魏鵬輝,劉 英,程敏菊

1.華北醫(yī)療集團(tuán)峰峰總醫(yī)院心內(nèi)科,邯鄲 056000;2.唐山開(kāi)灤醫(yī)院心血管內(nèi)科,唐山 065000;3.邢臺(tái)市人民醫(yī)院心臟內(nèi)科,邢臺(tái) 054000

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病,coronary heart disease, CHD)是冠狀動(dòng)脈功能性/器質(zhì)性病變,即冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生粥樣硬化,引起冠狀動(dòng)脈供血與心肌需求失衡,心肌缺血、缺氧或壞死而導(dǎo)致的心臟病[1]。CHD的臨床表現(xiàn)為心力衰竭、心悸乏力,甚至猝死,極大威脅人們的生命健康[2]。芝麻素是一種天然抗氧化劑,作為芝麻的主要活性成分,具有降低三酰甘油(triglyceride, TG)、膽固醇(cholesterin, TC)及改善心肌及血管肥厚、減少中風(fēng)等功效[3]。脂代謝異常、血管內(nèi)皮功能異常是CHD的主要誘因[4]。研究表明,芝麻素可通過(guò)降低炎癥因子釋放抑制CHD大鼠心肌細(xì)胞的異常活化[5]。因此,本研究建立CHD模型,研究芝麻素對(duì)CHD大鼠脂代謝、血管內(nèi)皮功能、心肌組織的影響及作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HM355S全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)MICON醫(yī)療技術(shù)有限公司);DxC700AU全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司);PowerPac電泳儀和CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng),均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 試藥

芝麻素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,批號(hào)Z-001,成都瑞芬思生物科技有限公司);羧甲基纖維素鈉(批號(hào)C9481)、BCA蛋白定量分析試劑盒(批號(hào)BCA1),均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;一氧化氮Assay試劑盒(批號(hào)ab272517,美國(guó)Abcam公司);白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)ELISA試劑盒(批號(hào):SEKR-0005、SEKR-0009),均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;兔抗大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)抗體(批號(hào)ab154598)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase, Akt)抗體(批號(hào)ab154598)、p-Akt抗體(批號(hào)ab8805)、一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)抗體(批號(hào)ab38449)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(cysteinyl aspartate specific proteinase-12, Caspase-12)抗體(批號(hào)ab199956),細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)抗體(批號(hào)ab62484)及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ig G(批號(hào)ab282575),均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;p-eNOS抗體[批號(hào)YS-(kt)-0416,上海研生實(shí)業(yè)有限公司]。

1.3 動(dòng)物

80只SPF級(jí)雄性SD大鼠,10周齡,體質(zhì)量為(200±20) g,購(gòu)自武漢云克隆動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)SCXK(鄂)2018-0021,室溫飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

2 方法

2.1 大鼠模型的建立

適應(yīng)性飼養(yǎng)后取64只大鼠給予高脂飼料飼養(yǎng),建立CHD模型[6]:以質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%膽固醇、10%白糖、20%豬油、15%酪蛋白、1%維生素D及51%基礎(chǔ)飼料連續(xù)喂養(yǎng)4周。末次喂養(yǎng)后禁食12 h,不禁飲,30 mg·kg-1戊巴比妥耳緣靜脈注射麻醉大鼠,尾靜脈注射垂體后葉素30 u·kg-1。記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖,Ⅱ?qū)?lián)心電圖中測(cè)定J點(diǎn)位移>0.1 mV即建模成功[5]。

2.2 干預(yù)方法

將建模成功大鼠隨機(jī)分為模型組及芝麻素低劑量、中劑量和高劑量組,每組16只,剩余16只為對(duì)照組。芝麻素低劑量、中劑量和高劑量組按照每天2 mL,分別灌胃40、80、160 mg·kg-1芝麻素(羧甲基纖維素鈉溶液溶解),對(duì)照組和模型組每天灌胃羧甲基纖維素鈉溶液2 mL,連續(xù)干預(yù)28 d。

2.3 檢測(cè)脂代謝相關(guān)指標(biāo)

大鼠干預(yù)結(jié)束后禁食12 h,各組大鼠尾靜脈取血5 mL,以3 000 r·min-1(離心半徑為25 cm)離心10 min,收集血清,用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平。

2.4 檢測(cè)血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)

用30 mg·kg-1戊巴比妥麻醉各組大鼠后,迅速取出大鼠胸主動(dòng)脈,清除結(jié)締組織,將血管剪成3～4 mm血管環(huán),懸掛于連接張力換能器的K-H液的氣管浴管中,浴管中供給氣體(體積分?jǐn)?shù)95%氧氣和體積分?jǐn)?shù)5%二氧化碳)。待血管環(huán)穩(wěn)定后滴注1 μmol·L-1去氧腎上腺素干預(yù)。待張力恢復(fù)至1 g,再給予1 μmol·L-1去氧腎上腺素收縮血管,達(dá)峰值10 min后,連續(xù)給予乙酰膽堿(acetylcholine, ACH),穩(wěn)定后血管環(huán)平衡至基礎(chǔ)張力。血管收縮達(dá)峰值后,累積給藥,給予酸化亞硝酸鈉,以1 μmol·L-1的去氧腎上腺素誘發(fā)最大收縮幅度,記錄血管張力變化。

2.5 HE染色觀察組織學(xué)變化

取各組8只大鼠左心室心肌組織,用100 g·L-1多聚甲醛固定48 h,乙醇脫水,石蠟包埋,制成厚4 μm的切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水,蘇木精染色5 min,伊紅染色5 min,脫水固定后,中性樹(shù)脂封片,鏡下觀察并拍照記錄。

2.6 檢測(cè)IL-6、TNF-α和一氧化氮(nitric oxide,NO)水平

無(wú)菌取剩余各組的8只大鼠心肌組織,液氮處理后置于-80 ℃的冰箱中保存,取心肌組織50 mg,加入PBS 1 mL勻漿,以3 500 r·min-1低溫離心10 min(離心半徑為10 cm),取上清,設(shè)置對(duì)照品孔、樣本孔及空白孔,將稀釋樣品及對(duì)照品液加入相應(yīng)檢測(cè)孔內(nèi),抗體包被,洗板,加入酶結(jié)合物工作液,洗板,加入顯色工作液,終止反應(yīng),于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)值,繪制對(duì)照品線性回歸曲線,計(jì)算樣品中IL-6、TNF-α和NO水平。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取各組2.6項(xiàng)下冷凍保存的大鼠心肌組織研磨,制備單細(xì)胞懸液(5×105個(gè)·mL-1),取懸液100 μL,加入稀釋好的1×Annexin V Binding Buffer 100 μL,用移液槍緩慢吸打混勻,避光靜置10 min,加入FITC-Annexin V和PI染液5 μL,吸打混勻,避光靜置10 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.8 檢測(cè)PI3K等蛋白水平

取各組2.6項(xiàng)下冷凍保存的大鼠心肌組織100 mg,置于無(wú)酶EP管中,加入RIPA 0.6 mL,充分勻漿,以12 000 r·min-14 ℃離心10 min,取上清,BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度,SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜上,用50 g·L-1脫脂牛奶封閉2 h,于一抗(TBST行1∶1 000稀釋)中4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜20 min,加入二抗(TBST行1∶8 000稀釋),置于搖床中振蕩孵育1 h,TBST洗膜20 min,將PVDF膜置于凝膠成像儀顯影區(qū),均勻滴加顯影液,于暗室中進(jìn)行曝光、顯影,Image J軟件分析,目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 脂代謝指標(biāo)的比較

模型組的TC、TG較對(duì)照組升高,HDL-C較對(duì)照組降低(P<0.05);芝麻素各劑量組的TC、TG較模型組降低,HDL-C較模型組升高(P<0.05);TC、TG與芝麻素呈劑量依賴性降低,HDL-C與芝麻素呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠脂代謝的比較

3.2 血管內(nèi)皮功能的比較

模型組ACH處理血管最大舒張程度較對(duì)照組升高(P<0.05);芝麻素各劑量組ACH處理血管最大舒張程度較模型組降低(P<0.05);ACH處理血管最大舒張程度與芝麻素呈劑量依賴性降低(P<0.05)。酸化亞硝酸鈉處理血管最大舒張程度各組間差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血管內(nèi)皮功能的比較

3.3 組織形態(tài)學(xué)的比較

對(duì)照組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰,排列規(guī)則緊密,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色均勻。模型組大鼠心肌細(xì)胞染色不均,間質(zhì)伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),心肌纖維排列紊亂,或見(jiàn)斷裂。芝麻素各劑量組大鼠心肌細(xì)胞排列較模型組整齊規(guī)則,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少,心肌組織的損傷較模型組減輕。見(jiàn)圖1。

注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.芝麻素低劑量組;D.芝麻素中劑量組;E.芝麻素高劑量組。

3.4 心肌組織IL-6、TNF-α和NO水平的比較

模型組IL-6、TNF-α水平較對(duì)照組升高,NO水平較對(duì)照組降低(P<0.05);芝麻素各劑量組IL-6、TNF-α水平較模型組降低,NO水平較模型組升高(P<0.05);IL-6、TNF-α水平與芝麻素呈劑量依賴性降低,NO水平與芝麻素呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 心肌組織IL-6、TNF-α和NO水平的比較

3.5 心肌組織凋亡率的比較

模型組心肌組織凋亡率較對(duì)照組升高(P<0.05);芝麻素各劑量組心肌組織凋亡率較模型組降低(P<0.05);心肌組織凋亡率與芝麻素呈劑量依賴性降低(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖2。

注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.芝麻素低劑量組;D.芝麻素中劑量組;E.芝麻素高劑量組。

表4 心肌組織凋亡率的比較

3.6 心肌組織諸項(xiàng)蛋白水平的比較

模型組Caspase-12、ICAM-1蛋白水平較對(duì)照組升高,PI3K、p-Akt和p-eNOS蛋白水平較對(duì)照組降低(P<0.05);芝麻素各劑量組Caspase-12、ICAM-1蛋白水平較模型組降低,呈劑量依賴性降低(P<0.05);PI3K、p-Akt和p-eNOS蛋白水平較模型組升高,呈劑量依賴性升高(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖3。

注:A.對(duì)照組;B.模型組;C.芝麻素低劑量組;D.芝麻素中劑量組;E.芝麻素高劑量組。

表5 心肌組織PI3K、p-Akt、p-eNOS、Caspase-12和ICAM-1蛋白水平的比較

4 討論

CHD是臨床上較為常見(jiàn)的一種心血管疾病,隨著生活水平變化CHD呈年輕化趨勢(shì)[7]。CHD患者會(huì)伴隨出現(xiàn)不同程度的血脂功能異常[8]和血管內(nèi)皮功能損傷[9]。有研究發(fā)現(xiàn)芝麻素和異芝麻素混合物可改善高脂飲食大鼠的脂質(zhì)代謝[10]。另有研究發(fā)現(xiàn),芝麻素聯(lián)合維生素E對(duì)由D-半乳糖和三氯化鋁誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙具有明顯的改善作用[11]。本研究以高脂喂養(yǎng)建立CHD大鼠模型,深入探討芝麻素對(duì)CHD大鼠心肌組織的作用及可能的作用機(jī)制。

本研究中,HE染色結(jié)果顯示芝麻素各劑量組大鼠心肌細(xì)胞排列較模型組更整齊規(guī)則,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少,心肌組織的損傷較模型組減輕,且芝麻素各劑量組TC、TG和ACH誘導(dǎo)血管舒張效應(yīng)較模型組降低,HDL-C較模型組升高,表明芝麻素可有效抑制膽固醇合成,降低血脂水平,并緩解主動(dòng)脈ACH處理血管最大舒張程度,保護(hù)心肌組織,發(fā)揮治療CHD的作用。炎癥反應(yīng)對(duì)CHD的發(fā)生和發(fā)展有顯著影響,IL-6、TNF-α水平在一定程度上可反映動(dòng)脈粥樣硬化的程度[12],有研究發(fā)現(xiàn)抑制炎癥反應(yīng)可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,提高血管內(nèi)皮功能,保護(hù)心肌細(xì)胞[13]。ICAM-1是炎性細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化形成的必要條件,也參與血管內(nèi)皮損傷過(guò)程[14]。Caspase-12是Caspase蛋白家族中參與細(xì)胞凋亡的主要蛋白,有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)Caspase-12可發(fā)揮抑制心肌組織凋亡的作用[15]。本研究中芝麻素各劑量組IL-6、TNF-α、ICAM-1和Caspase-12水平較模型組降低,表明芝麻素可以減輕CHD大鼠炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮損傷,抑制凋亡蛋白分泌,保護(hù)心肌組織。

PI3K/Akt作為抗凋亡的主要調(diào)控信號(hào)通路,在CHD中發(fā)揮作用[16]。PI3K可使下游靶因子Akt磷酸化[17],活化的Akt進(jìn)一步激活下游靶蛋白eNOS[18]。eNOS磷酸化后可催化NO的生成,NO能調(diào)節(jié)血流分布和血管張力,保護(hù)血管內(nèi)皮功能[19],也可以通過(guò)抑制mPTP通道開(kāi)放而發(fā)揮抑制凋亡的作用[20]。本研究中芝麻素各劑量組心肌組織凋亡率較模型組降低,NO、PI3K、p-Akt和p-eNOS較模型組升高,表明芝麻素可抑制CHD大鼠心肌細(xì)胞凋亡,增加NO合成量,從而保護(hù)心肌組織,其可能與激活PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,芝麻素可有效改善CHD大鼠脂代謝水平和血管內(nèi)皮功能損傷,減輕心肌組織炎癥反應(yīng),降低ICAM-1、Caspase-12蛋白的表達(dá)水平,抑制心肌細(xì)胞凋亡,保護(hù)心肌組織,可能與調(diào)控PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路的相關(guān)蛋白有關(guān)。