徐謙，張圣美，黃宗安，鐘偉杰，唐征

(溫州科技職業(yè)學院/溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院 浙南作物育種重點實驗室 溫州特色作物生物技術(shù)創(chuàng)新重點實驗室，浙江 溫州 325006)

青花菜(Brassicaoleracealvar.italica)又名綠菜花、木莖花椰菜，俗稱西蘭花，原產(chǎn)于地中海東部沿岸地區(qū)，為十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，一二年生草本植物。以肥嫩短縮的花枝和花蕾作為食用部分，營養(yǎng)豐富，風味極佳，且含有抗癌類芥子油苷[1]，已成為我國有發(fā)展前途的鮮用或加工出口創(chuàng)匯的重要蔬菜品種之一。近年來隨著消費需求逐年增加，種植面積不斷擴大，輪作倒茬時限逐漸縮短，黑腐病的危害呈逐年加重的趨勢。十字花科黑腐病由革蘭氏陰性植物病原菌野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonascampestrispv.Campestris，Xcc)引起，是一種能使全球范圍內(nèi)所有十字花科植物形成黑腐病的重要病害[2]，染病后引起葉脈變黑、葉片枯死，影響植株光合作用，造成產(chǎn)量和花球品質(zhì)的下降，對甘藍類蔬菜的生產(chǎn)危害極大[3-4]。中國不是青花菜原產(chǎn)地，種質(zhì)資源較為匱乏，抗病材料尤其稀缺，利用抗病相關(guān)基因培育新種質(zhì)是解決這一問題的重要途徑。

作為轉(zhuǎn)錄因子中的一大類，WRKY轉(zhuǎn)錄因子存在于所有的植物中，擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有74個，水稻(Oryzasativa)中有109個，甘藍(Brassicaoleracealvar．oleracea)中有148個成員[5-8]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物的諸多生物學過程，在生長發(fā)育、非生物脅迫和生物脅迫的調(diào)控過程中起著重要作用[9]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與病原菌的脅迫響應，例如，擬南芥中的AtWRKY38、AtWRKY46、AtWRKY53、AtWRKY54、AtWRKY62和AtWRKY70均參與植物對丁香假單胞菌的抗性調(diào)控[10-12]；結(jié)球白菜的8個成員在胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)的侵染下差異表達，另有5個成員的表達受鐮刀霉菌的誘導[13]；甘藍型油菜中有21個WRKY基因響應根腫菌脅迫且在根腫病抗病和感病品種中差異表達[14]；蕪菁BrWRKY46-2、BrWRKY70-2參與根腫菌響應過程，與蕪菁品種抗病和感病密切相關(guān)并受水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)的強烈誘導[15]；青花菜中，BoWRKY2、BoWRKY3、BoWRKY6和BoiWRKY7的表達都受霜霉菌誘導升高，BoWRKY6過表達植株表現(xiàn)出對霜霉病的抗性，BoWRKY2和BoiWRKY7還分別受核盤菌和野油菜黃單胞菌誘導升高[16-18]。本研究以青花菜為材料，在克隆BoiWRKY15的基礎上進行序列分析，利用熒光定量 PCR檢測其組織定位與在野油菜黃單胞菌侵染下的表達，為將來開展該基因的功能研究和分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

以青花菜自交系青12為試驗材料，于育苗大棚中培養(yǎng)至四葉一心期。采用噴霧法接種野油菜黃單胞菌，濃度為1×108CFU·mL-1，對照采用等量的無菌水。收集接種0、1、3、5和7 d時的葉片，用于RNA的提取。青12種子消毒后于MS培養(yǎng)基萌發(fā)生長7 d，幼苗分根冠取材、田間種植的青12植株于花期取花蕾、花和幼嫩角果用作組織表達分析。取材后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。幼苗葉片也用于基因組DNA的提取。

植物基因組DNA提取試劑盒、植物RNA提取試劑盒購自百泰克生物技術(shù)有限公司；Phanta?Max Super-Fidelity DNA聚合酶、5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit克隆試劑盒、Fast-T1感受態(tài)細胞、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA合成試劑盒、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。引物由華大基因合成。

1.2 DNA、RNA提取與基因克隆

按照試劑盒方法要求，提取純化分離DNA和RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

分別以青花菜基因組DNA和cDNA為模板，5′-ATGGCGGTGGAGCTCATGA-3′和5′-TCAAGACG ATTCCAAAATGAG-3′為上游與下游引物，引物用無菌水配制成濃度為10 μmol·L-1的溶液備用。目標基因的擴增體系為50 μL，包括 5×SF Buffer 10 μL，1 μL dNTP(10 mmol·L-1)，上下游引物各2 μL(10 mmol·L-1)，1 μL模板和1 μL Phanta Super-Fidelity DNA酶(1 U·μL-1)。程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 變性20 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30次循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一條帶，直接連接克隆載體，轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌感受態(tài)細胞，隨機挑選多個陽性克隆送華大基因進行測序，測序結(jié)果與NCBI比對。

1.3 基因序列分析

測序結(jié)果的核苷酸序列用DNAMAN等軟件進行分析，利用在線軟件 ProtParam(https：//web.expasy.org/protparam/)進行蛋白質(zhì)分子量、等電點、不穩(wěn)定系數(shù)等分析；利用ProtScale(https：//web.expasy.org/protscale/)進行親疏水性分析；采用SMART在線工具(http：//smart.embl.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1)進行蛋白保守域分析，勾選PFAM domains選項；利用Cello(http：//cello.life.nctu.edu.tw/)進行亞細胞定位預測；采用DeepTMHMM(https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM)進行跨膜結(jié)構(gòu)預測。將獲得的序列結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析，利用DNAMAN對相似蛋白序列進行同源比對。利用MEGA6.06軟件以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自舉檢測(Bootstrap)次數(shù)設為 1 000，并生成報告圖形。

1.4 基因的表達分析

根據(jù)測序得到的基因序列，設計上下游引物5′-AGCATCTCCACAACGGAAAC-3′、5′-TTCTTGGA GCAATGACAACG-3′用于表達分析，以肌動蛋白基因5′-GACAACTTACAACTCCATCAT-3′和5′-CTCAT ACGGTCAGCGATA-3′為內(nèi)參基因[19]。ABi7500實時熒光定量PCR儀用于PCR反應，反應體系包括：2×Master Mix 10 μL，模板 2.0 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各 0.4 μL，cDNA 1 μL，用水補充體積至 20 μL。反應參數(shù)：95 ℃，10 s；95 ℃，5 s；60 ℃，1 min(40 循環(huán))；基因相對表達量采用2-△△CT法[20]計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoiWRKY15基因的克隆

分別以青花菜基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，利用PCR對青花菜BoiWRKY15基因全長進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，獲得片段的長度均為1 000 bp左右(圖1)。經(jīng)克隆后進行測序，測序結(jié)果在NCBI上進行比對，顯示BoiWRKY15編碼區(qū)序列與野甘藍(Brassicaoleraceavar.oleracea)WRKY15(XM_013778166.1)和青花菜BOLC4T26829H完全一致。編碼區(qū)全長為996 bp，編碼331個氨基酸?；虻腄NA全長1 058 bp，具有2個長度均為31 bp的內(nèi)含子，內(nèi)含子符合GT-AG規(guī)則。

2.2 序列特征分析

對推導的蛋白質(zhì)序列進行結(jié)構(gòu)功能域分析發(fā)現(xiàn)，BoiWRKY15具有1個Plant_Zn_Clust和1個WRKY結(jié)構(gòu)域，分別位于氨基酸的205～251和253～313處；WRKY結(jié)構(gòu)域中的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，可用通式C-X5-C-X23-H-X-H(X為任意氨基酸)表示(圖2)。

ProtParam在線分析BoiWRKY15的氨基酸序列得知，分子式為C1544H2479N469O488S13，預測蛋白質(zhì)分子量3 5 837.30 ku，理論等電點為9.75，不穩(wěn)定系數(shù)為58.32，系不穩(wěn)定蛋白。該基因編碼的多肽中蘇氨酸(Ser)含量最高，占總氨基酸的16.3%，其次為丙氨酸(Ala)，約為9.7%。其總疏水平均系數(shù)(GRAVY)為-0.517，親水性氨基酸比例較高，與ProtScale分析結(jié)果具有一致性，可知該蛋白為親水性蛋白(圖3)。

圖3 BoiWRKY15的親疏水性預測

Cello分析結(jié)果表明，BoiWRKY15定位于細胞核；跨膜結(jié)構(gòu)域預測表明，BoiWRKY15不具有跨膜結(jié)構(gòu)域。這與其作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用一致。

2.3 氨基酸序列多重比對及聚類分析

在GenBank中，青花菜BoiWRKY15的氨基酸序列與眾多十字花科植物的WRKY15蛋白序列具有較高的相似度，如野甘藍(Brassicaoleraceavar.oleracea)XP_013633620.1、甘藍型油菜(Brassicanapus)XP_013686177.2、蕪菁(Brassicarapa)NP_001288916.1、蘿卜(Raphanussativus)XP_018477660.1、山崳菜(Eutremasalsugineum)XP_006404816.1、玉山筷子芥(Arabidopsislyratasubsp.lyrata)XP_002878677.1、亞麻薺(Camelinasativa)XP_010429281.1、XP_010417085.1、擬南芥(Arabidopsisthaliana)NP_179913.1和薺(Capsellarubella)XP_006294625.1。將青花菜BoiWRKY15與這些已知WRKY15蛋白進行多重比對，結(jié)果表明，不同物種間的WRKY結(jié)構(gòu)域具有高度相似性，它們的核心序列均為WRKYGQK，11個WRKY結(jié)構(gòu)域序列僅玉山筷子芥和蘿卜有兩處氨基酸差異(圖4)。

利用 MEGA 軟件計算遺傳距離，結(jié)果表明，這11條氨基酸序列的遺傳距離為 0～0.145，青花菜與野甘藍之間的遺傳距離最低，青花菜和薺的遺傳距離最高(表1)。圖5展示的家族系統(tǒng)進化關(guān)系分析表明，青花菜與野甘藍的進化關(guān)系最近，二者與甘藍型油菜、蘿卜、蕪菁可以歸為一組，擬南芥和玉山筷子芥歸為一組，亞麻薺和薺為一組，山萮菜自成一組。

表1 青花菜BoiWRKY15及其同源序列的遺傳距離

圖5 青花菜BoiWRKY15及同源序列系統(tǒng)進化關(guān)系分析

2.4 表達分析

為明確青花菜BoiWRKY15的組織表達，通過qRT-PCR檢測青花菜BoiWRKY15在幼苗根、冠，花期花蕾、花和幼嫩角果中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青花菜BoiWRKY15在苗期根冠中都有表達，根部表達略高于冠部，而在生殖器官中的表達都高于苗期營養(yǎng)器官，在開放的花和幼嫩角果中的表達量遠高于苗期根冠中的表達(圖6中A)。

A—組織表達；B—野油菜黃單胞菌侵染下表達。圖6 青花菜BoiWRKY15基因的表達情況

而BoiWRKY15在野油菜黃單胞菌侵染下的表達模式檢測結(jié)果表明，BoiWRKY15受野油菜黃單胞菌誘導，基因表達水平持續(xù)升高(圖6中B)。0～3 d增長緩慢，而5～7 d表達量顯著上升。

3 討論

WRKY是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含約60個氨基酸，氨基端包含高度保守的WRKYGQK(色-精-賴-酪-甘-谷氨酰胺-賴氨酸)基序，并因此得名[21]，羧基端含有一個類鋅指結(jié)構(gòu)的基序(CX4-7CX22-23HXH/C)[22]。依據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)特點，WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3組，Group Ⅰ包含兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，Group Ⅱ和Ⅲ僅有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，Group Ⅰ和Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子中的鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2，而Group Ⅲ為C2HC[23]。本研究中，克隆得到的青花菜BoiWRKY15，它的序列與野甘藍WRKY15最為接近，編碼蛋白序列具有1個典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，特征序列為 WRKYGQK，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，屬于Group Ⅱ。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展成熟，大量WRKY家族成員逐漸被鑒定、分離和表達。已有大量研究發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子響應多種生物和非生物的響應，參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程。在青花菜BoiWRKY15的同源基因中，已報道擬南芥AtWRKY15受活性氧誘導以調(diào)節(jié)植物生長和鹽/滲透脅迫反應，在AtWRKY15過表達植株中，受刺激的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細胞核通訊被聯(lián)系起來，從而在鹽脅迫條件下破壞線粒體應激反應[24]。在油菜中，BnWRKY15過表達可能通過下調(diào)受菌核菌誘導的BnWRKY33的表達而增加了甘藍型油菜對菌核病的易感性[25]。本研究中，青花菜BoiWRKY15基因的表達受野油菜黃單胞菌的誘導升高，暗示該基因可能與黑腐病抗性相關(guān)，同時，該基因在花中的高表達暗示其參與生長發(fā)育過程，具體作用需要進一步構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物株系來進行功能驗證。

本研究克隆了青花菜BoiWRKY15基因，并對其結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)進化、亞細胞定位預測及表達模式進行了分析，該基因表達受野油菜黃單胞菌的誘導，推測其參與抗性響應。為后續(xù)研究青花菜BoiWRKY15的功能和作用機制奠定了基礎。