周 鋼，馬方圓，單蓮蓮，柴冰陽，陶 虹△，嚴(yán) 華

（1. 新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830054； 2. 國家藥品監(jiān)督管理局中藥＜維藥＞質(zhì)量控制重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054； 3. 中國藥品生物制品檢定研究院，北京 100050）

尿通卡克乃其片（國藥準(zhǔn)字Z20080304，規(guī)格為每片0.5 g）為維吾爾藥制劑，由酸漿、黃瓜子、血竭、西黃蓍膠、阿拉伯膠、巴旦仁、甘草浸膏、乳香、芹菜子、阿片等組方，氣微香，味甜、微苦澀，具有止痛、利尿功效，用于尿痛、尿不凈、尿血、尿道流膿等癥的治療。阿片主要含有芐基異喹啉類和菲類生物堿［1-2］，前者主要為罌粟堿，后者包括嗎啡、可待因、蒂巴因等。阿片主要成分為嗎啡［3］，其為強(qiáng)效鎮(zhèn)痛劑［4］，但成癮性較大［5］?，F(xiàn)行尿通卡克乃其片現(xiàn)收載于《國家食品藥品監(jiān)督管理局 國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》YBZ00342008中，因干擾因素較多，無法準(zhǔn)確對嗎啡進(jìn)行定量分析。為更好地控制尿通卡克乃其片的質(zhì)量，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法［6］測定制劑中嗎啡的含量?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20A 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司），配有紫外檢測器，Labsolution 工作站；Milli - Q 型超純水儀［美國Millipore 公司，電阻率為18.2 MΩ·cm，總有機(jī)碳（TOC）不大于5 × 10-9 μg / L］；XPR205 型電子分析天平（梅特勒- 托利多儀器＜上海＞有限公司，精度為0.1 mg）；SK8210LHC 型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為35 / 53 kHz）；Centrifuge5430R 型高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司，最大工作壓力為29 bar，最大轉(zhuǎn)速為17 500 r/min）。

1.2 試藥

嗎啡對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為171201-201123，純度為97.9%）；乙腈（批號為192552），甲醇（批號為211769），均為色譜純，購自美國Fisher 公司，純度為99.9%；冰醋酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為20210810，純度不低于99.5%）；磷酸氫二鉀（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號為20140218，純度不低于99.0%）；庚烷磺酸鈉（分析純，成都市科龍化工試劑廠，批號為2017051101，純度不低于99.0%）；水為超純水，實驗室自制；尿通卡克乃其片（新疆銀朵蘭維藥股份有限公司，批號分別為181197，180847，181196，190925，181034，191142，200103，200112，1904022，1902022，嗎啡含量為0.065%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：島津Shim - pack GIST - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈- 0.05 mol/ L 磷酸氫二鉀溶液- 0.025 mol / L 庚烷磺酸鈉溶液（15∶45∶40，V/V/V）［6］；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：220 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL。供試品溶液色譜圖中，嗎啡色譜峰與相鄰色譜峰分離度為1.85，理論板數(shù)為7 122，拖尾因子為1.20，表明嗎啡和樣品中其他組分色譜峰可達(dá)到基線分離。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取嗎啡對照品20.32 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加5%冰醋酸溶液定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.397 9 mg/mL對照品貯備液；精密吸取1 mL，置5 mL容量瓶中，加5%冰醋酸溶液定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品20 片，研細(xì)，取5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加1%冰醋酸甲醇溶液25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加1%冰醋酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為5 000 r/min），取上清液，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置燒杯中蒸干，加1%冰醋酸甲醇溶液2 mL，振搖、超聲，使殘渣形成均勻混懸液，續(xù)加5%冰醋酸溶液10 mL，超聲處理10 min，轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，加少量5%冰醋酸溶液洗滌燒杯（重復(fù)2次），轉(zhuǎn)移至20 mL容量瓶中，放冷，加5%冰醋酸溶液定容，搖勻，取5 mL，離心（轉(zhuǎn)速為5 000 r/ min）10 min，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方工藝制備除阿片的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下對照品溶液、供試品溶液（批號為200103）、陰性對照品溶液各適量，分別按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，供試品溶液色譜圖中出現(xiàn)與嗎啡對照品溶液保留時間一致的色譜峰，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項下對照品貯備液1 mL，分別置2，5，10，25，50，100 mL 容量瓶中，加5%冰醋酸溶液定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為3.979，7.958，15.916，39.790，79.580，198.950 μg/ mL 的系列對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、嗎啡的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 3 578X- 43 665，r=0.999 9（n=6）。結(jié)果表明，嗎啡的質(zhì)量濃度在3.979～198.950μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測限與定量限確定：取線性關(guān)系考察項下供試品溶液，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比（S/N）為3時的質(zhì)量濃度為檢測限，以S/N為10 時的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果檢測限為1μg/mL，定量限為3μg/mL。

精密度試驗：取2.2 項下對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果嗎啡峰面積的RSD為0.88%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 時按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果嗎啡峰面積的RSD為0.32%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為200103）適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果嗎啡的平均含量為0.064%，RSD為2.09%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：分別取已知含量的樣品粉末（批號為200103）2.5 g，精密稱定，共9 份，分別置三角瓶中；取嗎啡對照品5.25，6.52，7.89 mg，精密稱定，各3份，分別置100 mL 容量瓶中，即得質(zhì)量濃度分別為0.051 40，0.063 83，0.077 24 mg/mL 的對照品溶液；精密吸取對照品溶液各25 mL，置三角瓶中，按2.2 項下方法從“稱定質(zhì)量”起制備供試品溶液，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果見表1，符合要求［7］。

表1 加樣回收試驗測定結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性試驗：取2.2 項下供試品溶液適量，分別使用不同色譜柱［島津Shim-pack GIST-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Shiseido Capcellpak C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）、Agilent Zobax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］進(jìn)樣測定，結(jié)果每片分別含嗎啡0.33，0.32，0.33 mg，表明色譜柱的耐用性良好?？疾觳煌鲃酉嘞到y(tǒng)［乙腈-0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液-0.025 mol/L庚烷磺酸鈉溶液（20∶40∶40，V/V/V），甲醇-0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液-0.025 mol/L庚烷磺酸鈉溶液（40∶30∶30，V/V/V）］［8］和不同柱溫（20～40 ℃）對樣品中嗎啡含量的影響，結(jié)果供試品溶液色譜峰保留時間與嗎啡對照品溶液色譜峰保留時間一致，拖尾因子與分離度均符合要求。

2.4 樣品含量測定

分別取10 批樣品粉末5 g，各2 批次，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件平行進(jìn)樣測定2次，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果10批樣品中嗎啡的平均含量為每片0.32 mg，詳見表2。

表2 10批樣品中嗎啡含量測定結(jié)果Tab.2 Results of the content determination of morphine in 10 batches of samples

3 討論

3.1 提取方法考察

尿通卡克乃其片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中阿片的含量測定項下存在以下問題：1）原標(biāo)準(zhǔn)中使用甲醇溶解嗎啡對照品，穩(wěn)定性較差，嗎啡的峰面積隨時間的延長而逐漸減?。?-10］；2）使用高效液相色譜法分析供試品溶液，發(fā)現(xiàn)其他雜質(zhì)峰對主峰干擾嚴(yán)重，使檢測值嚴(yán)重失真。2020 年版《中國藥典（二部）》阿片含量測定項下［11］，經(jīng)固相萃取柱提純樣品后使用高效液相色譜法測定，提取過程中雜質(zhì)干擾較小，試驗可順利進(jìn)行，但對尿通卡克乃其片中嗎啡的提取無借鑒意義。

阿片在尿通卡克乃其片中占1%，嗎啡在阿片中含量約為10%，在處方中約占0.1%。方中，樹脂類藥材總占比達(dá)40%以上，其中阿拉伯膠、西黃蓍膠為水溶性樹脂［12］，乳香、血竭為脂溶性樹脂，導(dǎo)致樣品成分復(fù)雜，用含水的溶劑提取會形成均勻的乳濁液，用濾頭過濾后仍無法消除。嗎啡在日光下和空氣中放置會逐漸氧化變性，在常規(guī)溶液中不穩(wěn)定，而在酸性溶液中較穩(wěn)定且溶解度極好。故本研究中采用1%冰醋酸甲醇溶液提取樣品，去除大多數(shù)阿拉伯膠和西黃蓍膠后，蒸干，先用少量1%冰醋酸甲醇溶液振搖、超聲，使殘渣形成均勻混懸液，續(xù)加5%冰醋酸溶液提取、定容。絕大部分乳香和血竭以沉淀形式析出，經(jīng)離心、過濾后，得到供試品溶液［13-15］。

預(yù)試驗中采用2 種方法考察提取過程中放置溶劑的蒸發(fā)皿對提取結(jié)果的影響。方法1：蒸干后殘渣加1%冰醋酸甲醇3 mL，超聲振蕩形成均勻混懸液，再加5%冰醋酸溶液提取；方法2：蒸干后殘渣直接加5%冰醋酸溶液提取。結(jié)果表明，方法1 所得嗎啡含量高于方法2，原因為脂溶性成分和器具表面結(jié)合成一層疏水膜，冰醋酸溶液無法有效進(jìn)入而提取嗎啡。故最終確定2.2項下供試品溶液提取方法。

3.2 提取時間考察

取樣品（批號為200103）研細(xì)，取粉末5 g，精密稱定，共3 份，分別置三角瓶中，精密加入1%冰醋酸甲醇溶液25 mL，分別考察超聲提取20，30，40 min 對提取結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，超聲提取30 min 時嗎啡含量最高，與提取40 min 的結(jié)果基本一致；提取20 min 的結(jié)果稍低，可能由于制劑中樹脂占比大，影響嗎啡的溶解速率。故最終確定提取時間為30 min。

3.3 檢測結(jié)果偏高原因分析

制備供試品溶液時，溶液中存在較多血竭和乳香，影響定容，沉淀物占據(jù)容量瓶一定體積導(dǎo)致分析結(jié)果略偏高，可通過擴(kuò)大稀釋倍數(shù)減輕此影響。

3.3 制劑成癮性分析

成人口服給藥途徑嗎啡攝入量一般為每次5～15 mg，每天15～60 mg；極量為單次不得過30 mg，每日不得過100 mg。該制劑服用量為每次3～5片，每天2次，最大單次攝入量約為1.6 mg，每日最大攝入量約為3.2 mg，遠(yuǎn)低于嗎啡的常規(guī)使用劑量，不會產(chǎn)生成癮性。

3.4 方法評價

該方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于尿通卡克乃其片中嗎啡的含量測定。