李銘銘,羅云梅,李映瑩,謝笑龍,2a,2b

(1.遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院/遵義市第一人民醫(yī)院 藥劑科,貴州 遵義 563000;2.遵義醫(yī)科大學 a.基礎藥理教育部重點實驗室/特色民族藥國際合作聯(lián)合實驗室;b.貴州省基礎藥理重點實驗室;c.藥學院,貴州 遵義 563000)

血小板是骨髓巨核細胞質脫落下來的小塊,是血液循環(huán)中的無細胞核顆粒,主要參與機體的止血活動和血栓形成[1-2]。在正常生理條件下,血小板以無活性形式在血液中循環(huán),內皮細胞的缺損以及凝血級聯(lián)反應會誘導血小板的激活,促進血小板顆粒內容物的釋放,如五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、血小板因子4(platelet factor 4,PF4)和血栓素2(thromboxane 2,TXA2)等,并互相黏附成聚集物,進一步促進血小板的活化[3]。血小板聚集及血栓形成參與了多種心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展,如動脈粥樣硬化、腦梗死和外周血管疾病,在這些疾病中,血小板活化引起的動脈栓塞可致殘或致死[4-5]。因此,發(fā)現(xiàn)有效的抗血小板藥并探究其作用機制具有重要的臨床意義。

異鉤藤堿(isorhynchophylline,Isorhy)是從鉤藤中提得的一種生物堿,有降壓、擴張血管、緩解肺纖維化及減慢心率等作用[6-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)Isorhy具有抗血小板聚集及抗血栓形成作用[9-10]。而Isorhy對血小板5-HT及PF4釋放、對MDA生成以及對血小板解聚作用的影響尚不清楚。本研究通過體外實驗進一步探討Isorhy抗血小板聚集可能的機制,為尋找新的抗血小板藥物提供基礎藥理實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑和儀器

雄性家兔,體重2.0～3.0 kg,由遵義醫(yī)科大學實驗動物中心提供。動物實驗經(jīng)遵義醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會審查批準(批準號[2018]2-128)。 Isorhy購于廣西東蘭制藥廠,純度>97%;鄰苯二甲醛,半胱氨酸及Triton X-100購自中國醫(yī)藥集團化學有限公司;阿司匹林(acetylsalicylic acid,ASA)、凝血酶、膠原、花生四烯酸及5-HT購自Sigma公司;MDA檢測試劑盒購自南京建成責任有限公司。熒光分光光度計,島津公司產品,型號RF-5000;血小板聚集儀,普利生公司產品,型號LBY-NJ4;可見分光光度計,上海申化儀表自控公司產品,型號721。

1.2 方法

1.2.1血小板血漿制備

健康家兔,使用普魯卡因(5 mg·kg-1)局部麻醉,頸動脈采血,參照劉炎東等[11]的方法加入50 g·L-1枸櫞酸鈉抗凝(血液∶抗凝劑=9∶1),1 000 r·min-1離心5 min,離心半徑為15 cm,分離富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP),剩余血漿再3 000 r·min-1離心10 min,離心半徑為15 cm,分離貧血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP)。用PPP調整血小板計數(shù)為400×109L-1,37 ℃靜置1 h后將血小板計數(shù)為400×109L-1的血漿分為對照組、Isorhy低(0.33 mmol·L-1)、中(0.65 mmol·L-1)、高(1.30 mmol·L-1)劑量組(L、M、H)和陽性藥ASA(1.69 mmol·L-1)組。

1.2.2血小板聚集儀檢測血小板聚集率

取血小板計數(shù)為400×109L-1的血漿 220 μL,分別加入5 μL異鉤藤堿和ASA母液,使低、中、高終濃度分別為0.33、0.65、1.30 mmol·L-1,ASA終濃度為1.69 mmol·L-1。對照組加入5 μL生理鹽水,37 ℃恒溫孵育5 min,測定時分別加入誘導劑膠原(終濃度60 mg·L-1)和凝血酶(終濃度0.35 mmol·L-1)測定血小板聚集率,與周宙等[12]方法一致。

1.2.3熒光分光光度計檢測5-HT的釋放

分別取0.4 mL PPP和PRP及血小板已聚集的PPP與0.1 mL 5 g·L-1Triton X-100混合,隨后加入3 mL酸性正丁醇,將混合液振搖,離心,1 200g,5 min。取有機相2.5 mL,加入正庚烷5 mL,0.1%半胱氨酸1 mL,振蕩混勻,1 200g離心5 min,棄去有機相,3 mL 0.04 g·L-1鄰苯二甲醛加到由10 mol·L-1HCl組成的0.5 mL水相,然后水浴加熱15 min。液體冷卻后以熒光分光光度計測定熒光強度值(激發(fā)波長365 nm,發(fā)射波長480 nm)。5-HT含量=PPP熒光值/標準管熒光值×樣品量×1/0.9。

1.2.4記錄膠原作用后PF4的生成

將50 μL不同濃度的Isorhy加入0.5 mL PRP中,5 min后加入膠原(終濃度為40 mg·L-1)終止反應,混合液冷卻后170g離心10 min,取0.1 mL上清PPP,加入肝素(0.6 U·mL-1)0.1 mL,20 s后加0.1 mL凝血酶,使終濃度為3 kU·L-1,記錄肝素凝血酶凝固時間(heparin thrombin coagulation time,HTCT)。

1.2.5硫代巴比妥法檢測MDA的生成

在試管內加入200 μL PRP,然后分別加入Isorhy和ASA使終濃度分別為0.33、0.65、1.30 mmol·L-1(Isorhy)、1.69 mmol·L-1(ASA)。對照組加入生理鹽水。所有樣本置37 ℃水浴,2 min。加入凝血酶使終濃度達到10 kU·L-1。樣品加入后37 ℃反應5 min,以冰冷的三氯乙酸和鹽酸終止反應。冰鹽浴30 min后1 200g離心15 min。取0.15 mL上清液,以可見分光光度計測定532 nm處吸光度值。

1.2.6血小板聚集儀檢測血小板解聚率

取290 μL PRP,加入5 μL凝血酶,使終濃度為3 U·mL-1。生理鹽水組為對照,以Born氏比濁法測定血小板聚集率。在血小板聚集達峰值時, 加入10 μL Isorhy,使終濃度依次分別為0.33、0.65和1.30 mmol·L-1,記錄30 min的血小板聚集率。血小板解聚率=(血小板解聚峰值—給藥組聚集率)/血小板解聚峰值。

1.2.7統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Isorhy對血小板聚集的影響

本實驗采用了膠原和凝血酶2種不同的誘導劑建立血小板聚集模型,結果顯示,Isorhy低劑量0.33 mmol·L-1、中劑量0.65 mmol·L-1和高劑量1.30 mmol·L-1在2種模型中血小板聚集率均小于對照組(P<0.05),并呈現(xiàn)濃度劑量依賴性,與ASA具有相似的效應。見圖1。

A為Isorhy對膠原誘導的血小板聚集的影響;B為Isorhy對凝血酶誘導的血小板聚集的影響;與對照組比較,*P<0.05。

2.2 Isorhy對膠原誘導的血小板5-HT釋放的影響

以膠原(50 mg·L-1)誘發(fā)血小板聚集,測定上清液5-HT含量。結果顯示Isorhy中劑量0.65 mmol·L-1和高劑量1.30 mmol·L-1濃度依賴性地抑制血小板5-HT釋放(P<0.05),與ASA具有相似的效應。見圖2。

與對照組比較,*P<0.05。

2.3 Isorhy對HTCT的影響

以膠原(50 mg·L-1)誘導血小板聚集后,測量HTCT。Isorhy低劑量0.33 mmol·L-1、中劑量0.65 mmol·L-1和高劑量1.30 mmol·L-1濃度依賴性地延長HTCT(P<0.05),與ASA具有相似的效應。見圖3。

與對照組比較,*P<0.05。

2.4 Isorhy對凝血酶誘導血小板MDA生成的影響

Isorhy低劑量0.33 mmol·L-1、中劑量0.65 mmol·L-1和高劑量1.30 mmol·L-1濃度依賴性地抑制血小板MDA生成(P<0.05),與ASA具有相似的效應。見圖4。

與對照組比較,*P<0.05。

2.5 Isorhy對血小板解聚的影響

Isorhy 中劑量0.65 mmol·L-1和高劑量1.30 mmol·L-1濃度依賴性地升高血小板解聚率(P<0.05),與ASA具有相似的效應。見圖5。

與對照組比較,*P<0.05。

3 討論

血小板聚集是指血小板與血小板之間相互黏著,是血小板的生理特性之一,多種因素可刺激靜息血小板活化并聚集,促進血栓的形成,是血液循環(huán)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的重要因素,因此,篩選抗血小板聚集的藥物對血液循環(huán)系統(tǒng)疾病的治療具有重要意義。本實驗采用60 mg·L-1膠原和0.35 mmol·L-1凝血酶在體外建立家兔血小板聚集模型,并觀察Isorhy對血小板聚集的影響,結果顯示,Isorhy在0.33～1.30 mmol·L-1濃度范圍內能夠劑量依賴性地抑制凝血酶和膠原誘導的血小板聚集,說明Isorhy具有較好的抗血小板的作用,是一種對血液循環(huán)系統(tǒng)疾病具有治療潛力的藥物。

5-HT是血小板受到刺激后從致密體釋放的主要物質之一,能夠與血小板上的5-HT2A受體結合,改變血小板的表面構型,使血小板與其他刺激劑如內皮素、血栓素2和血管緊張素Ⅱ等的受體暴露,增強了血小板反應性,促進血小板的活化和聚集。5-HT還參與了血管收縮舒張以及細胞增殖遷移等過程,在動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變和肺動脈高壓等疾病中扮演重要角色,抑制5-HT的釋放對緩解以上疾病的病理狀態(tài)有積極作用[13-15]。本實驗觀察了Isorhy對膠原誘導的血小板聚集模型5-HT的釋放,發(fā)現(xiàn)0.65和1.30 mmol·L-1Isorhy能夠有效降低5-HT的釋放,其變化趨勢與Isorhy抑制血小板聚集變化趨勢一致,這說明Isorhy能夠通過減少5-HT的釋放抑制血小板的聚集活化。有文獻報道,凝血酶能夠激活血小板,促進花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的釋放,AA作為MDA合成的前體,其含量的增加可導致MDA合成增加[16],因此,檢測MDA的含量可間接反映血小板的活化程度,MDA也是體現(xiàn)機體氧化應激水平的指標之一,MDA含量的減少提示機體氧化應激水平下調。本研究在體外檢測了Isorhy對凝血酶誘導的家兔血小板聚集模型MDA的釋放,結果顯示Isorhy低、中、高濃度均能降低MDA的含量,并呈現(xiàn)濃度依賴性,說明Isorhy能夠抑制血小板的活化,具有降低機體氧化應激水平的潛力。PF4是血小板活化后從α顆粒釋放的一種蛋白質,具有中和肝素縮短凝血時間的作用,測定HTCT能夠間接反映血漿中PF4的含量,同時反映血小板的功能狀態(tài),HTCT與PF4含量呈負相關[17-18]。本研究在檢測Isorhy對HTCT的影響時觀察到,Isorhy能夠濃度依賴性地增加HTCT,提示,Isorhy能夠劑量依賴性地減少血漿中PF4的含量,進一步說明Isorhy能夠抑制血小板的激活。并且中,高濃度組效果優(yōu)于臨床現(xiàn)有的抗血小板藥ASA。

血小板的聚集與解聚是2個結果相反的生理過程,解聚是指血小板從聚集狀態(tài)到游離狀態(tài)的過程,促進血小板的解聚能夠緩解血栓的形成,對血管栓塞性疾病具有重要意義。本實驗采用凝血酶促進血小板的聚集,在聚集達高峰值時加入Isorhy,觀察Isorhy對血小板解聚的影響,結果證明Isorhy能夠增大血小板的解聚率,說明Isorhy能夠促進血小板的解聚,阻止血小板的聚集活化。

4 結論

Isorhy在0.33～1.3 mmol·L-1濃度范圍內能夠通過降低5-HT、MDA和PF4的釋放發(fā)揮抗血小板聚集活化的作用,可見將Isorhy開發(fā)為新的抗血小板藥具有較好的前景。