張鈺瑤 李 靈 邢慧子 高 平 鄧小寬 周鵬程 樊平原 陳海瓊

(1四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610065; 2四川通世達(dá)生物科技有限公司,資陽市天然產(chǎn)物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川資陽 641500)

桑樹是桑科(Moraceae)桑屬(MorusL.)植物,為深根系快速生長的落葉灌木或小喬木。作為蠶桑產(chǎn)業(yè)重要的組成部分,桑樹支撐起了繁榮幾千年的絲綢之路。我國不僅是蠶桑產(chǎn)業(yè)的重要起源中心,還是繭絲生產(chǎn)與出口大國,擁有非常豐富的桑樹品種資源。而四川省作為國家“東桑西移”工程的重要實(shí)施地區(qū)之一,桑樹種植面積居全國第2[1]。蠶桑產(chǎn)業(yè)作為四川省支柱產(chǎn)業(yè),主要產(chǎn)品產(chǎn)量質(zhì)量均在全國前2位[2]。但傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)單一,單純依靠種桑養(yǎng)蠶繅絲織綢,整體效益低且資源浪費(fèi)嚴(yán)重。近年來,國家倡導(dǎo)對桑樹資源進(jìn)行綜合利用,其中桑樹活性物質(zhì)研究備受重視。

桑葉作為被廣泛應(yīng)用于中藥領(lǐng)域的重要材料,含有多種藥用活性成分,在醫(yī)藥和健康領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景,如降血糖[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]、抗氧化[6]、抗肥胖[7]等。目前關(guān)于桑葉活性成分的研究多集中在提取精制工藝和藥理活性上,未見針對四川省主要栽種桑樹品種藥用品質(zhì)綜合評價的研究?？傸S酮、1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)作為桑葉的主要藥效成分,常用作評價桑樹資源藥效品質(zhì)。但不同桑樹品種活性成分差異較大,給桑葉進(jìn)一步開發(fā)利用帶來了諸多不便。因此,本試驗(yàn)選取四川省主要栽種桑樹品種的桑葉為材料,通過檢測桑葉中的總黃酮、1-DNJ含量來分析不同桑樹品種中活性物質(zhì)的含量差異,篩選出活性成分含量高的品種,為桑葉的食用、藥用開發(fā)提供參考,并為桑樹的栽培和推廣奠定基礎(chǔ),以滿足桑樹多元化開發(fā)需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試桑葉 桑葉樣品 26 份,資陽市樂至縣經(jīng)濟(jì)科技信息化局提供,考慮到不同季節(jié)對桑葉中活性成分的影響,因此本次試驗(yàn)的樣品采集時間均為 2021 年 11 月份。桑葉樣品的編號見表1。

表1 四川省主要栽種的26份桑樹品種

1.1.2 主要試劑 無水甲醇、乙腈、硼酸氯化鉀、甘氨酸、冰醋酸、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁,均為分析純,成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品;乙腈,色譜純,成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品;蘆丁、1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品,純度99%,成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;芴甲氧羰酰氯,色譜純,上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-O)、粉碎機(jī)(DFT-200),均為上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品;水浴鍋(R2010),英峪儀器廠產(chǎn)品;電子天平(JF1004)、超聲波清洗器(JP-020),均為余姚市金諾天平儀器有限公司產(chǎn)品;高效液相色譜儀,北京創(chuàng)新通恒科技有限公司產(chǎn)品;Sepax Sapphire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);UV8100型紫外可見分光光度計,北京萊博泰科技儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑葉中活性物質(zhì)的提取 將采集好的 26份不同桑樹品種的桑葉按不同種類放置于干燥箱中,經(jīng)溫度60 ℃,時間 3 h 烘干后,粉碎過12目篩,并裝入自封袋中注明編號及名稱。分別稱取 1.0 g 不同桑樹品種的桑葉粉于圓底燒瓶內(nèi),加入蒸餾水(pH=8,用碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié))30 mL,放置 1 h 后放入恒溫水浴鍋中調(diào)至 70 ℃,加熱提取 60 min。取出后抽濾,并轉(zhuǎn)入 25 mL 容量瓶,用蒸餾水定容,得到不同桑樹品種的待測樣品溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 (1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。稱取15 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中,加入無水乙醇進(jìn)行溶解、定容,即得到蘆丁母液。分別量取1、2、3、4、5、6 mL蘆丁母液于25 mL容量瓶內(nèi),補(bǔ)充蒸餾水至25 mL。采用Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法[8]測定總黃酮含量。根據(jù)所測結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為y=10.616x-0.000 3,R2=0.999 6。(2) 1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。稱取10 mg的1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中,加入 50%甲醇溶液進(jìn)行溶解、定容,即得到1-DNJ母液。分別量取1、2、3、4、5、6 mL 的1-DNJ母液于25 mL容量瓶中并定容。用FMOC-CL衍生法[9]衍生后采用高效液相色譜紫外檢測法測定含量,色譜條件為流動相乙腈∶0.2% 冰醋酸(V∶V)梯度洗脫,0～15 min 25∶75～80∶20,15～30 min保持 80∶20,流速為 1.0 mL/min,檢測波長256 nm。蠶桑副產(chǎn)品綜合利用色譜條件包括流動相比例為乙腈∶0.2% 冰醋酸(V∶V)=25∶75,在15 min 后將比例調(diào)為 80∶20,流速為 1.0 mL/min,使用256 nm的紫外檢測器進(jìn)行檢測。根據(jù)所測結(jié)果以峰面積為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=1 569.8x+315.35,R2=0.998 3。

1.2.3 含量測定 (1)總黃酮含量測定。精密量取26份不同桑樹品種的桑葉樣品待測液1 mL,放入25 mL 容量瓶內(nèi)并用蒸餾水定容,按上述方法測定吸光度,計算得到總黃酮含量。(2)1-DNJ含量測定。精密量取26份不同桑樹品種的桑葉樣品待測液1 mL,置于 25 mL 容量瓶并用蒸餾水定容,按上述方法測定色譜峰面積,計算得到1-DNJ含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS Statistics 27.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、顯著性分析和正態(tài)性分析。試驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,并用小寫英文字母表示顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同桑樹品種的桑葉總黃酮含量

從表2 可以看出,26份不同桑樹品種的桑葉之間總黃酮含量差距大,總黃酮含量分布在0.906%～6.619%之間,大多數(shù)品種之間均存在顯著差異(P<0.05)。其中總含量最高的品種是川98-1(6.619%),其次是豐田14號(6.181%)、豐田2 號(4.599%)。含量最低的品種是新一之(0.906%),與含量最高的品種相比相差7倍多。如圖1所示,對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析(S-W檢驗(yàn)),26份不同桑樹品種的桑葉總黃酮含量分布不符合正態(tài)分布(P<0.05),大多數(shù)供試品種桑葉的總黃酮含量分布在2.00%～4.60%之間,占所測定樣本數(shù)的76.92%。其中川98-1和豐田14號2個品種的總黃酮含量均超過了6.0%。

圖1 26份不同桑樹品種的桑葉總黃酮含量分布

表2 26份不同桑樹品種的桑葉總黃酮含量 %

2.2 不同桑樹品種的桑葉1-DNJ含量

從表3可以看出,26份不同桑樹品種的桑葉1-DNJ含量差距較大,1-DNJ含量分布在0.039 5%～0.180 4%之間,大多數(shù)品種之間均存在顯著差異(P<0.05)。其中含量最高的品種是荊桑(0.180 4%),其次是無核大十果桑(0.175 9%)、臺灣長果桑(0.144 7%)。含量最低的品種是湘 7920(0.039 5%),與含量最高的品種相比相差4倍多。如圖2所示,對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析(S-W檢驗(yàn)),26份不同桑樹品種的桑葉1-DNJ含量分布不符合正態(tài)分布(P<0.05)。大多數(shù)供試品種桑葉的1-DNJ分布在0.04%～0.12%之間,占所測定樣本數(shù)的84.62%。其中荊桑和無核大十果桑2個品種1-DNJ含量均超過了0.175 0%。

圖2 26份不同桑樹品種的桑葉1-DNJ含量分布

表3 26份不同桑樹品種的桑葉1-脫氧野尻霉素(1-DNJ)含量 %

3 小結(jié)與討論

品種是影響桑葉活性成分含量的重要因素。張麗麗等[10]對11個桑樹品種進(jìn)行研究顯示,不同桑樹品種桑葉黃酮類與生物堿類活性成分差異較大。宋志姣等[11]對保山地區(qū)12個桑樹品種活性成分進(jìn)行測量評價,結(jié)果表明各品種間活性成分含量差異顯著。本論文以總黃酮、1-DNJ為指標(biāo)成分,對四川省主要栽種的26份桑樹品種資源的桑葉活性成分含量進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示各品種間總黃酮與1-DNJ的含量均存在明顯種間差異,這與前人的研究結(jié)果一致。其中,供試品種桑葉的總黃酮含量分布在0.906%～6.619%之間,含量最高的品種是川98-1(6.619%),其次是豐田14號(6.181%)、豐田2號(4.599%),含量最低的是新一之(0.906%),含量最高品種與含量最低品種之間相差7倍以上。1-DNJ含量分布在0.039 5%～0.180 4%之間,含量最高的品種是荊桑(0.180 4%),其次是無核大十果桑(0.175 9%)、臺灣長果桑(0.144 7%),含量最低的是湘7920(0.039 5%),含量最高品種與含量最低品種之間相差4倍以上。但荊桑作為野生桑,葉片產(chǎn)量少且葉質(zhì)粗糙堅韌,不適合用于養(yǎng)蠶,經(jīng)濟(jì)價值低[12]。出于促進(jìn)蠶桑產(chǎn)業(yè)多元化發(fā)展的目的,川98-1、豐田14號、無核大十果桑、臺灣長果桑等更適合作為蠶區(qū)推廣種植的品種。

優(yōu)質(zhì)的桑樹品種是蠶桑產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的保證,桑樹資源多元化利用是促進(jìn)蠶桑產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)。本文通過篩選四川省部分優(yōu)質(zhì)桑樹資源,為桑葉總黃酮、1-DNJ開發(fā)應(yīng)用及品種選育提供了理論基礎(chǔ)研究,并為四川省推廣桑樹栽培品種和其綜合利用提供了技術(shù)支持。