竇錦明,常躍興,荊漢衛(wèi),張?zhí)煨?王振華*

1. 濰坊市中醫(yī)院藥學部,濰坊 261041; 2. 安徽理工大學醫(yī)學院,淮南 232063;3. 濰坊市檢驗檢測中心,濰坊 261061;4. 山東中醫(yī)藥大學,濟南 250355

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD. Don的干燥全草,味辛、苦,性寒,歸肺、肝、腎經(jīng),具有清熱解毒、化瘀利尿的功效。用于疔瘡腫毒、咽喉腫痛、跌撲傷痛、水腫、黃疸和蛇蟲咬傷的治療?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明,其具有解熱、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、利尿、抑菌及抗病毒等作用,常用于治療疔瘡、肺癰、急性腎炎和癌癥[1-2]。

目前,大多數(shù)學者對半枝蓮所含的化學成分已達成共識,其主要含有黃酮類、二萜類、生物堿、香豆素、多糖和甾醇等成分[3-4],但半枝蓮質(zhì)量評價的方法不盡相同。有學者以黃酮、總黃酮含量評價半枝蓮質(zhì)量[5-6],有學者以萜類評價半枝蓮質(zhì)量[7-8],均無法全面反映半枝蓮所含的化學成分。本文收集不同產(chǎn)地的12批半枝蓮,用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)指紋圖譜[9-11]結(jié)合化學計量學[12]技術(shù)建立半枝蓮的質(zhì)量控制方法,旨在為半枝蓮的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT(SPD-M20A檢測器)高效液相色譜儀、AUW120D型分析天平均購自島津制作所;KQ-250型超聲清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

木犀草苷(批號111720-202111)、野黃芩苷(批號110842-202010)、芹菜素(批號111901-202004),木犀草素(批號111520-202107)、半枝蓮對照藥材(批號121293-202105),均購自中國食品藥品檢定研究院;12批[S1(對照藥材)、S2(廣西玉林)、S3(廣西南寧)、S4(廣西柳州)、S5(廣東梅州)、S6(廣東清遠)、S7(廣東揭陽)、S8(云南昆明)、S9(云南普洱)、S10(云南大理)、S11(河南駐馬店)、S12(河南平頂山)、S13(河南南陽)]半枝蓮經(jīng)濰坊市檢驗檢測中心荊漢衛(wèi)主任中藥師鑒定為唇形科半枝蓮ScutellariabarbataD. Don的干燥地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為InertSustain C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～15 min,15%～18% A;15～30 min,18% A;30～45 min,18%～25% A;45～60 min,28%～38% A;60～65 min,38%～90% A;65～70 min,90% A。梯度流速0～15 min,1.0 mL·min-1;15～30 min,0.8 mL·min-1;30～70 min,1.0 mL·min-1。進樣量為10 μL,檢測波長為335 nm,柱溫為30 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1對照品溶液 分別精密稱取木犀草苷、野黃芩苷、木犀草素、芹菜素對照品適量,置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,得對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 精密稱取12批半枝蓮樣品粉末(過3號篩)約1.0 g,置于具塞三角瓶中,加體積分數(shù)50%甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理40 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用體積分數(shù)為50%的甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,得供試品溶液。

2.2.3對照藥材溶液 精密稱取半枝蓮對照藥材粉末(過3號篩)約1.0 g,按照2.2.2項下方法制備。

2.3 方法學考察

2.3.1精密度實驗 取2.2.3項下制備的對照藥材溶液,按照2.1項下的色譜條件進樣6次,得共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于1.0%,表明儀器的精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性實驗 取對照藥材溶液,按照2.1項下色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進樣,得共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于1.0%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3重復性實驗 取6份對照藥材粉末,按照2.2.2項下的方法制備,按照2.1項下色譜條件進樣,得共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于1.0%,表明該方法的重復性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立

取12個批次半枝蓮供試品溶液,按照2.1項下的色譜條件測定。將色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012年版”分析,以S1對照藥材的色譜圖為參照圖譜,生成半枝蓮HPLC指紋圖譜,見圖1。

注:紫外吸收光譜圖:波長190～400 nm;黑線為對照藥材光譜;紅線為對照品光譜。

12批半枝蓮樣品的相似度為0.994～0.972,表明不同產(chǎn)地半枝蓮化學成分的種類相似。標定共有色譜峰30個,與對照品色譜圖(保留時間)、紫外吸收光譜(特征吸收峰)比對,確認4個色譜峰,11號峰為木犀草苷,12號峰為野黃芩苷(參照峰),23號峰為木犀草素,28號峰為芹菜素。半枝蓮HPLC指紋圖譜共有峰的保留時間差別較小,但峰面積差異較大,表明不同產(chǎn)地半枝蓮化學成分的種類相近,但含量有差異。

2.5 化學計量學分析

2.5.1聚類分析(cluster analysis,CA) 將半枝蓮各批次共有峰面積Z-Score標準化,導入MetaboAnalyst 5.0軟件進行K-means聚類分析[13]和Ward聚類分析[14](組間連接,歐式平方距離),見圖2、圖3。由圖2、圖3可知,河南為一類,云南為一類,廣東、廣西為一類,表明各產(chǎn)地半枝蓮的化學成分含量有顯著差異。

圖2 不同產(chǎn)地半枝蓮K-means聚類分析

圖3 不同產(chǎn)地半枝蓮Ward聚類分析熱圖

2.5.2主成分分析(principle component analysis,PCA) 將半枝蓮各批次共有峰面積Z-Score標準化,導入SPSS 26和MetaboAnalyst 5.0軟件進行PCA分析[15],得到3個主成分(特征值>1),其方差貢獻率為PC1(42.70%)、PC2(27.00%)、PC3(12.30%),累積方差貢獻率為82.00%,表明3個主成分代表原始色譜峰的大部分信息。

PCA得分見圖4。由圖4可知,河南為一類,云南為一類,廣東、廣西為一類,與聚類分析結(jié)果一致,表明各產(chǎn)地半枝蓮的化學成分含量有顯著差異。將3個主成分矩陣結(jié)果(得分>0.800)求并集后,顯示有差異的色譜峰為1、10、12、14、15、16、18、19、11、22號峰。見圖5。

圖4 不同產(chǎn)地半枝蓮主成分分析得分圖

圖5 不同產(chǎn)地半枝蓮主成分分析的成分矩陣得分圖

2.5.3偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA) 將半枝蓮各批次共有峰面積Z-Score標準化,導入MetaboAnalyst 5.0軟件進行PLS-DA分析[16],置換檢驗法(1 000次)顯示P=0.017,LOOCV交叉驗證顯示累積R2=0.971 5,Q2=0.639 65,Accuracy=0.916 67,表明可靠度高。

PLS-DA得分圖見圖6。由圖6可知,河南為一類,云南為一類,廣東、廣西為一類,與聚類分析結(jié)果一致,表明各產(chǎn)地半枝蓮的化學成分含量有顯著差異。將3個Components VIP得分結(jié)果(VIP 值>1.0)求并集后,結(jié)果顯示有差異的色譜峰為1、2、3、6、8、10、11、12、13、14、16、18、19、28號峰。見圖7。

圖6 不同產(chǎn)地半枝蓮偏最小二乘法判別分析得分圖

圖7 不同產(chǎn)地半枝蓮偏最小二乘法判別分析VIP得分圖

2.5.4質(zhì)量標志物鑒別 對PCA的成分矩陣和PLS-DA的VIP值分析結(jié)果取交集,獲得差異化學成分為1、10、11、12、14、16、18、19號峰。半枝蓮的可能藥效部位為黃酮類成分,10、11、12、14、16、18、19號峰均在250～280 nm和310～350 nm范圍內(nèi)有強吸收,符合黃酮類成分的特征紫外吸收帶。各色譜峰標準化峰面積箱線圖見圖8。結(jié)果顯示不同產(chǎn)地化學成分含量有顯著性差異,因此,確定10、11(木犀草苷)、12(野黃芩苷)、14、16、18、19號峰為潛在質(zhì)量標志物[17]。河南、廣西、云南產(chǎn)地各質(zhì)量標志物含量波動小于廣東產(chǎn)地,表明河南、廣西、云南產(chǎn)地半枝蓮質(zhì)量穩(wěn)定性高于廣東。河南產(chǎn)地各質(zhì)量標志物含量高于廣東、廣西、云南,表明河南產(chǎn)地半枝蓮質(zhì)量優(yōu)于廣東、廣西、云南。

注:縱坐標為峰面積標準化值;橫坐標為產(chǎn)地信息。A.10號峰(保留時間19.635 min);B.11號峰(保留時間20.889 min);C.12號峰(保留時間22.067 min);D.14號峰(保留時間25.265 min);E.16號峰(保留時間30.901 min);F.18號峰(保留時間39.937 min);G.19號峰(保留時間40.769 min)。

3 討論

考察提取溶劑(水,體積分數(shù)25%、50%、75%、100%甲醇)和提取時間(20、40、60 min)發(fā)現(xiàn),體積分數(shù)50%甲醇超聲40 min提取的色譜峰信息量豐富?？疾焐V系統(tǒng)(甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液)顯示,乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液分離效果最佳。用PDA檢測器對各色譜峰在190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描,顯示335 nm處色譜峰基線平穩(wěn),色譜峰信息量豐富。

本研究建立了半枝蓮HPLC指紋圖譜聯(lián)合化學計量學的質(zhì)量分析方法,結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地半枝蓮指紋圖譜相似度均大于0.900,相對峰面積有差異,表明不同產(chǎn)地半枝蓮所含的化學成分種類一致性高,但化學成分含量有差異。K-means和Ward聚類分析、PCA和PLS-DA均顯示不同產(chǎn)地半枝蓮分3類。質(zhì)量標志物鑒別顯示各產(chǎn)地半枝蓮化學成分的含量有差異,能分辨各產(chǎn)地半枝蓮質(zhì)量的優(yōu)劣和穩(wěn)定性,可作為半枝蓮質(zhì)量標志物的考察指標。分析原因,可能與不同產(chǎn)區(qū)的氣候、緯度、海拔、土壤和藥材采收原則等有關(guān)[18-20],有待進一步研究。

半枝蓮HPLC指紋圖譜加化學計量學的質(zhì)量評價方法能全面反映不同產(chǎn)地半枝蓮的化學成分信息,為半枝蓮飲片的質(zhì)量標準研究和含半枝蓮的中成藥質(zhì)量標準研究提供依據(jù)。