趙曉彤王桂清

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東聊城 252000)

生防真菌在防治作物病害(尤其是土傳病害)方面發(fā)揮著巨大作用，其中研究最多和應(yīng)用最廣的為木霉菌(Trichodermaspp.)[1]。 木霉菌廣泛分布于不同生態(tài)環(huán)境中，以豐富的次生代謝物和強大的競爭能力及重寄生特性實現(xiàn)其生物防治作用，在土壤修復(fù)、促進植物生長和控制病害方面發(fā)揮著重要作用[2]，可作為高效、經(jīng)濟、環(huán)保的原材料應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[3]。 因其具有生長分布的廣泛性、種類株系的適應(yīng)性、拮抗真菌的廣譜性、活性物質(zhì)的多樣性、作用機制的復(fù)雜性和對環(huán)境的友好性等特點而成為最有應(yīng)用前途的生防因子[4-6]。

最為常見的木霉菌有哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)和綠色木霉(Trichoderma viride)等。 哈茨木霉是目前農(nóng)業(yè)生物防治中最具商業(yè)化價值的木霉菌，應(yīng)用廣泛；長枝木霉是較為常見的拮抗類木霉，在植病生防中越來越受到重視。 哈茨木霉T22、T39 作為生防產(chǎn)品已登記注冊，不僅可以誘導(dǎo)寄主防御基因表達產(chǎn)生抗病性而防治植物病害，還可以促進作物生長進而提高生物量[7-9]。 長枝木霉SMF2 主要通過產(chǎn)生抗菌肽康寧霉素(trichokonins， TKs)而對植物病害產(chǎn)生抑制作用，同時對苦瓜、白三葉草等植物具有明顯的促生作用[1，10]。

木霉菌種類不同、菌株不同，其生態(tài)適應(yīng)性也不同。 綠色木霉TR-8、哈茨木霉TH-1 均可在PDA 培養(yǎng)基上正常生長；光照可促進孢子產(chǎn)生，但二者最適生長溫度、pH 值等略有不同；微量元素Mn 對TR - 8 菌絲生長有一定的促進作用[11-12]。 生物學(xué)特性是研究真菌繁殖條件、發(fā)生規(guī)律、生態(tài)調(diào)控等方面的理論基礎(chǔ)，對生防菌的科學(xué)利用具有指導(dǎo)作用[13]。 本試驗通過研究不同培養(yǎng)條件下長枝木霉SMF2 和哈茨木霉T39 的生物學(xué)特性，明確其生長繁殖條件，為其人工擴繁和工廠化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌種為長枝木霉(T. longibrachiatum)SMF2 和哈茨木霉(T. harzianum)T39，由聊城大學(xué)植物病理實驗室提供。

將供試菌種在(25±1) ℃、L ∶D(光照∶黑暗)＝12 h ∶12 h 的恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)采用PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d 后，用打孔器取直徑0.7 cm 的菌餅備用。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 培養(yǎng)基供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA:去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)、察氏培養(yǎng)基(CDA:葡萄糖20 g、KH2PO40.5 g、K2HPO40.6 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.1 g、天門冬酰胺5 g、CaCl20.1 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)、燕麥培養(yǎng)基(OMA:燕麥片40 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)、基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基(BCM:蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、K2HPO41 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)、麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基(MEA:麥芽糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L)[15]共5 種。

1.2.2 溫度以PDA 培養(yǎng)基為營養(yǎng)源，溫度范圍5～40 ℃之間，設(shè)置5、10、15、20、25、30、35、40 ℃共8個處理。

1.2.3 光照以PDA 培養(yǎng)基為營養(yǎng)源，設(shè)置全光照、光暗交替(L ∶D＝12 h ∶12 h)、全黑暗3個處理。

1.2.4 pH 值以PDA 培養(yǎng)基為營養(yǎng)源，使用1.0 mol/L HCl 溶液和1.0 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH 值，設(shè)pH 值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 共10個處理。

1.2.5 碳源以CDA 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用供試碳源等量替換其中的葡萄糖(標(biāo)準(zhǔn)碳)，制成不同碳源培養(yǎng)基。 供試碳源選用蔗糖、麥芽糖、乳糖、果糖、海藻糖、阿拉伯糖、可溶性淀粉、微晶纖維素共8 種，并以無碳處理作為空白對照。

1.2.6 氮源以CDA 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用供試氮源等量替換其中的天門冬酰胺(標(biāo)準(zhǔn)氮)，制成不同氮源培養(yǎng)基。 供試氮源選用硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉、牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、甘氨酸共7 種，并以無氮處理作為空白對照。

1.3 測定項目及方法

將高壓濕熱滅菌后的培養(yǎng)基制成平板(直徑9 cm)，于培養(yǎng)皿內(nèi)接種木霉菌餅，1 皿1 餅，重復(fù)3 次。 研究不同培養(yǎng)基、溫度、光照、pH 值、碳源和氮源對SMF2、T39 菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響。不同處理分別于(25±1) ℃、L ∶D ＝12 h ∶12 h 的恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后，采用十字交叉法測量菌落直徑，72 h 后用相機拍照記錄培養(yǎng)性狀，采用血球計數(shù)法計算產(chǎn)孢量[14-15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2020 處理數(shù)據(jù)，用Adobe Photoshop 2020 軟件處理照片，用DPS 19.05 中的Duncan’s 法進行多組樣本間的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢能力的影響

圖1 顯示，SMF2、T39 在5 種供試培養(yǎng)基中均可生長，菌絲生長呈輻射狀，色素顏色為黃綠色，培養(yǎng)基不同菌絲色素顏色深淺不同。 其中，二者在MEA 培養(yǎng)基上生長均不理想，菌絲稀薄，不產(chǎn)生色素，產(chǎn)孢量小。

圖1 不同培養(yǎng)基條件下兩種木霉培養(yǎng)結(jié)果比較

不同培養(yǎng)基條件下兩種木霉菌絲生長速度和產(chǎn)孢量存在差異。 由圖2 可知，二者在PDA 培養(yǎng)基上生長狀況最好，菌落大、菌絲生長旺盛，產(chǎn)孢量大。 SMF2 菌落直徑達7.69 cm，是T39 的1.25倍(表1)，產(chǎn)孢量為2.64×1010個/皿；T39 菌落直徑為6.16 cm，產(chǎn)孢量為3.86×1010個/皿。 在CDA、OMA、BCM 培養(yǎng)基上，二者生長狀況較好，T39 的產(chǎn)孢量是SMF2 的1.27～6.55 倍(表1)，且T39 在CDA 上的產(chǎn)孢量高達4.58×1010個/皿。

表1 不同培養(yǎng)基下SMF2 與T39生物量的倍數(shù)比較

圖2 不同培養(yǎng)基對兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

綜合菌絲生長速度、產(chǎn)孢量和培養(yǎng)性狀，PDA為SMF2 菌株生長發(fā)育的最佳培養(yǎng)基，CDA 為T39 的最佳培養(yǎng)基。 T39 菌株的產(chǎn)孢能力明顯大于SMF2。

2.2 不同溫度對兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢能力的影響

由圖3 可知，兩種木霉在25 ～35 ℃范圍內(nèi)菌絲生長旺盛，呈輻射狀，菌落致密，在整個培養(yǎng)基上密布成堆。 當(dāng)培養(yǎng)溫度≤20 ℃或高達40 ℃時，兩種木霉生長狀況均較差，菌絲稀薄，產(chǎn)孢量少。

圖3 不同溫度條件下兩種木霉培養(yǎng)結(jié)果比較

由圖4 可知，供試溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，兩種木霉的菌落直徑和產(chǎn)孢量均呈現(xiàn)先升高后降低的變化。 SMF2 的菌落直徑和產(chǎn)孢量拐點均出現(xiàn)在35 ℃，菌落直徑最大達8.75 cm，是T39的1.29 倍(表2)，產(chǎn)孢量最高達61.06×108個/皿；而T39 的菌落直徑拐點出現(xiàn)在25 ℃，最大達8.35 cm，產(chǎn)孢量拐點出現(xiàn)在30 ℃，最高達206.46×108個/皿。 5～30 ℃范圍內(nèi)，同一溫度下，T39 的產(chǎn)孢能力強于SMF2，前者的產(chǎn)孢量是后者的1.11～23.83 倍(表2)；而35～40 ℃時，T39 的產(chǎn)孢能力低于SMF2，后者的產(chǎn)孢量是前者的1.06 ～1.96倍。

表2 不同溫度條件下SMF2 與T39生物量的倍數(shù)比較

表明兩種木霉在最適培養(yǎng)溫度上有差異，SMF2 的菌絲生長和產(chǎn)孢最適溫度均為35 ℃，T39 的菌絲生長最適溫度為25 ～30 ℃，產(chǎn)孢最適溫度為30 ℃。 相同溫度下T39 產(chǎn)孢量整體較高。

2.3 不同光照對兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢能力的影響

圖5 顯示，SMF2、T39 在3 種不同光照條件下均能正常生長，菌落致密，菌絲呈輻射狀，生長旺盛。 二者在全光照條件下產(chǎn)孢最多，光暗交替條件下次之，全黑暗條件下最少。

圖5 不同光照條件下兩種木霉培養(yǎng)結(jié)果比較

由圖6 可知，不同光照條件下，SMF2、T39 的菌落直徑范圍分別為6.31 ～8.13、5.75 ～6.67 cm，且菌落直徑均在全黑暗條件下達到最大，全光照條件下次之，光暗交替條件下最小。 SMF2 菌絲生長較快，是T39 的1.05～1.22 倍(表3)。

表3 不同光照條件下SMF2 與T39生物量的倍數(shù)比較

圖6 不同光照條件下兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢量比較

T39、SMF2 產(chǎn)孢量均在全光照條件下達到最大，分別為33.83×108、9.50×108個/皿；不同光照條件下，T39 的產(chǎn)孢量為SMF2 的2.45 ～4.14 倍(表3)。 表明光照條件能夠有效增加二者的產(chǎn)孢量，且同一光照條件下，T39 產(chǎn)孢量明顯高于SMF2。

2.4 不同pH 值對兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢能力的影響

圖7 顯示，兩種木霉在pH 值為4～11 條件下均可生長，菌落相對致密，菌絲生長比較旺盛，孢子均勻密布整個培養(yǎng)基；但極強的酸、堿環(huán)境即pH 值為3、12 條件下，二者生長狀況較差，pH 值為12 條件下菌絲生長緩慢，菌落較小，產(chǎn)孢量較少；pH 值為3 條件下由于酸性過大，培養(yǎng)基無法凝固，兩種菌生長緩慢，產(chǎn)孢極少。

圖7 不同pH 值條件下兩種木霉培養(yǎng)結(jié)果比較

由圖8 可知，pH 值為4～11 條件下，SMF2、T39 的菌絲生長和產(chǎn)孢量存在明顯差異。 SMF2的菌落直徑范圍為6.51～8.45 cm，pH 值為9 時菌落直徑最大；T39 的菌落直徑范圍為4.95 ～7.48 cm，pH 值為4 時菌落直徑最大，且隨pH 值增大整體呈減小趨勢。 pH 值為4～5 時，T39 的菌絲生長比較快，其菌落直徑是SMF2 的1.07 ～1.15 倍；pH 值為6～11 時，SMF2 的菌絲生長比較快，其菌落直徑是T39 的1.17～1.59 倍(表4)。

表4 不同pH 值條件下SMF2 與T39生物量的倍數(shù)比較

圖8 不同pH 值條件下兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢量比較

pH 值為4 ～11 條件下，SMF2 的產(chǎn)孢量為(0.46～2.91)×1010個/皿，pH 值為7 時孢子量最多；T39 的產(chǎn)孢量為(1.48 ～5.22)×1010個/皿，pH值為6 時孢子量最多。 相同pH 值下T39 的產(chǎn)孢量是SMF2 的1.25～4.20 倍(表4)。

表明中性偏堿環(huán)境有利于SMF2 的生長和繁殖，其菌絲生長和產(chǎn)孢的最適pH 值分別為9 和7；偏酸條件則更有利于T39 的生長發(fā)育，其菌絲生長和產(chǎn)孢的最適pH 值分別為4 和6。

2.5 不同碳源對兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢能力的影響

圖9 顯示，兩種木霉在無碳培養(yǎng)基上可產(chǎn)孢，但產(chǎn)孢量較少、生長較差，菌落直徑相對較小，菌絲稀疏；在其他碳源培養(yǎng)基上菌絲生長均較旺盛，產(chǎn)孢量大，呈輻射狀，分生孢子密布于菌落上。 不同碳源處理下兩種木霉的生長發(fā)育狀況較無碳對照均明顯提高，表明其對碳源的要求不嚴(yán)格，但對單糖(果糖、阿拉伯糖)的利用效果優(yōu)于雙糖(海藻糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖)和多糖(可溶性淀粉、微晶纖維素)。 微晶纖維素由于自身溶解性較差，以其為碳源時，菌絲生長和產(chǎn)孢能力不理想，但其生長發(fā)育狀況仍優(yōu)于無碳對照。

由圖10 可知，無碳條件下，SMF2 和T39 菌落直徑均低于5 cm，產(chǎn)孢量不超過1.00×1010個/皿。不同碳源處理下，SMF2 的菌落直徑為5.16 ～7.71 cm，產(chǎn)孢量為(0.95 ～1.62)×1010個/皿，分別是無碳培養(yǎng)基的1.06～1.59、2.71～4.63 倍；T39 的菌落直徑為4.20 ～5.62 cm，產(chǎn)孢量為(1.56 ～2.50)×1010個/皿，與無碳培養(yǎng)基相比，前者產(chǎn)孢量是后者的1.68～2.69 倍，菌落直徑的倍數(shù)關(guān)系在1.01～1.36 之間，差異較小。 阿拉伯糖為SMF2 和T39菌絲生長的最適碳源，果糖為二者產(chǎn)孢的最佳碳源。

圖10 不同碳源條件下兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢量比較

由表5 可知，不同碳源條件下，SMF2 的菌絲生長較快，菌落直徑是T39 的1.23 ～1.47 倍；T39的產(chǎn)孢能力明顯大于SMF2，前者是后者的1.10 ～1.64 倍。

表5 不同碳源條件下SMF2 與T39 生物量的倍數(shù)比較

2.6 不同氮源對兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢能力的影響

圖11 顯示，無氮條件下，兩種木霉的孢子肉眼幾乎不可見。 相比較無氮對照，兩種木霉在以蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏、甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基上生長良好，菌絲致密，產(chǎn)孢量較多；而在其他氮源培養(yǎng)基中，菌絲稀薄，產(chǎn)孢量少，生長、產(chǎn)孢均不理想。

圖11 不同氮源條件下兩種木霉培養(yǎng)結(jié)果比較

由圖12 可知，不同氮源條件下兩種木霉的菌絲生長差異明顯。 在以有機氮(蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏)、氨基酸態(tài)氮(甘氨酸)為氮源的培養(yǎng)基上生長速率均快于銨態(tài)氮(硫酸銨、氯化銨)和硝態(tài)氮(硝酸鈉)。 在有機氮、氨基酸態(tài)氮為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑為4.28 ～7.69 cm，在其他氮源培養(yǎng)基上的菌落直徑僅為0.92 ～1.87 cm。 其中，SMF2 在有機氮、氮基酸態(tài)氮、硝態(tài)氮為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑大于T39，前者是后者的1.03～1.39 倍(表6)。

表6 不同氮源條件下SMF2 與T39 生物量的倍數(shù)比較

圖12 不同氮源條件下兩種木霉菌絲生長和產(chǎn)孢量比較

無氮條件下，SMF2 和T39 的菌落直徑分別為3.72、4.72 cm，產(chǎn)孢量為9.17×108、73.75×108個/皿。不同有機氮源條件下，SMF2 產(chǎn)孢量達到(304.38～528.33) ×108個/皿，T39 產(chǎn)孢量達到(91.88～159.38)×108個/皿，SMF2 的產(chǎn)孢量是T39的2.94～5.69 倍；而以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮為氮源時，T39 的產(chǎn)孢能力增強，其產(chǎn)孢量是SMF2 的2.73 ～4.68倍(表6)。

添加有機氮源培養(yǎng)基的SMF2 和T39 菌落直徑、產(chǎn)孢量分別是無氮源添加的1.11 ～2.07、1.25 ～57.64倍。 且兩種木霉的菌落直徑和產(chǎn)孢量均在有機氮源培養(yǎng)基中達到最大值，其菌落直徑和產(chǎn)孢量的最佳氮源分別為酵母浸膏和牛肉膏，表明二者對有機氮源的利用情況優(yōu)于其他氮源。

3 討論

培養(yǎng)基、溫度、光照、酸堿度、碳源和氮源均對木霉菌的菌絲生長和孢子形成有不同影響。

3.1 不同培養(yǎng)基對兩種菌培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)基是微生物學(xué)研究和微生物發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)，其營養(yǎng)組成直接影響微生物生長發(fā)育。 目前培養(yǎng)木霉菌常用的培養(yǎng)基有PDA、CDA、MEA、PSA、糖漿培養(yǎng)基、玉米粉葡萄糖培養(yǎng)基、小麥汁培養(yǎng)基和玉米培養(yǎng)基[16]等。 馬鈴薯是PDA 的重要組分，含有豐富的B 族維生素、纖維素、微量元素、氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪和優(yōu)質(zhì)淀粉等營養(yǎng)元素，為微生物生長提供充裕碳源、氮源、維生素和無機鹽；葡萄糖是活細(xì)胞的能量來源和新陳代謝的中間產(chǎn)物，能夠提供優(yōu)質(zhì)碳源。 CDA 中葡萄糖和天門冬酰胺為重要的碳源、氮源，含量較高的氯化鈉具有抑制細(xì)菌和減緩毛霉生長的作用，其他成分則提供必需離子；OMA 中的燕麥含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、微量元素和膳食纖維，是氮源、碳源和微量元素等的重要來源；BCM 中的牛肉膏和蛋白胨為碳源、氮源、磷酸鹽和維生素的主要來源，氯化鈉則提供無機鹽。

有研究表明，長枝木霉T05 在PDA、MEA、CDA、BCM 上都能生長，且菌絲在PDA 上生長最快[17]；哈茨木霉TH-1 分別在PDA、MEA、CDA、BCM 上培養(yǎng)均能產(chǎn)孢，其中PDA 為最適培養(yǎng)基[12]。 本試驗中PDA、CDA、OMA、BCM 四種培養(yǎng)基因營養(yǎng)成分豐富，成為SMF2 和T39 菌絲生長及孢子繁殖的適宜培養(yǎng)基，以PDA 和CDA 最佳，而MEA 培養(yǎng)基成分單一，除凝固劑瓊脂外，僅含有麥芽糖，故兩種木霉在其上生長發(fā)育不理想。這與前人研究結(jié)果大體一致，進一步證明木霉菌株對營養(yǎng)環(huán)境的廣泛適應(yīng)性。

3.2 不同溫度對兩種菌培養(yǎng)的影響

木霉菌是一種嗜溫真菌，棘孢木霉PZ6 在15～37 ℃均能生長，25～37 ℃菌絲生長較好，以30 ℃菌絲生長最快[16]；長枝木霉HQ1、非洲哈茨木霉BB12 菌株適宜培養(yǎng)溫度為28 ～33 ℃[18]。 本試驗中T39、SMF2 在25 ～35 ℃范圍內(nèi)生長發(fā)育良好；在高溫(40 ℃)或低溫(20 ℃及以下)環(huán)境條件下，由于沒有達到木霉菌生長發(fā)育的起點溫度或有效積溫積累不足，或者環(huán)境溫度過高導(dǎo)致菌體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等重要組成物質(zhì)遭受不可逆的破壞，致使其生長較差。

3.3 不同光照對兩種菌培養(yǎng)的影響

光為木霉菌菌絲生長和孢子形成提供能量。光照對哈茨木霉TH-1 菌絲生長影響不大但明顯影響菌株產(chǎn)孢量，光照時間越長產(chǎn)孢量越大[12]；全黑暗條件有利于長枝木霉GAAS L3-1-0.8 菌絲的營養(yǎng)生長，而光暗交替條件則對產(chǎn)孢有利[19]，即光照可以促進分生孢子產(chǎn)生。 本試驗中T39、SMF2 在全光照、光暗交替、全黑暗3 種條件下均可正常生長，全黑暗條件對菌絲生長更為有利，而全光照條件對產(chǎn)孢更有利。 這與前人的研究結(jié)果相吻合，且相同光照條件下，長枝木霉SMF2 菌絲生長較快，而哈茨木霉T39 產(chǎn)孢量更大。

3.4 不同pH 值對兩種菌培養(yǎng)的影響

pH 值不僅通過影響真菌體內(nèi)的酶活性而影響酶促反應(yīng)效率，而且還通過影響膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和細(xì)胞質(zhì)膜的通透性而影響其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。 有研究表明，棘孢木霉PZ6 最適生長和產(chǎn)孢的pH 值為5 ～9[16]；哈茨木霉Th-81、短密木霉(T. brevicompactum)Tb-50 和長枝木霉T1-70 在pH 值為2 ～7 時均能生長，最適生長的pH 值為4[20]。 本試驗中，T39、SMF2 對酸堿度的適應(yīng)性較強、范圍較廣，在pH 值為4 ～11 條件下均生長較好，且中性至弱堿性(pH 值7～9)為SMF2 培養(yǎng)的最佳酸堿條件，其菌絲生長、產(chǎn)孢最適pH 值分別為9 和7；T39 培養(yǎng)的最佳酸堿條件為弱酸和偏酸(pH 值4～6)，其菌絲生長、產(chǎn)孢最適pH 值分別為4 和6。

3.5 不同碳源對兩種菌培養(yǎng)的影響

碳源物質(zhì)是真菌生長的碳素來源。 木霉菌對單糖、雙糖、多糖、嘌呤、嘧啶和氨基酸等的利用效果均較好[21]。 不同木霉菌其最適碳源有所差異，長枝木霉GAAS L3-1-0.8 以葡萄糖、麥芽糖、果糖和乳糖為碳源時，菌絲生長和產(chǎn)孢較好，葡萄糖為最適碳源[19]；木糖、果糖和蔗糖有利于哈茨木霉T21 的菌絲生長和產(chǎn)孢，木糖為最適碳源[22]。本試驗中，SMF2 和T39 在無碳源添加的培養(yǎng)基中雖能生長，但其菌絲質(zhì)量和產(chǎn)孢量均不理想。碳源的加入提供了必要的營養(yǎng)物質(zhì)，提升其生長發(fā)育質(zhì)量。 微晶纖維素主要成分為以β-1，4-葡萄糖苷鍵結(jié)合的直鏈?zhǔn)蕉嗵穷愇镔|(zhì)，由于自身不易溶解致使碳源的促生作用較差。 單糖(果糖、阿拉伯糖)補充熱能的效果比雙糖、多糖更快，故以果糖和阿拉伯糖為碳源時SMF2 和T39 的生長發(fā)育最優(yōu)，且SMF2 的菌絲生長優(yōu)于T39，但T39的產(chǎn)孢能力更強，這可為二者混合使用以防治病害提供理論基礎(chǔ)。

3.6 不同氮源對兩種菌培養(yǎng)的影響

氮源是真菌生長的重要氮素來源，主要用于合成蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)，有助于產(chǎn)孢。 有機氮源像蛋白胨、牛肉膏和酵母浸膏等成分復(fù)雜、營養(yǎng)豐富，微生物在其培養(yǎng)基中常表現(xiàn)出生長旺盛、菌體增長迅速等特點。 有研究表明，蛋白胨和酵母膏分別為長枝木霉T05 和GAAS L3-1-0.8 營養(yǎng)生長和產(chǎn)孢的最適氮源[17，19]，哈茨木霉T21 在以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長和產(chǎn)孢最優(yōu)[22]。氨基酸態(tài)氮(甘氨酸)存在于土壤蛋白質(zhì)和多肽類化合物中，降解后只釋放出相應(yīng)的氨基酸為微生物生長發(fā)育提供單一營養(yǎng)；硝態(tài)氮和銨態(tài)氮為無機氮源(硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉)，易被菌體直接利用，促進菌體生長，但與有機氮源相比，因其成分簡單、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)、利用效率低致使木霉菌菌絲稀薄、產(chǎn)孢量較少。 因此，相比于氨基酸態(tài)氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮，SMF2 和T39 在以有機氮(蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏)為氮源的培養(yǎng)基中生長發(fā)育更優(yōu)，有機氮源為SMF2 和T39 生長發(fā)育的適宜氮源，這與前人的研究結(jié)果一致。 且SMF2 和T39 對氮源的要求相較于碳源而言更嚴(yán)格。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，SMF2 和T39 具有廣泛的適應(yīng)性，對環(huán)境條件要求不嚴(yán)格，在常溫、黑暗、非強酸強堿、含有碳源和有機氮源的條件下，二者的菌絲生長和孢子形成狀況均較為優(yōu)良。 光照、果糖、牛肉膏更有利于二者孢子形成；PDA 和CDA最適宜產(chǎn)孢；且二者對氮源的要求相較于碳源而言更嚴(yán)格，兩種木霉在無碳條件下可產(chǎn)孢，但產(chǎn)孢量較少，而在無氮條件下孢子肉眼幾乎不可見。SMF2 和T39 在添加碳源培養(yǎng)基中的菌落直徑、產(chǎn)孢量是無碳源添加的1.01 ～1.59、1.68 ～4.63倍，而在添加有機氮源培養(yǎng)基中的菌落直徑、產(chǎn)孢量是無氮源添加的1.11～2.07、1.25～57.64 倍。

相同條件下，SMF2 菌絲生長較快，而哈茨木霉T39 產(chǎn)孢能力更高。 35 ℃、pH 值為7 時最利于SMF2 產(chǎn)孢，而30 ℃、pH 值為6 時最利于T39產(chǎn)孢。 人工擴繁時，可通過調(diào)節(jié)環(huán)境溫度和培養(yǎng)基酸堿度調(diào)控SMF2、T39 的產(chǎn)孢情況；有機氮和單糖更有利于SMF2 和T39 菌絲生長和孢子形成。