的葉綠素含量及a*值的變化趨勢一致,且通過表2相關(guān)性分析,SGAs含量與葉綠素含量呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)0.929(P<0.01),與a*值呈顯著負相關(guān),相關(guān)系數(shù)-0.766(P< 0.05),即隨著SGAs含量的增加,種薯葉綠素含量也呈現(xiàn)出增加趨勢,綠變加強。因此,在對霧培馬鈴薯原原種進行光照預貯的實際應用中,可以參照圖4中薯皮色度綠變情況,判斷光處理效果,以達到通過薯皮綠變程度判斷SGAs含量,快速評估種薯光照預貯處理完成情況的目的。