王小潔,張云鋒,張彥敏

1.邯鄲市婦幼保健院中醫(yī)婦科,邯鄲 056000; 2.河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院中醫(yī)專家門診,滄州 061000;3.石家莊市井陘礦區(qū)人民醫(yī)院內科,石家莊 050100

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome, PCOS)發(fā)病原因復雜,表現(xiàn)出長期無排卵或稀發(fā)排卵的高雄激素特征,嚴重影響患者的青春期心理、育齡期機體代謝等[1-2]。淫羊藿是我國傳統(tǒng)的滋補類中草藥,能增強機體性功能和免疫功能,在臨床常被用于輔助治療PCOS[3-4]。淫羊藿苷(icariin, ICA)作為淫羊藿的主要有效成分之一,具有抗氧化、抗癌、抗血管生成和抗炎等多種藥理活性[5]。本研究用脫氫表雄酮法建立PCOS小鼠模型,研究ICA對PCOS小鼠排卵障礙和卵泡發(fā)育的影響及作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

微量移液器(德國Eppendorf公司);HM355S全自動輪轉式石蠟切片機(德國MICON醫(yī)療技術有限公司);PowerPac電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

脫氫表雄酮(上海恒渡生物科技有限公司);淫羊藿苷(質量分數(shù)≥98%,上海吉至生化科技有限公司);雌二醇(estradiol, E2)、睪酮激素(testosterone, T)、促黃體生成激素(luteinizinghor mone, LH)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)和抗繆勒管激素(anti-Müllerian hormone, AMH)ELISA試劑盒,均購自武漢華美生物工程有限公司;兔抗小鼠生長分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF-9)、骨形成蛋白Ⅱ型受體(bone morphogenetic protein type Ⅱ receptor, BMPR-Ⅱ)、激活素受體樣激酶5(activin receptor like kinase 5, ALK5)、Smad蛋白2(Smad protein 2, Smad2)、p-Smad2、p-Smad3、Smad3一抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔Ig G,均購自美國Abcam公司。

1.3 動物

雌性C57BL/6小鼠50只,SPF級,4周齡,體質量為(12±1) g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,許可證號SCXK(滬)2017-0005。

2 方法

2.1 PCOS模型的建立

用陰道組織涂片法連續(xù)20 d對50只小鼠陰道細胞涂片進行動情周期觀察,隨機選擇動情周期完整的40只小鼠,于每日上午9點在小鼠頸背部皮下注射60 mg·kg-1脫氫表雄酮(溶于注射用橄欖油0.2 mL),另取10只小鼠作為對照組,于相同時間注射橄欖油0.2 mL,均連續(xù)注射21 d[6]。造模7 d起,對小鼠陰道脫落細胞進行陰道細胞涂片,觀察動情周期情況,陰道涂片顯示無規(guī)律性的動情周期表明造模成功[7]。

2.2 干預方法

將40只建模成功的小鼠隨機分為模型組及ICA低劑量、中劑量和高劑量組,每組10只。建模成功24 h后,ICA低劑量、中劑量和高劑量組分別按照25、50、75 mg·kg-1腹腔注射ICA 0.5 mL(溶于9 g·L-1氯化鈉注射液中)[8],對照組和模型組腹腔注射9 g·L-1氯化鈉注射液0.5 mL,每日1次,連續(xù)干預2周。

2.3 檢測激素水平

末次干預結束后空腹12 h,稱定質量,每日用30 mg·kg-1戊巴比妥麻醉,迅速采集小鼠腹主動脈血液5 mL,常溫靜置20 min后以10 000 r·min-1離心10 min(離心半徑為10 cm),取血清樣本2 mL,按照ELISA試劑盒說明書進行操作,依次加樣、孵育酶標抗體,加底物顯色,終止反應,用酶標儀于450 nm處測定各孔吸光度值A,繪制標準曲線,計算待測樣品中T、E2、LH、FSH和AMH水平。

2.4 計算臟器指數(shù)

取血后將各組小鼠雙側卵巢和子宮完整取出,去除周圍脂肪組織,稱定質量并記錄,計算臟器指數(shù)。卵巢指數(shù)=卵巢質量(mg)/體質量(g)。子宮指數(shù)=子宮濕質量(mg)/體質量(g)。

2.5 觀察組織學變化

用生理鹽水沖洗卵巢組織,取右側卵巢組織置于液氮中保存,取左側卵巢組織置于40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定24 h,經(jīng)脫水和石蠟包埋,制成厚度為4 μm的切片,依次乙醇脫水、二甲苯透明、蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、脫水、透明、中性樹膠封片,于顯微鏡下觀察組織形態(tài)。每張切片隨機選取5個不同視野,計數(shù)生長卵泡數(shù)量、囊性卵泡數(shù)量和黃體數(shù)量。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

取各組2.5項下液氮保存的小鼠部分卵巢組織置于PBS中,顯微鏡下用鑷子擠壓卵巢得到顆粒細胞和卵母細胞,靜置10 min,去上清,加入1 g·L-1的胰蛋白酶消化15 min,加入M16培養(yǎng)液,靜置10 min,去上清,再加入PBS以3 000 r·min-1離心10 min,去上清,用PBS沖洗,加入Binding Buffer結合液400 μL懸浮細胞,調整細胞密度為5×105個·mL-1,加入FITC-Annexin V 5 μL和PI 5 μL ,混勻,避光靜置10 min,上樣檢測細胞凋亡情況。

2.7 檢測卵巢組織中相關蛋白水平

取各組2.5項下冷凍保存的小鼠卵巢組織100 mg,置于EP管中,加入RIPA試劑0.6 mL,剪碎勻漿,靜置10 min,離心(20 min,4 ℃,8 000 r·min-1,離心半徑為10 cm),取上清,用BCA試劑盒蛋白定量,取1∶1樣本和上樣緩沖液混勻進行SDS-PAGE電泳,100 V電轉30 min,轉至PVDF膜上,滴加適量封閉液處理2 h(室溫),將膜放入GDF-9、BMPR-Ⅱ、ALK5、p-Smad2、p-Smad3、Smad2和Smad3一抗中(均1∶800稀釋),4 ℃搖床孵育過夜,TBST洗膜,放入二抗(1∶2 000稀釋)中,室溫搖床孵育1 h,TBST洗膜,滴加顯影液,于暗室曝光、顯影,Image J軟件分析條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠激素水平的比較

模型組T、LH和AMH的水平較對照組升高,E2、FSH的水平較對照組降低(P<0.05);ICA各劑量組T、LH和AMH的水平較模型組降低,E2、FSH的水平較模型組升高(P<0.05);T、LH和AMH的水平與ICA呈劑量依賴性降低,E2、FSH的水平與ICA呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠激素水平的比較

3.2 各組小鼠臟器指數(shù)的比較

模型組的卵巢指數(shù)較對照組升高,子宮指數(shù)較對照組降低(P<0.05);ICA各劑量組的卵巢指數(shù)較模型組降低,子宮指數(shù)較模型組升高(P<0.05);卵巢指數(shù)與ICA呈劑量依賴性降低,子宮指數(shù)與ICA呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠臟器指數(shù)比較

3.3 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學的比較

對照組小鼠卵巢組織可見各時期的卵泡和黃體,有發(fā)育良好的生長卵泡且卵泡的顆粒細胞呈多層次。模型組小鼠的卵巢組織中較少見生長卵泡,顆粒細胞層數(shù)減少,卵巢囊性卵泡數(shù)量和閉鎖卵泡數(shù)量增加,黃體數(shù)量減少;ICA各劑量組小鼠各級卵泡數(shù)量增多,卵泡內顆粒細胞層數(shù)增加、囊性卵泡數(shù)量減少,黃體數(shù)量增加。囊性卵泡數(shù)量與ICA呈劑量依賴性降低,生長卵泡數(shù)量、黃體數(shù)量與ICA呈劑量依賴性增加(P<0.05)。見圖1、表3。

注:A.對照組;B.模型組;C.ICA低劑量組;D.ICA中劑量組;E.ICA高劑量組。

表3 各組小鼠卵巢組織生長卵泡、囊狀卵泡和黃體數(shù)量比較

3.4 各組小鼠卵泡細胞凋亡率的比較

模型組凋亡率較對照組升高(P<0.05);ICA各劑量組凋亡率較模型組降低(P<0.05);凋亡率與ICA呈劑量依賴性降低(P<0.05),見表4。

表4 各組小鼠卵母細胞凋亡率的比較

3.5 卵巢組織相關蛋白水平的比較

模型組GDF-9、BMPR-Ⅱ、ALK5、p-Smad2和p-Smad3蛋白的表達水平均較對照組降低(P<0.05);ICA各劑量組GDF-9、BMPR-Ⅱ、ALK5、p-Smad2和p-Smad3蛋白的表達水平較模型組升高(P<0.05);GDF-9、BMPR-Ⅱ、ALK5、p-Smad2和p-Smad3蛋白的表達水平與ICA呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 各組小鼠卵巢組織GDF-9、BMPR-Ⅱ、ALK5、p-Smad2和p-Smad3蛋白水平的比較

4 討論

PCOS是由多種因素調控的具有較高發(fā)病率的內分泌和代謝紊亂疾病,由于激素異常分泌,影響下丘腦-垂體-卵巢軸的平衡,使卵泡正常發(fā)育或正常排卵受到干擾,從而導致不孕[9-10]。本研究中ICA各劑量組小鼠卵巢指數(shù)和囊性卵泡數(shù)量較模型組降低,子宮指數(shù)、黃體和生長卵泡數(shù)量均較模型組升高,表明ICA可促進PCOS小鼠卵泡生長、發(fā)育,改善排卵功能。

卵泡的正常發(fā)育主要基于下丘腦-垂體-性腺軸調控分泌的性激素共同維持生殖內分泌活動的穩(wěn)定[11]。AMH是反映卵巢中生長卵泡數(shù)量的重要標志物,在PCOS中參與卵泡發(fā)育的2個過程,一是可抑制始基卵泡的起始募集,即阻止生長卵泡形成;二是可阻止FSH刺激的卵泡發(fā)育,即抑制生長卵泡的發(fā)育和優(yōu)勢卵泡的形成[12-13]。優(yōu)勢卵泡在LH和FSH作用下排卵,FSH主要促進顆粒細胞的增生與分化,通過與卵泡表面的FSHR結合促進卵泡生長[14]。本研究中ICA各劑量組T、LH、AMH水平較模型組降低,E2、FSH水平較模型組升高,表明ICA可有效改善PCOS小鼠內分泌代謝,進一步緩解無排卵或稀發(fā)排卵。此外,卵泡顆粒細胞在卵泡發(fā)育中發(fā)揮著重要作用,有研究發(fā)現(xiàn)顆粒細胞的凋亡會導致卵泡閉鎖,阻礙卵泡發(fā)育,抑制排卵[15-16]。本研究中ICA各劑量組凋亡率較模型組降低,表明ICA可抑制顆粒細胞凋亡,促進卵泡細胞正常生長發(fā)育。

GDF-9屬于卵母細胞特異性生長因子TGF-β家族,主要作用于顆粒細胞的增殖、分化及調亡等過程,顆粒細胞又反饋于卵母細胞營養(yǎng)物質,維持卵母細胞微環(huán)境穩(wěn)定以及卵泡的發(fā)育、成熟、排卵及受精過程[17-18]。GDF-9/Smads通路即GDF-9先與細胞膜上的BMPR-Ⅱ結合使其磷酸化后募集ALK5 I型受體形成磷酸化復合物,誘導Smad2/3磷酸化啟動信號傳導,調控卵泡發(fā)育[19]。通過激活GDF-9/Smads通路可促進卵泡生長發(fā)育,改善排卵障礙[20]。本研究中ICA各劑量組GDF-9、BMPR-Ⅱ、ALK5、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達水平較模型組升高,表明ICA促進卵泡發(fā)育成熟、改善PCOS小鼠排卵,其可能與GDF-9/Smads信號通路調控緊密相關。

綜上所述,ICA可有效調節(jié)PCOS小鼠生殖激素水平、改善內分泌代謝,可能通過調控GDF-9/Smads信號通路促進卵泡發(fā)育、成熟,減少卵泡的凋亡,改善排卵,為ICA應用于PCOS的臨床治療提供理論支持。