張宇董國頌張廷婷

(青島大學生命科學學院，山東青島 266071)

miRNA(microRNA)是一類長度為18 ～23個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，通過特異性mRNA 降解或翻譯抑制調(diào)控基因表達[1-2]。 研究表明，miRNA 具有多種生物活性，參與神經(jīng)、激素信號轉(zhuǎn)導等途徑，調(diào)控細胞凋亡、生長發(fā)育等過程[3-5]。 已知miRNA 廣泛存在于動植物及病毒[6-8]中，迄今，miRNA 數(shù)據(jù)庫(miRBase，http:/ /mirbase.org/)存在近300個物種的miRNA 信息，其中包含近200個植物基因組[9]。

木本植物在森林中占據(jù)主導優(yōu)勢，多分布于亞洲、歐洲以及北美各地區(qū)，具有極高的經(jīng)濟與生態(tài)價值。 目前，木本植物miRNA 及其在遺傳育種方面的研究已有報道[10]，但大部分物種的miRNA數(shù)據(jù)仍需要完善，比如黑松的基因組測序尚未報道，其轉(zhuǎn)錄組和miRNA 注釋信息匱乏，桑樹和果樹等經(jīng)濟樹種的miRNA 信息也相對較少；有關(guān)植物miRNA-靶基因的互相調(diào)控作用已有不少研究，但是關(guān)于miRNA-靶基因在不同基因家族之間以及不同物種之間相互聯(lián)系的報道并不多見。本文從生長發(fā)育、非生物脅迫和生物脅迫等方面，探討木本植物miRNA 的國內(nèi)外研究進展，綜述miRNA 在木本植物中的作用，為植物miRNA 及其靶基因調(diào)控分子機理研究提供借鑒和參考。

1 miRNA 在木本植物生長發(fā)育中的作用

作為重要的調(diào)節(jié)分子，miRNA 幾乎參與了木本植物所有重要的發(fā)育過程，如根的生長、開花時間、花粉的萌發(fā)表達、胚胎的誘導發(fā)育等，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

植物體細胞胚胎發(fā)生與發(fā)育的過程極其復(fù)雜，牽涉到大量miRNA 及靶點的差異表達，多項研究證實miRNA 是誘導胚胎發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控因子。 如落葉松miRNA 的發(fā)現(xiàn)與探究多與胚胎和愈傷組織相關(guān):在落葉松中上調(diào)miR171 的表達，可導致靶基因SCL6下調(diào)及誘導體細胞胚胎[11]和胚性愈傷組織的發(fā)育[12]；分生組織的細胞增殖由miR397 和miR398 共同控制，促進單胚階段的發(fā)育；miR156、miR159、miR160、miR166、miR167 和miR390 構(gòu)成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在子葉胚發(fā)育過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；miR162 和miR168 參與調(diào)控胚胎的整個發(fā)育過程[13]。 在火炬松中，miR166 影響胚胎發(fā)育成熟的時間，而不是子葉胚發(fā)育過程[14]。

在根部發(fā)育階段， miRNA 靶向調(diào)控植物根系的發(fā)育及結(jié)構(gòu)形態(tài)，維持植株自身的生長。 在楊樹根系發(fā)育過程中，miR476a 靶向調(diào)控基因RFL介導線粒體-生長素信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導不定根的形成[15]；過表達miR167a 或沉默靶基因ARF8.1促進不定根數(shù)量增多，輕度抑制側(cè)根的發(fā)育[16]；脫落酸(ABA)與黃素類固醇(BR)、赤霉酸(GA)通過信號串擾影響miRn68 和miR4776b 的表達，調(diào)節(jié)根系發(fā)育機制，提高植株對更復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)性[17]。 另外，過表達miR396 調(diào)節(jié)靶基因GRFs下調(diào)，參與根端細胞的發(fā)育，直接或間接影響落葉松的子葉形態(tài)建立與生根過程[18-19]。 上調(diào)miR171 表達，分別導致靶向GRAS(SCL6-Ⅱ、SCL6-Ⅲ和SCL6-Ⅳ)轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)，以及影響高山松葉形、初生根的生長和開花時間[20-24]。 蘋果樹中miR171、miR396 與miR156、miR166、miR319共同作用，促進細胞增殖分化，有助于其砧木在無性繁殖過程中形成不定根[25]。

植物的營養(yǎng)生長是幼年期轉(zhuǎn)向成年期的重要過程之一，研究表明此過程也存在多種miRNAs的調(diào)控誘導。 單核苷酸多態(tài)性(SNP)關(guān)聯(lián)研究表明，楊樹中 miR160a 靶向生長素響應(yīng)因子(ARF16)、 miR167a 靶向生長素響應(yīng)因子(ARF8)、miR6443 靶基因阿魏酸5 -羥化酶(F5H)、miR475b 靶向五肽重復(fù)超家族基因(PPR1、PPR2、PPR3、PPR4)和miR156c 靶向鱗狀體啟動子結(jié)合蛋白樣基因(SPL15、SPL20、SPL25)等，構(gòu)成木質(zhì)結(jié)構(gòu)的多因素遺傳網(wǎng)絡(luò)，在樹木生長和木材性狀形成過程中提供潛在的調(diào)控作用[26-31]；值得注意的是，miR319a 的表達水平在樹木的初級到次級生長過程中逐漸降低，靶基因TCP20可結(jié)合WOX4a控制維管形成層增殖，促進次生木質(zhì)部分化，對樹木的次級生長起著重要調(diào)控作用[32]。

近些年來，越來越多的miRNA 被證實通過抑制或促進靶基因來調(diào)控植物的開花與果實成熟時間。 Zhang 等[33]在桃中發(fā)現(xiàn)了 miR171a、miR171b、miR399 和miR408 等8個miRNAs 的存在，其中miR171 誘導桃樹開花與果實發(fā)育，miR171a 在果實中高表達，miR171b 在花和幼葉中高表達，且在花中的含量遠高于幼葉和嫩莖。MiR156 的表達水平下降導致茶樹形成不育花芽，影響有性繁殖[34]。 MiR159、miR828 和miR858 靶向49個MYB基因，其中19個調(diào)節(jié)苯丙烷類代謝，參與核硬化和果實顏色發(fā)育的相關(guān)途徑，促進桃樹果實成熟[35]。 此外，miRNA 還可以調(diào)控植物體內(nèi)激素、蛋白等合成與代謝，維持植株的正常生長發(fā)育。 研究發(fā)現(xiàn)，在毛果楊中，miR171 家族除了調(diào)控GRAS 轉(zhuǎn)錄因子，還與信號傳導蛋白、蛋白激酶和水解酶等的基因相關(guān)[36-37]。 在馬尾松中，miR171 和miR397 調(diào)控次生生長、激素信號轉(zhuǎn)導等多個過程[38]。 落葉松中，miR11467 在響應(yīng)脅迫、激素等外界刺激以及苯丙烷生物合成等次生代謝途徑中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[39]。 另外，在烏龍茶晾曬階段，miR167d、miR845、miR166d 和miR319C3 促進黃酮類化合物的積累，miR171b 和miR166d 共同參與萜類化合物的生物合成，有助于烏龍茶形成獨特的香氣和風味[40]；同時，過表達miR156 抑制其靶基因SPL的表達，進而通過調(diào)節(jié)DFR基因介導兒茶素的生物合成與積累[41]。

這些研究結(jié)果表明，miRNA 通過階段特異性靶向基因廣泛調(diào)節(jié)植株的生長發(fā)育過程，且在不同植物中其功能會隨著組織不同而發(fā)生改變。 總體而言，在植物生長發(fā)育期間，miRNA 參與調(diào)控至關(guān)重要，不僅能促進或抑制靶基因的表達，也與多種功能蛋白和激素相關(guān)，并存在合作性結(jié)合方式，展現(xiàn)出miRNA 的調(diào)控能力。

2 miRNA 在木本植物生物脅迫中的作用

病原物的入侵通常會影響植物的正常生長，相關(guān)的激素信號和化合物合成與轉(zhuǎn)移等也會受到顯著影響，而miRNA 的表達變化可誘導植物調(diào)節(jié)對疾病的抵抗能力。

已有研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲侵染馬尾松后，針葉中miRNA 表達變化明顯，一方面miR384 通過靶向pre-mRNA-splicing factor SPF27，miR6196 和miR5059 調(diào)控核糖相關(guān)蛋白，進而參與RNA 剪接，在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)松萎蔫病[42]。 另一方面，降低miR5658 與miR946 表達，分別導致對應(yīng)的保守激酶2 和P-Loop 結(jié)構(gòu)域、CC-NBS-LRR 和LRR 等抗性基因表達上調(diào)，提高松樹抗松材線蟲病的能力；還可以通過miR585 調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子MBF1，影響其植保素類物質(zhì)合成的上游調(diào)控基因，促進植保素的合成，在次生代謝方面參與植物的防御過程[43]。 銹病是危害楊樹的病害之一，在葉銹真菌侵染的條件下，miR482b 的表達受到抑制，導致抗病性TIR-NBS-LRR 蛋白快速積累[44]，miR159 和miR858 家族調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子R2R3-MYBs 的表達，參與水楊酸、茉莉酸、乙烯和脫落酸等多個植物激素的代謝途徑[45]。 當楊樹受到內(nèi)生鏈酶菌SSD49 侵染時， 過表達miR160、miR156 和ptc114，或者沉默miR319 會導致編碼轉(zhuǎn)錄因子(生長素反應(yīng)因子和GRAS 蛋白)、抗病蛋白、植物激素氧化酶和應(yīng)答調(diào)節(jié)因子的基因差異表達，響應(yīng)脅迫[46]。 斜紋夜蛾取食誘導茶樹中miR160、miR166、miR393、miR319 和miR2118 家族成員表達，參與植物基因抗生物脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄過程[47]；當茶樹感染炭疽病時，5種miRNA(PC-5p-80764_22、miR160c、miR828a、miR164a 和 miR169e) 的表達譜與其靶標(WRKY、ARF、MYB75、NAC 和NFY 轉(zhuǎn)錄因子)呈負相關(guān)，進而參與生長素、ROS 清除、水楊酸介導途徑、受體激酶、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，誘導茶樹對膠孢炭疽菌脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[48]。

果樹的抗病性和脅迫響應(yīng)能力亟待提高。 當桃樹被不同病毒/類病毒(莖痘相關(guān)病毒、桃潛隱花葉類病毒)感染后，miR482d-5p、miR6271 和Pp06-33439 在葉片和果實組織中的表達持續(xù)增加，靶基因包括鈣調(diào)素結(jié)合蛋白(miR482d-5p)、E3 泛素蛋白連接酶UBR4(miR6271)、Dof 鋅指蛋白(Pp06-33439)在葉片和果實組織中的表達水平呈負相關(guān)[49]。 Ma 等[50]證實了miRln11 通過切割調(diào)控NBS 蛋白類基因的表達，響應(yīng)蘋果樹的抗病性。 在蘋果火疫病的抗病和感病品系中，miR169a、miR160e、miR167b-g 和miR168a/b 的表達水平發(fā)生了明顯變化[51]。 蘋果樹在輪紋病的脅迫下，miR827a、miR397a、miR2111a、miR167a和miR395a 的表達顯著增加，涉及疾病應(yīng)激下對靶基因的動態(tài)調(diào)控[52]。 另外，過表達miR390a 抑制MdRPK2和MdLRR8基因的表達，miR156ab 和miR395 分別負向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子WRKYN1(含有TIR 和WRKY 結(jié)構(gòu)域)與WRKY26(包含兩個WRKY 結(jié)構(gòu)域)，提高蘋果樹對葉斑病真菌的抗性[53-54]。

越來越多的研究顯示，miRNA 在植物抵御生物脅迫過程中具有重要作用，并通過不同生物學途徑共同發(fā)揮作用，如抗病蛋白NBS-LRR、植物激素信號途徑和氧化還原等多種途徑，維持不同結(jié)構(gòu)中基因的協(xié)調(diào)，引發(fā)植物的系統(tǒng)防御。 這也意味著miRNA 在植物抵御生物脅迫過程中的調(diào)控機制極其復(fù)雜。

3 miRNA 在木本植物非生物脅迫中的作用

在不同的逆境脅迫條件下，植物體內(nèi)會發(fā)生一系列應(yīng)激反應(yīng)以抵御這些不利因素造成的傷害，以便獲得更好的生長發(fā)育。 研究表明，miRNA是植物應(yīng)對逆境脅迫過程中的主要調(diào)節(jié)因子之一，通過降解、翻譯抑制或正向激活等方式作用于靶基因，進而使植物對逆境脅迫做出應(yīng)答。

Fan 等[55]研究發(fā)現(xiàn)無機磷脅迫會影響馬尾松中miR399、miR169 和miR156 等幾個家族的表達，通過上調(diào)或下調(diào)有效地促進馬尾松的正常生長。 在楊樹中過表達miR162、miR393 和miR399，能使轉(zhuǎn)運蛋白含量增多，通過調(diào)節(jié)Na+和K+動態(tài)平衡等途徑響應(yīng)低氮脅迫[56]。 低溫脅迫下，楊樹miR319、 miR159、 miR167、 miR395、 miR390 和miR172 及其靶基因MYB、SBP、bZIP、ARF、LHW和ATL，參與ARF 通路、SPL 通路、DnaJ 相關(guān)光系統(tǒng)Ⅱ和LRR 受體激酶合成，通過其動態(tài)表達響應(yīng)極端季節(jié)性氣候變化抵抗寒害[57]。 楊樹中的miR396e 和 miR396g、 miR156i 和 miR156j、miR390c 轉(zhuǎn)換為甲基化模式，miR172d 對靶基因PuGTL1的負向調(diào)控，miR164a-e、miR164f(靶向NAC基因)和miR6445、miR6427(靶向PHAS基因)的組織特異性表達，均與楊樹的耐旱性相關(guān)[58-61]。 劉志祥等[62-63]發(fā)現(xiàn)miR169 和miR156基因家族形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與毛果楊的生長發(fā)育過程及對外界的適應(yīng)性。 miR164 通過調(diào)控靶基因NAC家族，在植物激素信號傳導、生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答等方面起著重要作用[64]。 茶樹中miR166 家族表達下降，負向調(diào)控靶基因ATHB-14和ATHB-15，參與根尖發(fā)育，應(yīng)對干旱脅迫[65]。

當蘋果樹處于干旱環(huán)境時，miR399 負向介導植物抗旱性， 而 miR156、 miR166、 miR172 和miR319 則正向調(diào)控[66]；敲除miR171i 或過表達其靶基因SCL26.1都可提高蘋果樹的抗旱性[67]。另外，miR156a/SPL 還可以過表達MdWRKY100來增強蘋果樹的耐鹽性[68]。 在干旱條件下，桃樹中miR156、 miR159、 miR160、 miR167、 miR171、miR172、 miR398、 miR403、 miR408、 miR842 和miR2275 的表達水平發(fā)生明顯變化，其靶基因多與DNA 結(jié)合和催化活性相關(guān)[69]。 相反，在高水分綜合征的桃樹葉片中，Diler 等[70]鑒定了24個已知miRNAs 和3個新miRNAs，其靶基因多參與物質(zhì)運輸、角質(zhì)層發(fā)育和抗脅迫反應(yīng)，并推測miR5021 和miRnovel2 可能在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

植物體對非生物脅迫的響應(yīng)是動態(tài)且復(fù)雜的，通過上調(diào)或下調(diào)miRNA 直接或間接地影響靶基因的表達水平，形成一系列抵御非生物脅迫的機制。 但miRNA 及靶基因在組合型脅迫下的響應(yīng)過程是否發(fā)生改變，還需深入研究。

4 總結(jié)與展望

目前已在不同物種中發(fā)現(xiàn)多種miRNA，單個或多個miRNAs 及其靶基因構(gòu)成較為嚴密的調(diào)控機制，在植物的生長發(fā)育、代謝調(diào)控、非生物和生物脅迫應(yīng)答等各個方面發(fā)揮作用，以確保植物體內(nèi)各種過程的正常運行，維持植物的正常生長狀態(tài)[71]。 然而，有些miRNA 雖已被發(fā)現(xiàn)，但其功能尚不明確，且由于許多木本植物的全基因組測序尚未完成，數(shù)據(jù)庫中可用的信息資源匱乏，miRNA還未被發(fā)掘[72]，因此，有關(guān)木本植物miRNA 的研究仍需完善和深入。 另外，目前的研究大多局限于單個miRNA 與靶基因的功能分析，缺乏針對不同物種的組織特異性調(diào)控過程及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)運行機制的整體性、系統(tǒng)性研究，同時對miRNA 響應(yīng)多重脅迫的交互分析也較少，缺少植物miRNAs與其他物種(動物、微生物等)基因互作的研究。許多木本植物的組織培養(yǎng)再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未建立，也限制了miRNA 相關(guān)植物基因工程的進一步研究。

在今后的研究中，可結(jié)合高通量測序、降解組測序、生物信息學分析等不斷改進miRNA 研究手段，完善黑松、桑樹等木本植物的全基因組數(shù)據(jù)及基因功能注釋信息等，通過不同發(fā)育階段、不同脅迫條件、不同部位及不同物種間miRNAs 的差異表達等研究，完善木本植物miRNA 的特征信息及發(fā)現(xiàn)更多具有調(diào)控作用的新miRNAs。 構(gòu)建參與多種生物學過程的單個miRNA-靶基因及協(xié)同調(diào)控同一應(yīng)答過程的多個miRNA-靶基因的分子調(diào)控模型。 建立更多木本植物的組織培養(yǎng)再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，有助于利用基因工程手段更加深入地解析miRNA 的作用機理和調(diào)控路徑，也將為完善木本植物miRNA 數(shù)據(jù)提供材料。 木本植物的miRNA 研究可為植物分子育種提供重要的理論依據(jù)。