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(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南 250300；2. 山東省食品藥品審評查驗中心，山東濟南 250013)

鎘(Cd)是常見的土壤重金屬污染物之一，化學(xué)活性和生物毒性很強，易被植物吸收累積并通過食物鏈進入人體[1]。 長期接觸鎘會導(dǎo)致認知能力下降、生殖缺陷、骨損傷和糖尿病等，甚至增加致癌風(fēng)險[2-3]。 根系是植物從外界吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官，根系吸收是重金屬進入植物體的主要途徑[4]。 研究鎘脅迫條件下藥用植物根系的響應(yīng)，對于調(diào)控藥用植物對鎘的吸收、控制植物類中藥材的重金屬污染具有重要作用。

植物類中藥材在生長過程中容易受到環(huán)境的影響而出現(xiàn)質(zhì)量安全問題，如重金屬鎘污染等。目前，中藥材鎘污染現(xiàn)狀總體較為嚴重，且常用中藥材中鎘超標(biāo)率遠超鉛、砷、汞、銅4 種元素[5-6]。

金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonicaThunb.)的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效[7]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、保健品等領(lǐng)域。 研究表明忍冬具有鎘超富集特性，能夠過量吸收生長環(huán)境中的鎘[8]。 但目前忍冬鎘富集的相關(guān)研究多從植物整體的生理生態(tài)特征、積累特性等方面入手[9-11]，對鎘脅迫下忍冬根系響應(yīng)的研究則較為少見。 本研究以忍冬為材料，分析不同濃度鎘脅迫下其根系形態(tài)及根系分泌物的變化，以探明鎘脅迫下忍冬根系的響應(yīng)機制，為金銀花品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為華金6 號忍冬扦插苗，2022年3月在山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園扦插。 盆栽基質(zhì)為市售水洗石英砂，粒徑1～2 mm，使用前用2.5%硝酸浸洗24 h 以去除可能存在的重金屬離子，之后用自來水反復(fù)清洗石英砂至洗液pH 值恒定，晾干備用。 試驗用塑料花盆口徑20 cm、底徑18 cm、高15 cm，盆底帶孔，內(nèi)襯黑色塑料袋防止石英砂漏出，塑料袋底部扎小孔便于營養(yǎng)液流出，防止?jié)澈Α?/p>

1.2 試驗設(shè)計

盆栽試驗于2022年7—8月在山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園進行。 選擇生長健壯、長勢一致的忍冬幼苗，小心清洗根部附著的泥土后移栽入裝有2 kg 石英砂的塑料花盆中，每盆1 株。 移栽后進行為期14 天的適應(yīng)性處理，期間每天澆1/2 Hoagland營養(yǎng)液(pH ＝6.0)以保持石英砂濕潤。 適應(yīng)性處理結(jié)束后進行鎘脅迫處理，14 天內(nèi)每天澆灌含鎘營養(yǎng)液。 鎘元素以CdCl2·2.5H2O的形式加入1/2Hoagland 營養(yǎng)液中。 共設(shè)置5個鎘脅迫處理濃度:0(CK)、5、10、25、50 mg·L-1。試驗采取完全隨機設(shè)計，各濃度處理設(shè)置8個重復(fù)，共40 盆。 盆栽砂培試驗在藥用植物園露天環(huán)境中進行，并做避雨處理。

鎘脅迫結(jié)束后對照組及各處理組隨機選擇3株收獲，采用離位溶液培養(yǎng)法收集根系分泌物[12]，用0.45 μm 微孔濾膜慢速過濾后于4 ℃低溫保存，用于根系分泌物分析。 剪取植株完整根系，用于根系形態(tài)指標(biāo)分析。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 忍冬根系形態(tài)分析通過Zeutschel OS 15000 掃描儀獲取根系形態(tài)的黑白掃描圖，分辨率設(shè)置為300 dpi，使用Rhizo Vision Explorer 2.0.3處理根系掃描圖，獲取根系總長、根系平均直徑、根系表面積、根系體積等數(shù)據(jù)。

1.3.2 忍冬根系分泌物分析pH 值使用pH 計測定。 可溶性糖采用蒽酮法測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 低分子量有機酸(LWMOAs)采用HPLC 法測定:精確吸取5 mL 根系分泌物溶液，凍干后以500 μL KH2PO4(pH＝2.4)溶液復(fù)溶，使用Waters e2695 高效液相色譜(配備2998 PDA 檢測器)測定草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、丙二酸、檸檬酸、馬來酸、琥珀酸、富馬酸共9種有機酸含量。

檢測方法參照商慧文等[13]的方法并稍作修改。 色譜條件:Agilent ZORBAX XDB-C18 色譜柱(250 × 4.6 mm，5 μm)；流動相A 相為25 mmol·L-1KH2PO4(93%)，B 相為7%甲醇；等梯度洗脫，洗脫時間15 min，流速0.7 mL·min-1；進樣量20 μL；柱溫(25±5) ℃；檢測波長210 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用Microsoft Excel 2019 進行試驗數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計，SPSS Statistics 26 軟件進行單因素方差分析，Duncan’s 法(P＜0.05)進行顯著性檢驗，Origin 2021 制圖，試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n ＝3)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鎘脅迫下忍冬根系形態(tài)的變化

由表1 可以看出，忍冬根系總長隨著鎘濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，鎘濃度10 mg·L-1時達到最大值，較對照(CK)增加184.46%，鎘濃度50 mg·L-1時根系總長下降24.80%，差異均達顯著水平，表明高濃度鎘對根的生長產(chǎn)生抑制作用。忍冬根系表面積、體積表現(xiàn)出與根系總長相似的變化趨勢，兩項指標(biāo)均在鎘濃度10 mg·L-1時值最大，其中根系表面積比CK 增加168.51%，根系體積比CK 增加146.00%；高濃度鎘脅迫下根系表面積、體積相較于CK 均有所下降，但差異不顯著。 與上述三項指標(biāo)不同，忍冬根系平均直徑總體呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，鎘濃度10 mg·L-1時其值最小，50 mg·L-1時值最大，比CK 增加18.92%，但處理組間差異均不顯著。

表1 不同濃度Cd 脅迫下忍冬根系形態(tài)的變化(n＝3)

2.2 不同濃度鎘脅迫下忍冬根系分泌物的變化

2.2.1 根系分泌物pH 值的變化植物根系分泌物pH 值與根際環(huán)境中鎘的存在形式及可利用度有關(guān)，因而根系分泌物pH 值的變化能夠在一定程度上反映植物對鎘的吸收情況。 由表2 可知，在不同濃度鎘脅迫下，忍冬根系分泌物的pH 值整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在鎘濃度10 mg·L-1時達到最大值，50 mg·L-1時值最小，但處理間差異并不顯著。

表2 不同濃度Cd 脅迫下忍冬根系分泌物的pH 值及可溶性糖含量(n＝3)

2.2.2 根系分泌物中可溶性糖含量的變化由表2 可知，不同濃度鎘脅迫下忍冬根系分泌物中可溶性糖含量處理間有顯著差異。 其中，鎘濃度≤10 mg·L-1時可溶性糖含量較CK 略微升高，但差異不顯著；鎘濃度≥25 mg·L-1時可溶性糖含量顯著下降，比CK 分別下降61.26%和92.43%。

2.2.3 根系分泌物中低分子量有機酸(LWMOAs)含量的變化如表3 所示，9 種待測低分子量有機酸中，馬來酸與富馬酸未檢出，其余7 種有機酸各處理均檢出，但不同處理間各種有機酸含量的變化差異較大。 隨著鎘濃度增加，除蘋果酸、琥珀酸含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢外，其余5種低分子量有機酸含量和有機酸總量均呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢。 其中，酒石酸、乳酸、丙二酸、檸檬酸含量均在鎘濃度5 mg·L-1時最多，較CK 分別增加199.81%、64.01%、31.97%和101.68%，50 mg·L-1時含量最少，較CK 分別降低10.66%、71.98%、42.01%和41.90%。 蘋果酸與琥珀酸含量分別在鎘濃度25 mg·L-1與10 mg·L-1時最多，較CK 分別增加148.93%和17.73%；鎘濃度5 mg·L-1時蘋果酸含量最少，50 mg·L-1時琥珀酸含量最少。 有機酸總量在鎘濃度5 mg·L-1時最多，比CK 增加41.97%。

表3 不同濃度鎘脅迫下忍冬根系分泌物中LWMOAs 含量變化(n＝3)mg·L-1

不同濃度鎘脅迫下，忍冬根系分泌物中低分子量有機酸的主要構(gòu)成有所不同。 CK 中低分子量有機酸以草酸為主，占總量的27.17%。 鎘脅迫處理中，鎘濃度5 mg·L-1時酒石酸含量占有機酸總量的23.14%；中高濃度鎘脅迫下，蘋果酸含量增加，鎘濃度10 mg·L-1時蘋果酸含量占比達23.76%，25 mg·L-1時則增至31.31%；鎘濃度增至50 mg·L-1時，忍冬根系分泌物中各有機酸組分相較于其它處理均下降。

3 討論

3.1 不同濃度鎘處理下忍冬根系形態(tài)的變化

植物根系可以通過調(diào)控側(cè)根發(fā)生、分化及生長實現(xiàn)對外界信號的響應(yīng)。 處于脅迫狀態(tài)下的植物根系能夠通過改變根系形態(tài)來適應(yīng)脅迫環(huán)境，如增大根部比表面積、增加根尖數(shù)量等，以促進自身對生長環(huán)境中無機元素的吸收[14]。 重金屬脅迫下，多數(shù)植物則會通過降低根系比表面積等方式減少對重金屬元素的吸收[15]。 相關(guān)研究表明，1 500 mg·kg-1的單一鉛脅迫會顯著降低鐵冬青的根長、根表面積及根體積[16]，過量的鎘也會顯著降低植株根長、表面積及根尖數(shù)量，并增加根的直徑[17]。 對于東南景天等超富集植物來說，鎘脅迫則會使其根尖數(shù)增多，根系比表面積增加，從而增強植物對鎘的富集能力。

本研究中，5、10 mg·L-1鎘脅迫對忍冬根系生長產(chǎn)生促進作用，根系總長、表面積、體積增加，根系平均直徑有所減小，對鎘的吸收能力增強；鎘濃度≥25 mg·L-1時，根系生長受到抑制，根系增粗，根系總長、表面積、體積下降，對鎘的吸收受到抑制。 總的來說，鎘脅迫下忍冬根系生長呈現(xiàn)出顯著的“低促高抑”現(xiàn)象，這與賈蓮等[18]的研究結(jié)果一致。

3.2 不同濃度鎘處理下忍冬根系分泌物的變化

pH 值是影響植物根際環(huán)境中重金屬生物有效態(tài)和根系對重金屬吸收的主要因素之一[19]。生長環(huán)境中較低的pH 值能夠促進植物對重金屬鎘的吸收，高pH 值則能抑制其對鎘的吸收[20]。對黑麥草的研究顯示，pH 值4.5、5.0 的弱酸性條件更有利于黑麥草對鎘的富集[21]。 本研究中，忍冬根系分泌物的pH 值隨鎘脅迫程度增加先上升后下降，但處理間差異不顯著。 這種結(jié)果可能與砂培條件下鎘的存在形式與土壤中鎘的形態(tài)差別較大，或根系分泌物收集時間過短、其pH 值不能完全體現(xiàn)植株長期生長條件下的根際環(huán)境有關(guān)。

根系分泌物中可溶性糖含量與植物對重金屬的抗性密切相關(guān)。 400 μmol·L-1鎘處理下，東南景天根系分泌物中可溶性糖的分泌量顯著高于100、200 μmol·L-1鎘處理[22]；Zu 等[23]的研究顯示，圓葉無心菜根系分泌物中可溶性糖含量與生長環(huán)境中的鉛濃度呈正相關(guān)。 可溶性糖可以通過促進根際微生物繁殖和競爭吸附限制植物對重金屬離子的吸收[24]。 本研究中，中低濃度鎘脅迫下根系分泌物中可溶性糖含量顯著高于高濃度處理。 該結(jié)果與劉周莉等[8]的研究結(jié)果相同，即低濃度鎘脅迫下忍冬根系富集系數(shù)高于高濃度脅迫，推測根系分泌的可溶性糖對植株吸收鎘有促進作用。

植物能夠通過根系向生長環(huán)境中分泌相關(guān)分泌物來響應(yīng)外界刺激[25]。 低分子量有機酸是根系分泌物中的重要成分，在植物根系對鎘的響應(yīng)中起主要作用[26]。 低分子量有機酸可以通過降低根際環(huán)境pH 值、與鎘形成易吸收的螯合物等方式促進植物對Cd 的吸收。 研究表明，金屬-LMWOAs 復(fù)合物結(jié)合的鎘占土壤Cd 總含量的40%，且與植物有效態(tài)鎘含量呈顯著正相關(guān)[27]。唐杰等[28]的研究顯示，低濃度鎘脅迫有利于水稻根系分泌有機酸，中高濃度鎘脅迫對水稻根系有機酸的分泌則有抑制作用。 本研究中，多數(shù)低分子量有機酸及有機酸總量隨鎘濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢，只有蘋果酸和琥珀酸含量呈先升后降的變化趨勢，這與根系分泌物pH 值的變化趨勢一致；隨鎘脅迫濃度逐漸上升，蘋果酸成為根系分泌物中低分子量有機酸的主要組分，顯示蘋果酸對于調(diào)控高鎘含量環(huán)境下忍冬根系的鎘吸收可能起主要作用。 這一結(jié)果與劉桂華等[29]對貴州黃壤龍葵的研究結(jié)果相同。

4 結(jié)論

隨著生長環(huán)境中鎘濃度的變化，忍冬根系表現(xiàn)出不同的響應(yīng)方式。 其中，5、10 mg·L-1低中濃度鎘脅迫下，忍冬根系總長、表面積、體積均增加，平均直徑有所下降，對鎘的吸收能力增強，根系分泌物中多數(shù)有機酸和可溶性糖含量最多；高濃度(50 mg·L-1)鎘脅迫下，忍冬根系生長受到抑制，根系分泌物中低分子量有機酸和可溶性糖含量下降。 此外，忍冬根系分泌物的pH 值隨鎘脅迫程度增大并無顯著變化。 綜上得出，忍冬可以通過改變根系形態(tài)、調(diào)整根系分泌物中低分子量有機酸(LWMOAs)構(gòu)成和含量響應(yīng)重金屬鎘脅迫，且這種響應(yīng)表現(xiàn)出一定規(guī)律性。 本研究結(jié)果可為忍冬種植與金銀花藥材質(zhì)量控制提供技術(shù)參考。