張玉，李雪，王偉，白麗萍，王君虹

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021；3.浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

金針菇(Flammulinavelutipes)學(xué)名毛柄金錢菌，為擔(dān)子菌綱、傘菌目、口蘑科、金錢菌屬[1]。金針菇營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維等多種營(yíng)養(yǎng)成分以及多糖、多酚、萜類等生物活性成分，具有抵抗衰老、降血脂、提高人體免疫力、抗腫瘤等多種生理功能[2-7]。

近年來(lái)，對(duì)于金針菇中營(yíng)養(yǎng)成分提取和利用方面的研究越來(lái)越受到重視，但主要集中在金針菇多糖提取鑒定以及功能活性方面[7-9]。對(duì)于金針菇蛋白的精準(zhǔn)利用研究報(bào)道較少。金針菇富含蛋白，蛋白質(zhì)含量占干物質(zhì)的31%，含有17種人體所需要的氨基酸，其中8種必需氨基酸，占金針菇氨基酸總量的49.29%～51.17%[10]。

生物活性肽是氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的多肽，可以通過(guò)酶解食物蛋白質(zhì)獲得，有研究發(fā)現(xiàn)多肽具有抗氧化、降血糖、抗炎等生理活性[11-15]，目前對(duì)于金針菇蛋白的開(kāi)發(fā)利用研究主要是以氨基酸含量、可溶性固形物得率或多肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)[16-18]。本研究以抑制羥自由基能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇蛋白肽酶解制備條件，建立金針菇蛋白源抗氧化肽最佳制備技術(shù)，可為金針菇的高值化利用及抗氧化肽的制備提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇，購(gòu)于杭州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；酸性蛋白酶(100 U·mg-1)，上海鼎芬化學(xué)科技有限公司；堿性蛋白酶(100 U·mg-1)，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；中性蛋白酶(100 U·mg-1)、木瓜蛋白酶(800 U·mg-1)和胃蛋白酶(30 U·mg-1)，上海源葉生物科技有限公司；羥自由基測(cè)定試劑盒和總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Perkin Elmer 公司；MTYK-MI805 pH計(jì)，北京中慧天誠(chéng)科技有限公司；HZQ-B恒溫培養(yǎng)搖床，蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；HH-4 數(shù)顯單列四孔水浴鍋，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；H-1650 型高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；冷凍干燥儀，F(xiàn)D-A10N-50上海皓莊儀器有限公司。

1.3 金針菇肽的制備

金針菇蛋白提取：采用堿溶酸沉法提取金針菇蛋白，稱取一定量金針菇干粉，按質(zhì)量比1∶20加0.5%的氫氧化鈉溶液，50 ℃超聲60 min，4 000 r·min-1離心15 min，棄去沉淀，上清液以HCl溶液調(diào)pH值至4.5，離心，去除上清液，沉淀調(diào)節(jié)pH值至7，真空冷凍干燥，得金針菇蛋白。

金針菇蛋白酶解肽制備：稱取5.0 g的金針菇蛋白粉于150 mL錐形瓶中，以水底比15 mL·g-1加入蒸餾水?dāng)嚢杌靹?，至酶的最適pH值(酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶pH值分別為3、9、7、6、2)后，加入3%的蛋白酶混合均勻，放入搖床中以150 r·min-1的轉(zhuǎn)速酶解4 h，酶解溫度酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶分別為40、45、45、55、37 ℃，酶解過(guò)程中保持pH值穩(wěn)定。酶解結(jié)束后，沸水浴5 min使酶失活，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值至7.0，4 000 r·min-1離心20 min，取上清液真空冷凍干燥后，配成5.0 mg·mL-1溶液，待測(cè)活性。

1.4 抗氧化能力的測(cè)定

抑制羥自由基能力和總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定采用試劑盒法，具體按試劑盒給出的測(cè)定步驟進(jìn)行。

1.5 單因素酶解條件優(yōu)化

以酶底比3%、水底比15 mL·g-1、酶解溫度45 ℃、酶解體系pH值9.0、酶解時(shí)間4 h為基本固定因素，改變其中1個(gè)因素，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，比較不同酶解條件對(duì)蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響。各因素梯度設(shè)計(jì)為：酶底比(1%、2%、3%、4%、5%)，水底比(10、15、20、25、30 mL·g-1)，酶解溫度(25、35、45、55、65 ℃)，酶解體系pH值(7、8、9、10、11)，酶解時(shí)間(2、3、4、5、6 h)。

1.6 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解溫度、pH值、時(shí)間作為待優(yōu)化因子，按中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(CCD)原理，采用Design Experts 8.0軟件進(jìn)行3因素5水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化金針菇蛋白的酶解條件。以抑制羥自由基能力作為響應(yīng)值，試驗(yàn)因子水平如表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶選擇

不同蛋白酶的酶切專一性不同，所得酶解肽段不同，不同肽段的活性也有所差異。選擇酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以酶底比3%，水底比15 mL·g-1，在最適pH 值和溫度條件下，酶解4 h。結(jié)果表明，不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的抑制羥自由基能力不同，經(jīng)堿性蛋白酶酶解所得金針菇蛋白肽的抑制羥自由基能力最高(圖1)，因此，選擇堿性蛋白酶作為金針菇蛋白原抗氧化肽制備的蛋白酶。

同系列柱上無(wú)相同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖1 不同蛋白酶對(duì)金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶底比對(duì)蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響

分別以酶底比1%、2%、3%、4%和5%對(duì)金針菇蛋白進(jìn)行酶解，考察酶底比對(duì)金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)酶底比為1%～3%時(shí)，隨著酶底比的增加，蛋白酶解肽的抑制羥自由基能力上升，酶底比至3%以后，抑制羥自由基能力變化趨于平緩，不同酶底比之間差異不顯著(P<0.05)，可能是由于蛋白濃度固定，3%的酶已達(dá)到飽和，進(jìn)一步增加酶，對(duì)反應(yīng)速率影響變小，所以選擇酶底比3%作為適宜酶濃度。

圖2 酶底比對(duì)金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2.2 水底比對(duì)蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響

分別以水底比10、15、20、25和30 mL·g-1對(duì)金針菇蛋白進(jìn)行酶解，考察不同水底比對(duì)金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)水底比為10 mL·g-1的時(shí)候，所得蛋白酶解肽抑制羥自由基能力相對(duì)較低，水底比為15 mL·g-1時(shí)所得蛋白酶解肽抑制羥自由基能力提高，而后隨著水底比增加，所得蛋白酶解肽的抑制羥自由基能力差異不顯著(P<0.05)，可能是水底比為10 mL·g-1時(shí)，蛋白濃度過(guò)高，影響酶和底物的接觸，當(dāng)水底比達(dá)到15 mL·g-1時(shí)，酶和底物接觸良好，再增加水對(duì)其影響較少，故選擇水底比為15 mL·g-1作為適宜酶解條件。

圖3 水底比對(duì)金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2.3 酶解溫度對(duì)蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響

溫度是影響酶活性的重要因素，當(dāng)溫度升高時(shí)，酶促反應(yīng)速率加快，而當(dāng)超過(guò)一定溫度后，酶受熱變性，其活力減弱，則酶促反應(yīng)速率降低。分別以酶解溫度25、35、45、55和65 ℃對(duì)金針菇蛋白進(jìn)行酶解，考察不同溫度對(duì)金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結(jié)果如圖4所示，隨著酶解溫度的升高，蛋白酶解肽的抑制羥自由基能力呈先上升后下降的趨勢(shì)，45 ℃下所得蛋白酶解肽抑制羥自由基能力最高，與其他溫度差異顯著(P<0.05)，所以選擇45 ℃作為適宜酶解溫度。

圖4 酶解溫度對(duì)金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2.4 pH值對(duì)酶解肽抑制羥自由基能力的影響

pH值能通過(guò)影響底物分子和酶分子的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶與底物的結(jié)合，影響酶解速率，不同的酶具有不同的最適pH值。分別以酶解體系pH值7、8、9、10和11對(duì)金針菇蛋白進(jìn)行酶解，考察不同pH值對(duì)金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)pH值為8時(shí)，所得金針菇蛋白酶解肽的抑制羥自由基能力最高，與pH值為7時(shí)差異顯著(P<0.05)，因此，選擇pH值8為適宜酶解條件。

圖5 pH值對(duì)金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)酶解肽抑制羥自由基能力的影響

分別以酶解時(shí)間2、3、4、5和6 h對(duì)金針菇蛋白進(jìn)行酶解，考察不同酶解時(shí)間對(duì)金針菇蛋白酶解肽抑制羥自由基能力的影響，結(jié)果如圖6所示。隨著酶解時(shí)間的增加，蛋白酶解肽抑制羥自由基能力呈先上升后下降的趨勢(shì)，在4 h時(shí)達(dá)到最高，與酶解3 h差異顯著(P<0.05)，而后有所下降，可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，一些具有活性的肽進(jìn)一步被水解，因此，選擇4 h為適宜酶解時(shí)間。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)金針菇蛋白肽抑制羥自由基能力的影響

2.3 響應(yīng)面分析方法

在實(shí)際酶解過(guò)程中，各因素相互之間可能會(huì)存在互作影響，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，水底比和酶底比達(dá)到一定程度后對(duì)酶解產(chǎn)物的影響不顯著，且水底比過(guò)高，對(duì)于后續(xù)干燥工藝將增加較高成本，因此，選擇酶解溫度、pH值和酶解時(shí)間為試驗(yàn)因子，進(jìn)一步考察各因素之間對(duì)目標(biāo)值的相互影響，按照中心點(diǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，設(shè)計(jì)了20組試驗(yàn)來(lái)擬合相應(yīng)曲面的各點(diǎn)，試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。利用Design Experts軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得抑制羥自由基能力與A(酶解溫度)、B(pH值)和C(酶解時(shí)間)之間的二次多項(xiàng)式回歸方程為：Y=71.41-0.73A+3.35B+1.11C-0.76AB-0.96AC-0.56BC-6.58A2-5.22B2-3.86C2(R2=0.989 5)

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果

由表3的方差分析結(jié)果可知，所得回歸模型的F值為104.59，P<0.000 1，說(shuō)明回歸模型具有高度的顯著性，失擬項(xiàng)P值為0.204 9，表明該模型失擬不顯著，回歸方程模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性好，可靠性較高，可以用此模型對(duì)金針菇蛋白酶解效果進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。酶解溫度和酶解時(shí)間的交互作用顯著，表明適當(dāng)?shù)恼{(diào)整酶解溫度和時(shí)間，有助于所得活性肽抑制羥自由基能力的提高。各因素相互影響曲面圖和等高線圖見(jiàn)圖7，結(jié)果顯示，本研究的目標(biāo)最高值在中心點(diǎn)附近，中心點(diǎn)設(shè)置合理。

圖7 響應(yīng)面圖和等高線圖

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果

經(jīng)Design Experts分析，所得模型最佳酶解條件為A(酶解溫度)=-0.08，B(pH值)=0.32，C(酶解時(shí)間)=0.13，所對(duì)應(yīng)的實(shí)際條件為酶解溫度為44.2 ℃，pH值為8.32，酶解時(shí)間4.13 h，水底比15 mL·g-1、酶底比3%，模型預(yù)測(cè)此條件下所得酶解產(chǎn)物抑制羥自由基能力為72.0 U·mL-1。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)值的可靠性，在所得最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得酶解肽抑制羥自由基能力為72.9 U·mL-1。說(shuō)明此響應(yīng)面分析法優(yōu)化所得參數(shù)條件準(zhǔn)確可靠。

3 討論與結(jié)論

羥基自由基和超氧陰離子等自由基都是通過(guò)不同的代謝反應(yīng)產(chǎn)生的，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，但過(guò)量的自由基可與生物大分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，引發(fā)多種健康問(wèn)題[19-21]。抗氧化劑可通過(guò)向自由基提供電子，清除過(guò)多的自由基[22]。由于合成抗氧化劑具有一定的毒性，隨著人們對(duì)健康的關(guān)注，天然抗氧化劑已成為研究熱點(diǎn)，目前已從動(dòng)植物中獲得了多種抗氧化肽[20-23]。金針菇富含蛋白，目前對(duì)金針菇及金針菇蛋白酶解工藝已有部分研究，李桂峰等[15]通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)金針菇蛋白酶解制備抑菌肽的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，林群英等[18]以可溶性固性物的得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了金針菇酶解條件，并研究了最終酶解物對(duì)線蟲(chóng)氧化應(yīng)激能力的影響，該研究所用材料為金針菇，所得酶解產(chǎn)物成分復(fù)雜，產(chǎn)物凍干粉中蛋白含量?jī)H為24.35%。本研究以金針菇蛋白為原料，研究金針菇蛋白制備抗氧化肽的最佳條件，由于不同蛋白酶的底物特異性不同，酶解蛋白所得的產(chǎn)物也就不同，因此，實(shí)驗(yàn)以酶解所得肽的抑制羥自由基能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，堿性蛋白酶酶解所得蛋白酶解肽抑制羥自由基能力最佳。因此，選擇堿性蛋白酶通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)酶底比、酶解溫度、時(shí)間、pH值和水底比等酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳單因素條件為酶解溫度45 ℃，pH值8，酶解時(shí)間4 h，酶底比3%，水底比15 mL·g-1。

由于不同酶解工藝參數(shù)之間可能會(huì)存在交互作用，響應(yīng)面分析法是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析預(yù)測(cè)最優(yōu)參數(shù)，它具有預(yù)測(cè)準(zhǔn)確、精度高等優(yōu)點(diǎn)，已在動(dòng)植物源蛋白酶解肽制備研究方面進(jìn)行了一定的應(yīng)用[16，24-25]，本實(shí)驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)所得酶解肽的抗氧化活性最大化。所得最佳酶解實(shí)際條件為：堿性蛋白酶，酶解溫度44.2 ℃，pH值8.32，酶解時(shí)間4.13 h，酶底比3%，水底比15 mL·g-1。對(duì)此最佳實(shí)驗(yàn)條件下所得金針菇蛋白酶解肽進(jìn)行活性測(cè)定，其抑制羥自由基能力與預(yù)測(cè)值具有較高的吻合度，說(shuō)明該模型具有較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，可用于金針菇蛋白源抗氧化肽的制備工藝優(yōu)化。所得金針菇蛋白酶解肽在5.0 mg·mL-1時(shí)，抑制羥自由基能力為72.9 U·mL-1，總抗氧化能力為9.6 U·mL-1，具有較好的抗氧化能力，因此，經(jīng)蛋白酶消化后的金針菇蛋白具有更廣闊高附加值應(yīng)用前景，所得的最佳酶解工藝可為金針菇蛋白精深加工及高值化利用提供一定的研究基礎(chǔ)。