童海江，周愷驊，王亞玲，孫海燕，王社梁，夏偉仁

（紹興第二醫(yī)院，浙江 紹興 312000）

長期高血糖會促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的表達(dá)，進(jìn)而抑制血管生成。這會引起足部傷口不受控制的感染，引起糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）足潰瘍（diabetic foot ulceration，DFU）[1]。DM患者終身患有DFU的概率高達(dá)15%，也是成年人截肢的主要因素[2]。細(xì)胞的自噬可將受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解，從而減少ROS的生成，是細(xì)胞在高糖等壓力環(huán)境下自我保護(hù)的方式。研究發(fā)現(xiàn)自噬可以緩解DFU，促進(jìn)傷口愈合[3]。微小RNA（micorRNA，miR）是內(nèi)源的小型非編碼RNA，可通過與目標(biāo)mRNA的3'非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3'-UTR）堿基-堿基互補(bǔ)配對來抑制基因表達(dá)。研究表明mi-128可通過靶向抑制下游Sirtuin（SIRT1）蛋白的表達(dá)調(diào)控自噬[4-5]?；⒄溶帐菑幕⒄戎蟹蛛x的天然羥基-二苯基乙烯化合物，研究顯示其可通過調(diào)節(jié)STIR加速蛋白發(fā)揮抗氧化和抗炎的作用[6]?；⒄溶湛赏ㄟ^調(diào)控自噬保護(hù)心肌細(xì)胞免受心肌梗死損傷[7]。本研究主要基于miR-128-3p/SIRT1探討虎杖苷對DFU模型大鼠創(chuàng)面愈合和自噬水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 60只SPF級的Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，12周齡，體質(zhì)量220～250 g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006。所有大鼠飼養(yǎng)溫度為22～24 ℃，濕度為40%～60%，均飼養(yǎng)在光照12 h/黑暗12 h的環(huán)境中。實(shí)驗(yàn)過程完全遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》，并通過紹興第二醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，倫理批號：2020031。

1.2 藥物與試劑 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國Sigma公司，批號：20190217）；HE染色試劑盒（北京Solarbio公司，批號：20211207）；RNAspin Mini試劑盒（美國GE Healthcare，批號：217004）；Bestar qPCR RT（批號：2020665）和BestarTMqPCR試劑盒（批號：2020890）均購自德國DBI Bioscience公司；一抗anti-GAPDH（批號：ab9485）、anti-LC3Ⅰ（批號：ab232463）、anti-LC3Ⅱ（批號：ab232940）、anti-Beclin1（批號：ab207612）、anti-SIRT1（批號：ab110304）和山羊抗兔HRP-IgG二抗（批號：ab205718）均購自美國Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光底物（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：RMO0021）；大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞（美國ATCC公司，批號：BH0015）；專用培養(yǎng)基（美國Gibco，批號：2177684）；hsa-miR-128-3p、NC mimics、雙熒光報告基因載體h-SIRT1-3UTR-wt和雙熒光報告基因載體h-SIRT1-3UTR-mu均由上海漢恒生物科技公司合成。Lipofectamine 2000（加拿大Invitrogen公司，批號：11668019）；雙熒光素酶報告試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司，批號：E60800）。

1.3 主要儀器 Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)（美國Santa公司）；Leica DM2500光學(xué)顯微鏡、Leica RM2235組織包埋機(jī)均購自美國Leica Microsystems公司；KH20R高速冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；Invitrogen Qubit Flex定量PCR儀（美國Thermo Fisher公司）；干式生化分析儀-Compass2000（江蘇康尚生物醫(yī)療科技有限公司）；Invitrogen iBright凝膠成像系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）。

1.4 造模與分組 將45只大鼠連續(xù)4周給予高脂高糖飲食，然后根據(jù)參考文獻(xiàn)通過腹腔內(nèi)注射STZ（70 mg/kg）建立DM模型[8]。在STZ注射后第3天檢測尾靜脈血中血糖水平，血糖高于16.7 mmol/L表明模型建立成功。本研究建模成功率為80%（36/45）。隨機(jī)選擇30只建模成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組（n=15）和虎杖苷組（n=15）。另取15只健康大鼠作為對照組，給予連續(xù)4周的正常飲食后，禁食12 h，再通過腹腔注射生理鹽水（70 mg/kg）。參考文獻(xiàn)方法建立DM傷口愈合的模型[8]。3組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉（350 mg/kg），隨后用脫毛膏脫去除大鼠背部的毛，75%的酒精進(jìn)行消毒，然后切除圓形范圍為1 cm×1 cm的皮膚。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 虎杖苷組大鼠予虎杖苷灌胃，劑量為40mg/kg[9]，1次/d，持續(xù)給藥10 d。模型組、對照組作為自然愈合組不給藥處理。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 傷口愈合評估 每天觀察并測量傷口大小，在第5天和第10天拍照并計算傷口面積及傷口愈合率。傷口面積采用最大長寬法進(jìn)行測量與計算。測量傷口邊到邊的最大長度和與長徑相垂直的最大寬度，長與寬相乘得出傷口估算面積。傷口愈合率=[（初始傷口面積-最終傷口面積）/初始傷口面積]×100%。

1.6.2 組織病理學(xué)觀察 大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥溶液進(jìn)行麻醉（40 mg/kg），隨后收集愈合邊緣組織。用4%的多聚甲醛將愈合邊緣組織固定，脫水、包埋后切片（4 μm）。用蘇木精在室溫下染色10 min，然后用0.5%的伊紅室溫下染色3 min，顯微鏡（×200）下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.6.3 創(chuàng)面組織SOD和MDA水平 取大鼠創(chuàng)面組織，消毒后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｈ∵m量組織，剪碎后加入生理鹽水，在冰水浴中進(jìn)行勻漿，制作成質(zhì)量濃度10%的組織勻漿液。2000r/min下低溫（4 ℃）離心20 min（離心半徑為13.5 cm），收集上清液，分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆?。取待測組織勻漿上清液，采用ELISA試劑盒檢測組織勻漿上清液中SOD和MDA水平。

1.6.4 創(chuàng)面組織SIRT1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表達(dá)水平收集各組愈合邊緣組織中總蛋白，每份樣本中取出總量為40 μg的總蛋白電泳分離（80～120 V，90 min）。通過濕法將分離的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜（100 mV）。在5%牛血清白蛋白中于室溫孵育1 h。將膜與1∶500稀釋的一抗anti-LC3Ⅰ、anti-LC3Ⅱ、anti-Beclin1、anti-SIRT1在4 ℃下孵育過夜。洗滌后在室溫下添加HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h。然后加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。使用Image J軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值。GAPDH作為內(nèi)參，通過灰度值分析目標(biāo)蛋白與GAPDH的比值來分析表達(dá)水平。

1.6.5 創(chuàng)面組織miR-128-3p、SIRT1 mRNA表達(dá)水平 使用RNAspin Mini試劑盒從愈合邊緣組織中提取RNA，然后使用Bestar qPCR試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA。條件如下：37 ℃，15 min；98 ℃，5 min。然后使用BestarTMqPCR預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。條件如下：95 ℃，2 min；94 ℃，20 s；58 ℃，20 s；72 ℃，20 s。40個循環(huán)，最后在72 ℃下延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。U6和GAPDH分別作為miR-128-3p和SIRT1 mRNA的內(nèi)參，通過比較循環(huán)閾值評估相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 qPCR 引物序列

1.7 miR-128-3p靶向SIRT1的驗(yàn)證 通過雙熒光素酶報告在大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞中驗(yàn)證miR-128-3p靶向抑制SIRT1。首先根據(jù)Targetscan預(yù)測miR-128-3p與SIRT1 mRNA的3'-UTR的互補(bǔ)位點(diǎn)，將野生型（wt）和突變型（mut）的3'-UTR克隆到pmiR熒光基因中，分別命名為pmiR-wt-SIRT1和pmiR-mut-SIRT1。然后分別將miR-128-3p（50 pmol/mL）或miR-NC（50 pmol/mL）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，將pmiR-wt-SIRT1和pmiR-mut-SIRT1轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。分組：pmiR-wt-SIRT1+miR-NC組、pmiR-wt-SIRT1+miR-128-3p組、pmiR-mut-SIRT1+miR-NC組、pmiR-mut-SIRT1+miR-128-3p組。轉(zhuǎn)染體系（96孔板，每組3個復(fù)孔）：3 μL siRNA（100 nmol/L）、15 μL質(zhì)粒（40 ng/μL）分別稀釋于180 μL無血清高糖培養(yǎng)基，6 μL Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑稀釋于450 μL無血清高糖培養(yǎng)基，室溫靜置5 min后，按分組及與轉(zhuǎn)染試劑混合繼續(xù)靜置15 min。將上述復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中并混勻。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行雙熒光素酶檢測。

通過雙熒光素酶報告試劑盒檢測相對熒光素酶活性。當(dāng)miR-128-3p與SIRT1 mRNA結(jié)合后，熒光素酶活性會降低。然后通過熒光定量PCR檢測miR-128-3p、SIRT1 mRNA表達(dá)水平，通過Western blotting檢測SIRT1蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 26和GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件對數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計分析處理。對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組數(shù)據(jù)均數(shù)的比較用ONE-WAY-ANOVA檢驗(yàn)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。兩組比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠傷口愈合情況比較 第5天，模型組、虎杖苷組大鼠傷口愈合率低于對照組（P＜0.05）；第10天，對照組大鼠傷口基本愈合，而模型組大鼠出現(xiàn)潰瘍且傷口愈合停滯；第10天，虎杖苷組大鼠傷口愈合率高于模型組（P＜0.05），低于對照組（P＜0.05）。（見圖1、表2）

圖1 大鼠傷口愈合情況

表2 3 組大鼠傷口愈合率比較 （±s，%）

表2 3 組大鼠傷口愈合率比較 （±s，%）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n 給藥劑量/（mg/kg） 第5天 第10天對照組 15 - 49.25±5.64a 70.43±7.81a b模型組 15 - 51.41±6.42a 53.67±7.08a虎杖苷組 15 40 61.36±4.90 84.92±7.32 F 18.918 65.336 P 0.000 0.000

2.2 大鼠傷口愈合的組織學(xué)情況 圖2中紅色為細(xì)胞質(zhì)，藍(lán)色為細(xì)胞核。對照組有大量的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞及較多的肉芽組織和瘢痕組織；模型組見大量炎癥細(xì)胞浸潤，膠原沉積松散，排列不規(guī)則，傷口恢復(fù)情況較對照組差；虎杖苷組有較明顯的肉芽組織和瘢痕組織，提示傷口愈合情況較模型組好。

圖2 大鼠傷口愈合的組織學(xué)情況 （HE，×200）

2.3 3組大鼠創(chuàng)面組織中氧化應(yīng)激水平比較 模型組大鼠創(chuàng)面組織中SOD水平低于對照組（P＜0.05），MDA水平高于對照組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中SOD水平高于模型組（P＜0.05），MDA水平低于模型組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中SOD水平低于對照組（P＜0.05），MDA水平高于對照組（P＜0.05）。（見表3）

表3 3 組大鼠創(chuàng)面組織中SOD 和MDA 水平比較 （±s）

表3 3 組大鼠創(chuàng)面組織中SOD 和MDA 水平比較 （±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n 給藥劑量/（mg/kg） SOD/（nmol/mg） MDA/（U/mg）對照組 15 - 184.93±15.74 7.54±0.94模型組 15 - 87.46±9.05a 23.17±2.21a虎杖苷組 15 40 150.72±15.78a b 12.85±1.43a b F 185.945 355.746 P 0.000 0.000

2.4 3組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p、SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白表達(dá)水平比較 模型組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p高于對照組（P＜0.05），SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白相對表達(dá)量低于對照組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p低于模型組（P＜0.05），SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白相對表達(dá)量高于模型組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p高于對照組（P＜0.05），SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白相對表達(dá)量低于對照組（P＜0.05）。（見圖3、表4）

圖3 3 組大鼠創(chuàng)面組織中SIRT1 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表4 3 組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p、SIRT1 mRNA 和SIRT1 蛋白表達(dá)量比較 （±s）

表4 3 組大鼠創(chuàng)面組織中miR-128-3p、SIRT1 mRNA 和SIRT1 蛋白表達(dá)量比較 （±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n 給藥劑量/（mg/kg） miR-128-3p SIRT1 mRNA SIRT1蛋白對照組 15 - 0.89±0.07 4.97±0.42 3.28±0.29模型組 15 - 3.62±0.32a 1.35±0.11a 0.94±0.07a虎杖苷組 15 40 1.56±0.11a b 3.06±0.24a b 2.15±0.18a b F 745.949 586.327 496.335 P 0.000 0.000 0.000

2.5 3組大鼠創(chuàng)面組織中自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1表達(dá)水平比較 模型組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達(dá)量及LC3Ⅱ/Ⅰ均低于對照組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達(dá)量及LC3Ⅱ/Ⅰ均高于模型組（P＜0.05）；虎杖苷組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ、Beclin1蛋白相對表達(dá)量及LC3Ⅱ/Ⅰ均低于對照組（P＜0.05）。（見圖4、表5）

圖4 3 組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ和Beclin1 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

表5 3 組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ和Beclin1 蛋白相對表達(dá)量及LC3Ⅱ/Ⅰ比較 （±s）

表5 3 組大鼠創(chuàng)面組織中LC3Ⅱ和Beclin1 蛋白相對表達(dá)量及LC3Ⅱ/Ⅰ比較 （±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別 n 給藥劑量/（mg/kg） LC3Ⅱ Beclin1 LC3Ⅱ/Ⅰ對照組 15 - 2.45±0.21 1.87±0.15 1.95±0.13模型組 15 - 0.87±0.08a 0.81±0.07a 1.12±0.1a虎杖苷組 15 40 1.94±0.17a b 1.43±0.12a b 1.54±0.21a b F 360.331 298.526 106.736 P 0.000 0.000 0.000

2.6 miR-128-3p與SIRT1靶向結(jié)合的驗(yàn)證 通過雙熒光素酶報告在內(nèi)皮祖細(xì)胞中驗(yàn)證miR-128-3p靶向SIRT1。miR-128-3p與SIRT1靶向結(jié)合位點(diǎn)見表6。同時轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic和pmiR-wt-SIRT1后祖細(xì)胞中相對熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），提示miR-128-3p可以與SIRT1靶向結(jié)合。（見表7）

表6 miR-128-3p 與SIRT1 靶向結(jié)合位點(diǎn)

表7 各組細(xì)胞中相對熒光素酶活性比較 （±s）

表7 各組細(xì)胞中相對熒光素酶活性比較 （±s）

注：與miR-128-3p NC組比較，aP＜0.05；與pmiR-mut-SIRT1組比較，bP＜0.05。

組別 n miR-128-3p NC miR-128-3p mimic pmiR-wt-SIRT1 5 1.00±0.08 0.23±0.03a b pmiR-mut-SIRT1 5 0.99±0.10 1.04±0.11 t 0.015 126.173 P 0.890 0.000

2.7 miR-128-3p對SIRT1的抑制作用 為進(jìn)一步分析驗(yàn)證miR-128-3p能夠靶向抑制SIRT1的表達(dá)，通過轉(zhuǎn)染miR-128-3p mimic 質(zhì) 粒 過 表 達(dá)miR-128-3p。miR-128-3p mimic 組miR-128-3p水平高于miR-128-3p NC組（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。miR-128-3p mimic組SIRT1 mRNA和SIRT1蛋白相對表達(dá)量低于miR-128-3p NC組（P＜0.05）。（見圖5、表8）

圖5 過表達(dá)miR-128-3p 內(nèi)皮祖細(xì)胞中SIRT1 蛋白Western blotting 圖

表8 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-128-3p、SIRT1 mRNA 和SIRT1 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表8 各組內(nèi)皮祖細(xì)胞中miR-128-3p、SIRT1 mRNA 和SIRT1 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：與miR-128-3p NC組比較，aP＜0.05。

組別 n miR-128-3p SIRT1 mRNA SIRT1蛋白miR-128-3p NC 5 1.07±0.07 4.35±0.38 2.67±0.24 miR-128-3p mimic 5 5.68±0.48a 1.14±0.09a 0.61±0.05a t 225.798 168.920 176.522 P 0.000 0.000 0.000

3 討 論

DM患者約占世界人口的9.5%，由于人們愈加不良的飲食習(xí)慣，預(yù)計到2030年，糖尿病的發(fā)病率將增加50%以上[10]。DFU是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，由神經(jīng)和血管生成受損、慢性低度炎癥等引起的足部傷口感染不受控制引起的。DM患者傷口愈合較慢而引起DFU，但是目前尚無治療DFU的方法，目前臨床治療DFU的方法以控制血糖、延緩病情進(jìn)展為主[11]。高糖微環(huán)境會引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，這不但會影響細(xì)胞新生，還會導(dǎo)致血管生成抑制和不受控制的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起潰瘍和不良的傷口愈合[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬可將細(xì)胞內(nèi)的ROS和炎癥相關(guān)蛋白運(yùn)送至溶酶體溶解，并且可通過細(xì)胞內(nèi)代謝維持細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合[13]。臨床研究顯示誘導(dǎo)自噬在促進(jìn)傷口愈合中具有關(guān)鍵作用[14]。

虎杖苷為白藜蘆醇葡萄糖苷，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎等生物學(xué)活性[15]。研究顯示積雪草苷可通過提高人黑素細(xì)胞內(nèi)的自噬通量減少ROS的生成，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受過氧化氫引起的氧化應(yīng)激損傷[16]。WANG C G等[17]研究顯示激活內(nèi)皮祖細(xì)胞中自噬可促進(jìn)SOD并抑制MDA，進(jìn)而加速傷口愈合。曹媛媛等[18]研究表明虎杖苷可通過激活細(xì)胞內(nèi)的自噬水平，緩解肺泡上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。體外研究顯示虎杖苷可通過誘導(dǎo)自噬緩解阿爾茨海默病模型細(xì)胞的損傷[19]。也有研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷可通過誘導(dǎo)自噬緩解氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而提高腎小球足細(xì)胞對高糖環(huán)境的抵抗性[20]。這提示虎杖苷可通過促進(jìn)傷口組織的自噬水平緩解高糖引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)DM模型大鼠的傷口愈合。本研究結(jié)果顯示虎杖苷可緩解DM模型大鼠的傷口潰瘍并促進(jìn)組織修復(fù)。模型組SOD低于對照組，而MDA高于對照組；虎杖苷組SOD水平高于模型組而低于對照組，MDA低于模型組而高于對照組。表明虎杖苷可能通過調(diào)控自噬來緩解糖尿病潰瘍組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

SIRT1可誘導(dǎo)肝細(xì)胞的自噬水平從而緩解胰島素抵抗[21]。有研究顯示SIRT1可被白藜蘆醇激活進(jìn)而緩解DM引起的心臟炎癥和纖維化[22]。SIRT1會受到miR-128-3p的靶向調(diào)控，miR-128-3p可通過靶向SIRT1/ROS途徑提高大腸癌對腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感性[24]。這些結(jié)果提示虎杖苷可能通過影響miR-128-3p/SIRT1自噬通路來緩解糖尿病潰瘍組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這個假設(shè)，本研究對虎杖苷調(diào)控自噬的機(jī)制進(jìn)行分析，檢測了其對miR-128-3p和SIRT1的影響。結(jié)果顯示模型組大鼠傷口周圍組織中miR-128-3p水平被上調(diào)而SIRT1轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平被下調(diào)，而虎杖苷可以抑制miR-128-3p并促進(jìn)SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。此外，本研究在內(nèi)皮祖細(xì)胞中驗(yàn)證了miR-128-3p可靶向抑制SIRT1的轉(zhuǎn)錄和翻譯。研究顯示脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體可通過抑制miR-128-3p促進(jìn)SIRT1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)DM大鼠的傷口愈合[23]。

虎杖苷可能通過抑制miR-128-3p促進(jìn)SIRT1的表達(dá)，提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的自噬，緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)抑制潰瘍的產(chǎn)生，并促進(jìn)新組織生成。虎杖苷大鼠LC3Ⅱ和Beclin1水平顯著高于模型組。為了證實(shí)miR-128-3p與SIRT1之間是否存在靶向結(jié)合作用，本研究進(jìn)行生物信息學(xué)分析和熒光素酶報告基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT1 3’-UTR存在1個miR-128-3p的結(jié)合位點(diǎn)，而且miR-128-3p mimic可減少wt-SIRT1熒光素酶活性，但對mut-SIRT1熒光素酶活性無影響，從而鑒定SIRT1為miR-128-3p的靶基因。同時過表達(dá)miR-128-3p可降低內(nèi)皮祖細(xì)胞SIRT1 mRNA與蛋白表達(dá)水平，表明miR-128-3p在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控SIRT1表達(dá)。

綜上所述，虎杖苷可能通過調(diào)節(jié)miR-128-3p/SIRT1通路誘導(dǎo)自噬，進(jìn)而緩解高糖引起的氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)DM模型大鼠的傷口愈合。但是關(guān)于虎杖苷促進(jìn)DM傷口愈合的機(jī)制仍需要及進(jìn)一步研究，并且其調(diào)控miR-128-3p/SIRT1通路的分子機(jī)制也需要深入探討。本研究結(jié)果為虎杖苷治療糖尿病潰瘍提供了新的理論基礎(chǔ)與研究思路。