羅可 王珞 劉輝

摘要 研究選取大豆FAD2-1A和FAD2-1B基因為靶標，使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構建靶點的基因敲除載體，并利用發(fā)根農桿菌K599的特性侵染大豆植株，以獲取不定根，通過對不定根的DNA提取和PCR測序鑒定，發(fā)現(xiàn)靶點前的序列峰圖平穩(wěn)且準確，在靶點處開始出現(xiàn)雜亂的套峰，表明大豆FAD2-1A與FAD2-1B2個基因均被成功編輯。此方法操作簡單、實驗周期較短，實現(xiàn)了對大豆中選擇靶點的可行性的快速鑒定，為研究大豆的FAD2基因功能和遺傳改良方面提供了新的技術支持。

關鍵詞 CRISPR/Cas9；大豆；發(fā)根農桿菌；基因編輯

中圖分類號：S565.1 文獻標識碼：B 文章編號：2095–3305（2023）07–0056-03

大豆是世界上主要的油料作物之一，能夠為人類和動物提供豐富的蛋白質和油脂[1]。隨著大豆基因組測序工作的完成，以及基因組學、生物技術的快速發(fā)展，從基因層面通過分子育種從而培育新的大豆品種成為重要的研究方向。

基因組編輯技術又被稱為靶標基因工程，它通過編輯特定的基因、敲除基因、引起特異位點突變等方式修飾基因，是研究植物基因功能的重要方法之一[2]。種子中的油脂和蛋白質含量是油料作物大豆品質的重要評價標準[3]，利用基因編輯技術對大豆相關基因進行靶向修飾，通過研究大豆中油脂和蛋白質合成途徑相關功能基因，可進一步培育得到高油酸、高品質的大豆。近年來，盡管基因組編輯技術在大豆中得到了迅速應用，然而相對于水稻、擬南芥等植物的研究，大豆基因編輯技術的應用仍處于發(fā)展緩慢階段。

CRISPR/Cas9技術在大豆的應用有以下問題面臨解決：首先，適合大豆基因編輯技術的系統(tǒng)研究發(fā)展緩慢，大豆整體基因編輯效率維持在10%左右，與基因編輯效率達到80%的水稻等植物相比，存在著巨大差距[4]。不僅如此，大豆遺傳轉化效率低會影響陽性編輯體的植物的獲得；目前大多都采用農桿菌介導的大豆遺傳轉化體系，雖該體系經過改良和優(yōu)化，但遺傳轉化率仍不理想，也大大降低了基因編輯技術在大豆改良上的進一步應用。因此，在遺傳轉化前驗證基因功能編輯靶點的可行性顯得尤為重要。

發(fā)根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）是一種革蘭氏陰性的土壤桿菌，屬于根瘤菌科[5]，在其侵染植株后，能夠誘導植株產生大量高度分支的不定根。本研究利用CRISPR/Cas9技術構建了用于敲除大豆基因的載體，并通過發(fā)根農桿菌介導的方法使大豆產生不定根，以驗證FAD2基因上編輯靶點的可行性，為大豆基因組編輯和基因功能的驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

植物材料大豆品種為黑河43，基因編輯載體PBSE401與中間載體購自BIOSCI生物公司；大腸桿菌E.coli DH5α購自Biomed 生物公司，發(fā)根農桿菌K599購自上海唯地生物技術有限公司。DNA純化回收試劑盒和質粒提取試劑盒（TIANGEN生物公司）；Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；限制性內切酶BsaⅠ、T4 DNA Ligase購于New England Biolabs（NEB）有限公司；DNA提取試劑盒、引物合成及測序來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 靶點選擇 通過CRISPR靶點序列在線設計工具CRISPOR設計FAD2-1A、FAD2-1B基因的敲除靶點，該工具能夠在輸入序列中找出所有的CRISPR/Cas9靶位點，基于GC含量與二級結構最終選取靶點T3與T28設計sgRNA，sgRNA擴增引物及鑒定引物詳見表1。

1.2.2 載體構建 根據(jù)Geneious軟件設計的sgRNA序列，以PCBC載體為模板，擴增目的片段，PCR反應體系50 μL：5×Phanta Buffer 10 μL、dNTP 1 μL、FAD2-DT1-BsF 2 μL、FAD2-DT1-F0 0.5 μL、FAD2-DT2-BsR 0.5 μL、FAD2-DT2-R0 2 μL、Phanta 1μL、ddH2O 32 μL、共計50 μL。反應程序：95 ℃ 3 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 40 s、從第2步起循環(huán)35次、72 ℃ 5 min。將帶有T3、T28的 sgRNA的靶點片段最后進行 Golden Gate 反應，體系5 μL：PBSE401 2 μL、PCR回收片段1 μL、10×BSA 0.5 μL、T4 DNA Ligase Buffer 0.5 μL、T4 DNA Ligase 0.5 μL、BsaⅠ0.5 μL，共計5 μL。最后采用T7酶切檢測法，對靶點編輯情況進行初步驗證。

1.2.3 發(fā)根農桿菌K599介導大豆遺傳轉化 本實驗采用黑河43大豆材料，參考已有的大豆不定根誘導方法，利用發(fā)根農桿菌K599，通過注射誘導大豆不定根，發(fā)根后，使用試劑盒提取不定根樣品DNA，用引物對靶點附近的序列進行PCR擴增，將擴增的目的片段進行回收測序，以驗證分析靶點處是否出現(xiàn)基因編輯。

2 結果與分析

2.1 敲除載體的構建

大豆的脂肪酸去飽和酶2（FAD2）決定了大豆油中單不飽和脂肪酸的水平，能夠催化單不飽和脂肪酸—油酸轉化為多不飽和脂肪酸—亞油酸。大豆FAD2基因家族由多個基因組成，其中FAD2-1A和FAD2-1B主要在發(fā)育的種子中表達，可能影響大豆油中的油酸水平。研究表明，F(xiàn)AD2-1A和FAD2-1B的敲除能夠顯著提升油酸含量，降低亞油酸含量[6]。FAD2-1A和FAD2-1B均只含2個外顯子，編碼388個氨基酸，其CDS序列同源性高達94.9%（圖1A）。

通過查找cDNA序列上的PAM位點發(fā)現(xiàn)：能夠共同靶向FAD2-1A和FAD2-1B的靶點有4個，基于GC含量與二級結構篩選出2個合適的目標靶點，均位于2號外顯子上，其中靶點T1的5＇端第一個堿基有所不同，而靶點T2則完全一致（圖1B）。

實驗所用CRISPR/Cas9敲除體系為PBSE401雙元體系，通過將含2個靶點的sgRNA表達元件連接至二元載體PBSE401，形成最終的敲除載體（圖1C）。

2.2 種苗生根觀察選取

將注射菌懸液后培育2周的大豆種苗從蛭石中取出，即可清晰地觀察到其在發(fā)根農桿菌的作用下生長許多不定根，將長勢良好的根系剪下，利用DNA提取試劑盒提取大豆不定根（圖2）。

2.3 不定根編輯效率檢測

T7核酸內切酶BsaⅠ能夠識別并切割不完全配對DNA、Holiday結構或交叉DNA、異源雙鏈DNA、十字形結構DNA，或者以更慢的速度切割雙鏈DNA。本實驗利用T7核酸內切酶BsaⅠ識別并切割不完全配對DNA的特性，將包含野生型和突變型2種類型的PCR突變雜合體產物進行T7檢測切割，在退火復性后形成不完全匹配的序列，進而用T7核酸內切酶進行切割，編輯個體在實驗結果中呈現(xiàn)出與野生型不同的切割條帶（圖3）。

T7酶切結果表明：在7個不定根樣品中，F(xiàn)AD2-1A基因在1、2、3、4、6號中呈現(xiàn)編輯陽性，F(xiàn)AD2-1B基因在7個樣品中均呈現(xiàn)出編輯陽性，靶點編輯效率較高?；谏鲜鼋Y果，選取2號樣品PCR產物進行Sanger測序，發(fā)現(xiàn)靶點前的序列峰圖平穩(wěn)且準確，在靶點處開始出現(xiàn)雜亂的套峰，編輯類型主要為堿基替換，在FAD2-1A的T3靶點處存在小片段的缺失，表明2號樣品的FAD2-1A和FAD2-1B基因均被編輯（圖4）。測序結果與酶切結果一致，說明通過誘導大豆不定根介導的CRISPR/Cas9基因敲除技術能夠體外檢測大豆敲除靶點的可行性與編輯效率。

3 討論

隨著生物技術和基因組學的發(fā)展，以及基因編輯技術的逐步深入與完善，其效率高、操作簡單、成本低等優(yōu)勢逐步顯現(xiàn)，逐漸成為農作物功能基因組研究和農藝性狀改良的有效工具。Li等[7]利用CRISPR/Cas9技術靶向了大豆貯藏蛋白基因，培育出高蛋白大豆，為大豆育種工作提供了寶貴的新資源。2018年，Curtin等[8]利用基因編輯技術編輯了大豆參與小RNA加工的基因，獲得能對鹽脅迫和干旱進行相應的突變體植株。近幾年CRISPR/Cas9技術雖然在大豆上取得了不錯的進展，但依然面臨著不少的“瓶頸”。大豆遺傳轉化體系周期長、效率低問題；同時大豆基因編輯還存在打靶效率低下、可用編輯基因較少等困境。因此，如何提高替換效率、降低脫靶效率，提升遺傳穩(wěn)定性成為大豆在基因編輯領域的研究重點。

綜上，在大豆進行基因編輯和遺傳轉化前，對于基因編輯靶點的可行性檢測顯得十分重要。利用發(fā)根農桿菌介導的大豆植物子葉外植體產生不定根，并提取不定根DNA以檢測基因編輯靶點效率的方法，具有操作簡單、試驗周期短的優(yōu)點。利用此方法可快速測定基因編輯靶點的可行性，避免在實驗過程中出現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。

在本試驗中，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建了靶點敲除載體，以敲除大豆基因FAD2-1A和FAD2-1B基因，并利用發(fā)根農桿菌K599介導大豆植株產生不定根。通過對不定根DNA的提取和PCR擴增測序，結果表明：編輯載體構建成功，并成功對基因FAD2-1A和FAD2-1B進行了編輯，證明該靶點可靠、有效，可用于對大豆植株基因編輯和遺傳轉化。

參考文獻

[1] 李穎，鞠斯羽，魏健.農桿菌介導的大豆遺傳轉化體系研究進展[J].農業(yè)與技術，2022，42（17）：27-30.

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[3] 陳笑，馮獻忠.基因組編輯技術在大豆遺傳改良中的應用[J].農業(yè)生物技術學報，2021，29（4）：789-798.

[4] 黃嬌嬌，曹春偉，鄭國民，等.基因組編輯技術在豬遺傳改良中的應用[J].遺傳，2017，39（11）：1078-1089.

[5] Attila K， Dong X L， Arief I， et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology[J]. Nature Protocols， 2007， 2（4）： 948-952.

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[7] Li C L， Nguyen V， Liu J， et al. Mutagenesis of seed storage protein genes in soybean using CRISPR/Cas9[J]. BMC Research Notes， 2019， 12（1）：176.

[8] Curtin S J， Xiong Y， Michno J M， et al. CRISPR/Cas9 and TALENs generate heritable mutations for genes in‐volved in small RNA processing of Glycine max and Medicago truncatula[J]. Plant Biotechnology Journal， 2018，16（6）： 1125-1137.

A Rapid Detection Method for the Feasibility of Soybean CRISPR/Cas9 System Targets Based on Agrobacterium rhizogenes

Luo Ke et al（Biotechnology Research Institute， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Guizhou Province， Guiyang， Guizhou 550009）

Abstract The CRISPR/Cas9 gene editing method was used in this study to create gene knockout vectors for the soybean FAD2-1A and FAD2-1B genes. Agrobacterium rhizogenes K599 was then used to infect soybean plants and produce adventitious roots. The adventitious roots DNA was extracted， and PCR sequencing revealed that the adventitious roots sequence peaks were smooth and accurate before the target， and chaotic overlaid peaks started to develop near the target， showing that the soybeans FAD2-1A and FAD2-1B genes had been successfully altered. This approach offered novel technical assistance for the investigation of the FAD2 gene function and genetic advancement in soybeans. It was straight forward to use， has a brief experimental cycle， and enables rapid identification of the viability of target selection in soybeans.

Key words CRISPR/Cas9; Soybean; Agrobacterium rhizogenes; Gene editing