梅書豪,邢玉,劉璐,王鵬遠

(許昌市中心醫(yī)院 a.血液內(nèi)科;b.腫瘤科,河南 許昌 461000)

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes,MDS)以細胞分化、形態(tài)異常、血細胞減少為主要特征,是一種異質(zhì)性造血疾病,具有進展轉(zhuǎn)化為急性白血病的高風險[1]。依國際預后評分系統(tǒng)(the international prognostic scoring system,IPSS)危險度,臨床MDS治療過程中,針對低危患者往往以支持療法為主,并給予免疫調(diào)節(jié)輔助;針對高?；颊?則給予傳統(tǒng)療法聯(lián)合化療或干細胞移植,達到多克隆造血重建、有效延長患者生存期的目的[2]。然而,雖然干細胞移植是目前為止MDS治愈唯一方法,但受年齡、配型等諸多限制,多數(shù)患者均無接受此項治療的機會。近年來,MDS疾病發(fā)生發(fā)展過程中DNA甲基化異常發(fā)揮的關(guān)鍵性作用愈發(fā)受到關(guān)注,與此同時去甲基化治療也成為臨床研究熱點之一。地西他濱為5-氮雜-2’-脫氧胞嘧啶核苷,具雙重作用機制,高濃度時表現(xiàn)出細胞毒性作用,而低濃度時則可發(fā)揮腫瘤胞嘧啶替代作用,使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶失活,加強抑癌基因表達,達到抗腫瘤的目的[3]。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)是葉酸代謝限速酶,催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸,前者參與DNA合成修復,后者則是機體主要甲基供體,參與DNA甲基化過程。MTHFR對于DNA合成、活化、修復具有重要調(diào)控作用[4]。本研究分析MDS患者療效的影響因素,探討MTHFR基因多態(tài)性與疾病療效的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2020年2月至2022年6月許昌市中心醫(yī)院收治的82例中高危MDS患者,均接受地西他濱治療。其中男49例,女33例;年齡34～78歲,平均(58.14±9.77)歲;其中難治性貧血(refractory anemia,RA)3例,難治性血細胞減少伴多系發(fā)育異常(refractory cytopenia with multilineage dysplasia,RCMD)37例,難治性貧血伴原始細胞增多(refractory anemia with excess blasts,RAEB)1型與2型分別18、24例;IPSS危險分級中危1者39例,中危2者19例,高危者24例。

1.2 納入與排除標準

納入標準:(1)符合《血液病診斷及療效標準》[5]MDS診斷標準;(2)符合IPSS危險分層中高危診斷;(3)年齡≥18歲;(4)患者和家屬簽署知情同意書。排除標準:(1)合并其他部位惡性腫瘤;(2)合并嚴重器質(zhì)性疾病;(3)入組前接受過放化療治療;(4)3個月內(nèi)使用過細胞毒性類藥物或激素類藥物;(5)合并傳染性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.3 方法

1.3.1治療方法

所有患者均接受止吐、護胃、保肝等常規(guī)支持治療,并接受地西他濱(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司,國藥準字H20120067)治療,給藥劑量為每日20 mg·m-2,微量泵泵注,1 h泵注完畢,第1～5天不間斷給藥,每28日為1個周期,持續(xù)治療4個周期。

1.3.2一般資料收集

收集患者入院時基礎資料,包括性別、年齡、疾病分型、IPSS危險分級、7號染色體異常、粒細胞缺乏、貧血情況以及血紅蛋白、血細胞計數(shù)水平等。

1.3.3基因多態(tài)性檢測方法

患者入院后采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性法檢測MTHFR基因位點多態(tài)性。抽取患者靜脈血4 mL,提取樣本基因組(血液基因組提取試劑盒:貝克曼,AMPurea XPDNA),以雙蒸水溶解,檢測純度,-80 ℃保存,引物合成由蘇州泓迅生物科技有限公司?；蛭稽c:rs1801131上游5’-CTGTGCTGTGCTGTTGGAAG -3’,下游5’-ACGATGGGGCAAGTGATG-3’;rs1801133上游5’-TCCTCTTCCCCTGCCTTTG -3’,下游5’-CCACTCCAGCATCACTCACTTT -3’。應用Sequenom MassAR-RAY 技術(shù)分型。目的基因擴增:取基因組DNA,加入96孔板,取DNA(5 ng )、引物(2.5 pmol)、Taq聚合酶(0.1 U) 、10 mmol·L-1dNTP(0.5 μL)。PCR擴增:96 ℃ 15 min,96 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,76 ℃ 45 s,循環(huán)40次,76 ℃ 5 min。SAP反應:去除剩余dNTP,36 ℃ 40 min,86 ℃ 5 min。單堿基延伸:延伸引物(5.4 pmol)、混合物l dNTP、ddNTP(50 μmol )、DNA聚合酶(0.5 U) ,96 ℃ 2 min,96 ℃ 5 s,56 ℃ 5 s,76 ℃ 5 s,循環(huán)35次,74 ℃ 3 min。樹脂脫鹽,轉(zhuǎn)移至芯片檢測。

1.4 療效評估方法

參照《骨髓增生異常綜合征診斷與治療中國專家共識(2014年版)》[6]評估療效。(1)完全緩解:骨髓系細胞成熟正常,原始細胞≤5%,允許血細胞異常發(fā)育;外周血血紅蛋白、中性粒細胞絕對值、血小板計數(shù)水平分別在110 g·L-1、1.0×109L-1、100×109L-1及以上,原始細胞消失。(2)部分緩解:與治療前相比,骨髓原始細胞減少幅度達到50%及以上,但仍超過5%;外周血同完全緩解。(3)骨髓完全緩解:與治療前相比,骨髓原始細胞減少幅度超過50%且≤5%;外周血若達血液學改善,需予注明。(4)血液學改善(療效維持8周及以上):與治療前相比紅細胞的輸注減少,血紅蛋白升高達15 g·L-1及以上;對于治療前血小板水平在20×109L-1及以上者,凈增值需達30×109L-1及以上,治療前水平在20×109L-1以下者,增高達20×109L-1以上且與治療前相比增高值至少增達100%。(5)疾病穩(wěn)定:未達部分緩解標準,疾病無進展維持8周以上。(6)治療失敗:治療過程中疾病出現(xiàn)進展甚至死亡。治療有效為完全緩解、骨髓完全緩解、部分緩解、血液學改善之和。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以例數(shù)和百分數(shù)[n(%)]表示,組間通過χ2檢驗比較,通過logistic分析MDS患者療效的危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 有效組與無效組一般資料

有效組與無效組性別、年齡、疾病分型、IPSS危險分級、血紅蛋白水平及是否粒細胞缺乏、重度貧血比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);7號染色體異常、血小板計數(shù)≥100×109L-1患者治療有效率高于7號染色體無異常、血小板計數(shù)<100×109L-1患者(P<0.05)。見表1。

2.2 有效組與無效組患者MTHFR基因型以及基因頻率分布

有效組與無效組MTHFR基因rs1801133位點基因型及等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);有效組MTHFR基因rs1801131位點CC基因型以及C頻率低于無效組(P<0.05)。見表2。

表2 有效組與無效組MTHFR基因型以及基因頻率分布

2.3 影響療效的危險因素分析

將上述差異有統(tǒng)計學意義項作為自變量并進行賦值,7號染色體異常(否=0,是=1)、血小板計數(shù)水平(<100×109L-1=0,≥100×109L-1=1)、MTHFR-rs1801131(A/C)(AA或AC型=0,CC型=1)。logistic回歸分析結(jié)果顯示7號染色體異常、血小板計數(shù)≥100×109L-1的MDS患者治療有效率更高,MTHFR基因rs1801131位點CC基因型是療效不佳的危險基因型,OR=1.508(95% CI:1.111～2.048)。見表3。

表3 影響MDS患者療效的相關(guān)因素分析

3 討論

研究顯示,臨床MDS發(fā)病率達3/10萬～5/10萬,老年人群中達20/10萬～50/10萬,是常見的惡性血液病之一,病因尚不十分明確,可能與烷化劑、有機毒物、放射線暴露等有關(guān)[7]。

作為去甲基化藥物,地西他濱可抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,重新激活抑癌基因,誘導腫瘤細胞凋亡,促使其向正常細胞分化,延緩急性白血病轉(zhuǎn)化[8]。腫瘤細胞內(nèi),地西他濱被磷酸化后與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ結(jié)合,抑制胞嘧啶甲基化,激活沉默的抑癌基因,促進造血細胞分化。在中國上市后,關(guān)于地西他濱應用于MDS中療效的報道相繼出現(xiàn)。Ma等[9]回顧性分析87例MDS地西他濱治療患者,中位治療4個療程后,治療有效率達58.6%;Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn)中高危MDS患者經(jīng)地西他濱治療后的總有效率達62.5%。本研究將地西他濱應用于中高危MDS患者的臨床治療中,有效率達到71.95%,略高于上述研究結(jié)果[10],這可能與納入患者基線資料以及用藥療程等存在差異有關(guān)。IPSS危險分級是目前應用廣泛的MDS預后評估方法,且中低危患者生存期長于高?；颊摺iu等[11]研究中治療有效與無效的MDS患者IPSS危險分級比較無明顯差異,并認為中低?；颊卟⒉槐雀呶；颊吒椎玫郊膊【徑?而是與反應維持時間有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,IPSS分級對患者療效無顯著影響。7號染色體異常是MDS預后不良危險因素之一,然而研究證實,7號染色體異常者往往對于地西他濱治療獲益更大[12]。本研究也顯示7號染色體異常者可獲得更高的治療有效率,與上述研究結(jié)果[12]一致,這可能是由于7號染色體長臂7q22、7q34-q36區(qū)域含2個腫瘤抑制基因,并與去甲基化藥物耐藥性有關(guān)。既往研究顯示,血小板反應是MDS患者臨床地西他濱反應獲得的重要預測指標之一[13]。本研究也顯示血小板計數(shù)大于100×109L-1的患者可獲得更高的治療有效率,與上述研究結(jié)果[13]一致。

MTHFR基因位于1p36.3染色體,具有外顯子11個,可將5,10-亞甲基四氫葉酸還原轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸,在DNA修復與甲基化中發(fā)揮重要作用。5-亞甲基四氨葉酸可轉(zhuǎn)化為S-腺普甲硫氨酸,S-腺普甲硫氨酸為DNA甲基化甲基來源。MTHFR基因rs1801131、rs1801133位點為該基因常見突變位點。既往相關(guān)研究顯示MTHFR基因rs1801131位點突變是直腸癌RO切除術(shù)后輔助化療預后不良的獨立危險因素[14]。本研究中rs1801131位點CC基因型是MDS患者療效不佳的獨立危險因素之一,CC基因型患者療效不佳風險是AA及AC基因型患者的1.508倍,rs1801131位點A向C突變可使丙氨酸替代谷氨酸,CC基因型酶活性僅為AA型的40%,從而引起S-腺普甲硫氨酸與葉酸缺乏,導致DNA甲基化受阻,影響地西他濱藥物利用率。白小紅等[15]研究顯示rs1801133位點的基因多態(tài)性與兒童急性淋巴細胞白血病臨床療效無關(guān),但與患者化療相關(guān)不良反應相關(guān)。本研究結(jié)果顯示有效組與無效組rs1801133位點基因多態(tài)性比較無明顯差異。本研究不足之處在于未排除種族等混雜因素,研究結(jié)果不能擴展到本域外,同時未對患者不良反應、生存期等資料行進一步分析,后續(xù)將擴大樣本量作進一步研究。

4 結(jié)論

7號染色體異常、血小板計數(shù)≥100×109L-1的MDS患者接受地西他濱治療的有效率較高,MTHFR基因rs1801131位點CC基因型是療效不佳的危險基因型。