趙子慧，胡思婧，陳高策，葉欣園，劉 燕，張泉龍，徐金龍，秦路平，韓 婷，張巧艷,

? 藥理與臨床 ?

基于大麻素2型受體和雌激素受體α研究升麻和黑升麻含藥血清對成骨細胞功能的影響

趙子慧1，胡思婧1，陳高策1，葉欣園1，劉 燕1，張泉龍1，徐金龍2，秦路平1，韓 婷3*，張巧艷1, 3*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053 2. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六九醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051 3. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433

研究升麻和黑升麻含藥血清基于大麻素2型受體（cannabinoid receptor type 2，CB2R）與雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）對成骨細胞骨形成的調(diào)控作用。采用高分辨質(zhì)譜法鑒定升麻和黑升麻中的化學(xué)成分；升麻與黑升麻含藥血清或與CB2R反向激動劑AM630或ERα抑制劑ICI聯(lián)合處理MC3T3-E1成骨細胞，CCK-8法測定細胞增殖活性；試劑盒測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性；茜素紅染色觀察成骨細胞骨礦化結(jié)節(jié)的形成；Western blotting檢測骨形成相關(guān)蛋白及CB2R與ERα的表達。升麻和黑升麻中分別鑒定了12、14個化學(xué)成分，其中有3個共有成分。升麻和黑升麻含藥血清可顯著增加成骨細胞的增殖、ALP活性和骨礦化結(jié)節(jié)形成，增加CB2R和ERα及骨形成相關(guān)蛋白的表達。15%升麻含藥血清對MC3T3-E1成骨細胞增殖、ALP活性、骨礦化結(jié)節(jié)形成及骨形成相關(guān)蛋白表達的促進作用可被AM630和ICI所逆轉(zhuǎn)，15%黑升麻含藥血清對MC3T3-E1細胞骨形成的促進作用僅可被ICI所逆轉(zhuǎn)。升麻含藥血清可通過CB2R與ERα雙靶點促進成骨細胞的骨形成，黑升麻含藥血清僅通過激活ERα增加成骨細胞的骨形成。

升麻；黑升麻；成骨細胞；大麻素2型受體；雌激素受體α；升麻消旋體A；7,8-二羥基升麻醇；2′--acetyl cimicifugoside H-1

骨質(zhì)疏松癥是危害老年人健康的重大疾病，其發(fā)生與骨形成的成骨細胞功能減退和骨吸收的破骨細胞活性增強有關(guān)[1-2]。成骨細胞和破骨細胞的形成分化和功能受多個靶點和信號通路的調(diào)控。大麻素2型受體（cannabinoid receptor type 2，CB2R）和雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）為調(diào)控成骨細胞和破骨細胞功能的關(guān)鍵靶點。CB2R主要存在于骨骼及外周免疫系統(tǒng)，其激動劑HU308可激活成骨細胞的CB2R，緩解雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥[3]。CB2R激動劑因其無精神成癮樣的不良反應(yīng)[4]，已成為調(diào)控骨代謝藥物研究的新熱點。ERα在成骨細胞和破骨細胞中高度表達，ERα激動劑對骨骼具有保護作用，如抗骨質(zhì)疏松藥物雷諾昔芬、他莫昔芬等。研究證明，以ERα為靶點的雷諾昔芬、他莫昔芬對CB2R也有一定的激動作用[5]。成骨細胞中CB2R和ERα的激活均可以調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路，并增強成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）的表達，促進骨形成[6-7]。因此，同時激活CB2R和ERα靶點的藥物，可顯著增強成骨細胞的骨形成，有效防治骨質(zhì)疏松癥。

升麻為毛茛科植物大三葉升麻Kom.、興安升麻(Turcz.) Maxim.或升麻L.的干燥根莖，具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)保護等多種生物活性[8-9]。在歐洲和北美，來源于同屬植物黑升麻L.的制劑常用于緩解更年期綜合征及骨質(zhì)疏松癥的治療[10-11]。研究表明升麻與黑升麻的抗骨質(zhì)疏松癥及緩解更年期癥狀的作用效果相似[12]，表明升麻也可作為替代和補充治療劑，用于骨質(zhì)疏松癥、更年期綜合征等疾病的防治。然而，升麻和黑升麻在細胞水平上對骨代謝的調(diào)控作用及機制尚不清楚。因此，本研究基于CB2R和ERα雙靶點，比較升麻與黑升麻含藥血清對成骨細胞功能的調(diào)控作用，為將升麻開發(fā)為抗骨質(zhì)疏松癥的臨床補充藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號SCXK（浙）2021-0361，動物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物研究中心，室溫（25±2）℃，相對濕度45%～50%，自由進食飲水。本研究中所有實驗動物的使用嚴格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)倫理規(guī)定（批準號20221207Aazz0619080878）。

1.2 細胞

小鼠成骨前體細胞系MC3T3-E1（目錄號GNM15）來自中國科學(xué)院（上海）細胞庫。

1.3 藥材

升麻（批號210901）購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院秦路平教授鑒定為毛茛科植物升麻L.的干燥根莖。

1.4 藥品與試劑

黑升麻制劑膠囊（批號LG15353.A01）購自澳洲Nature’s Way公司；甲酸（批號A800013）、甲醇（批號M921074）購自上海麥克林生化科技有限公司；乙腈（批號45983，色譜純）購自默克有限公司；α-MEM培養(yǎng)基（批號TBD41061）購自天津灝洋生物制品科技有限公司；4%多聚甲醛（批號R20497）購自上海源葉生物科技有限公司；磷酸酶蛋白酶抑制劑（批號P1045）、Western及IP裂解液（批號P0013J）、上樣緩沖液（批號P0015）、脫脂奶粉（批號P0216）、Western一抗稀釋液（批號P0023A）、牛血清白蛋白（批號ST023）、BCA蛋白定量試劑盒（批號P0010）、30%丙烯酰胺溶液（批號ST003）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8，批號ST788）、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8，批號ST768）、過硫酸銨（批號ST005）、TEMED（批號ST728）、DAPI染色液（批號061819191015）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號121820210416）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Tris（批號A501492-0500）、甘氨酸（批號A502065-0500）購自上海生工生物科技有限公司；胎牛血清（批號10091-148）、CB2R反向激動劑AM630（批號GC10147）、ERα抑制劑ICI（批號A1428）購自APExBIO公司；青霉素-鏈霉素（批號15140-122）購自美國GLPBIO公司；ECL顯色液（批號1925901）購自美國Millipore公司；CCK-8增殖檢測試劑盒（批號ab228554）、成骨細胞特異基因Osterix兔多克隆抗體（批號ab22552）、I型膠原蛋白（type I collagen，COL-1）兔單克隆抗體（批號ab138492）、兔抗單克隆CB2抗體（批號ab259323）、兔抗單克隆BMP2抗體（批號ab14933）、兔抗單克隆ER抗體（批號ab32063）購自英國Abcam公司；Runx2兔多克隆抗體（批號12556S）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（批號AF7021）購自美國Affinity公司。

1.5 儀器

Vanquish超高液相色譜儀、Q Exactive PLUS Mass Spectrometer質(zhì)譜儀、ST16R型低溫高速離心機、371型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；LC-10N-50A型冷凍干燥機（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；XP105型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；PowerPac Basic雙垂直電泳儀、Synergy H1型多功能酶標儀（美國伯騰公司）；Eclipse Ti-s型熒光相差倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法

2.1 樣品制備

升麻飲片100 g，用60%乙醇以1∶10的固液比回流提取2次，每次2 h，濾過濃縮后凍干，最終產(chǎn)率為19.8%。依據(jù)《中國藥典》2020年版一部中升麻成人最高劑量為10 g，按照體表面積換算得大鼠ig劑量為180 mg/kg；黑升麻膠囊推薦用量為每日0.667 g，換算得大鼠ig劑量為60 mg/kg。

2.2 升麻和黑升麻化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS分析

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取升麻提取物和黑升麻膠囊內(nèi)容物各40 mg，加入80%甲醇溶液500 μL，45 Hz、240 s加鋼珠勻漿，冰水浴超聲處理1 h，?20 ℃靜置1 h。4 ℃、12 000 r/min離心15 min后，取上清液過0.22 μm微孔濾膜于進樣瓶中備用。

2.2.2 高效液相色譜條件 Waters XSelect?HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～15 min，5%～95% B；15.0～15.1 min，95%～5% B；15.1～20.0 min，5% B。體積流量為0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量1 μL。

2.2.3 質(zhì)譜條件 鞘氣體積流量30 L/h；輔助氣體積流量10 L/h；離子透鏡電壓55.0 V；噴霧電壓3.8、?3.2 kV；毛細管溫度320 ℃；輔助氣加熱器溫度300 ℃；ESI離子源；霧化氣壓379.22 kPa；輔助氣壓379.22 kPa；氣簾氣壓241.32 kPa；溫度550 ℃；噴霧電壓5500 V（正離子模式）；轟擊能量40 eV；碰撞能差20 eV。利用控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）基于信息依賴型掃描功能（information dependent acquisition，IDA）在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強度最強且大于100的分子離子采集二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。使用Progenesis QI軟件導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)，進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分和峰對齊等，利用自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法進行鑒定。

2.3 升麻及黑升麻含藥血清的制備

60只大鼠稱定體質(zhì)量（）后分為3個區(qū)組，第1區(qū)組18只（200 g≤＜210 g），第2區(qū)組18只（210 g≤＜230 g），第3區(qū)組24只（230 g≤≤250 g），依次對大鼠進行編號，按照完全隨機法分為3個給藥組，每組20只，分別ig生理鹽水、180 mg/kg升麻提取物、60 mg/kg黑升麻膠囊內(nèi)容物，1次/d；各組連續(xù)給藥7 d后，腹主動脈取血，4 ℃靜置2 h，3000 r/min離心15 min，分離上清液，為消除個體化差異將3個給藥組血清分別合并后，56 ℃滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜濾過除菌后分裝，凍存于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 細胞培養(yǎng)

將狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至70%～80%時傳代，用于后續(xù)實驗。）

2.5 成骨細胞的處理及指標測定

2.5.1 藥物處理 MC3T3-E1細胞培養(yǎng)24 h，用5%、10%、15%的升麻或黑升麻含藥血清處理后，進行指標測定。為了觀察CB2R和ERα抑制劑對升麻含藥血清對成骨細胞作用的逆轉(zhuǎn)作用，在細胞給藥前30 min，加入1 μmol/L CB2R反向激動劑AM630，或者1 μmol/L ERα抑制劑ICI，培養(yǎng)，進行指標測定。

2.5.2 成骨細胞增殖和ALP活性檢測 將MC3T3-E1細胞以1×104/孔接種于96孔板，細胞貼壁后，分別加入升麻或黑升麻含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)30 min后，測定450 nm處的吸光度（）值。

MC3T3-E1細胞以5×103/孔接種于96孔板中，按“2.5.1”項下方法處理，加入成骨誘導(dǎo)液（5×10?3mol/Lβ-甘油磷酸、100 mg/L抗壞血酸和1×10?8mol/L地塞米松）誘導(dǎo)成骨分化。給藥7 d，按照試劑盒說明書測定ALP活性。將培養(yǎng)的細胞用預(yù)冷的PBS沖洗2次，加入ALP染色液，37 ℃染色30 min后，PBS洗滌細胞3次，顯微鏡下觀察拍照。

2.5.3 骨礦化結(jié)節(jié)誘導(dǎo)及茜素紅ARS染色 將MC3T3-E1細胞以1×104/孔接種96孔板中，按“2.5.1”項下方法處理，成骨誘導(dǎo)14 d后，用預(yù)冷的PBS沖洗細胞2次，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛中固定30 min，用含40 mmol/L茜素紅的ARS（pH 4.2）染色30 min，光學(xué)顯微鏡下觀察成骨細胞骨礦化結(jié)節(jié)的形態(tài)和數(shù)目。用10%氯化十六烷吡啶磷酸鈉溶解骨結(jié)節(jié)，并在570 nm處測定值。

2.5.4 Western blotting分析 將MC3T3-E1細胞以2×105/孔接種于6孔板中，按“2.5.1”項下方法處理，成骨誘導(dǎo)7 d后，用預(yù)冷的PBS沖洗細胞3次，每孔加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心，取上清，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度后變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%胎牛血清蛋白封閉后，分別加入成骨相關(guān)蛋白抗體（1∶1000）、GAPDH抗體（1∶1000）、CB2R抗體（1∶500）、ERα抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶3000），37 ℃孵育1 h，用MONAD QuickChemi 5100化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影并定量分析條帶。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 基于UPLC/Q-TOF/MS的升麻和黑升麻化學(xué)成分的比較

收集整理國內(nèi)外升麻屬植物化學(xué)成分研究的相關(guān)文獻，建立包括化合物英文名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式、精確相對分子質(zhì)量及特征碎片的化學(xué)成分文獻信息數(shù)據(jù)庫，比較化學(xué)成分的質(zhì)譜信息，對檢測到的化合物進行鑒定。如圖1所示，在正離子模式下采集數(shù)據(jù)，通過對保留時間、精確相對分子質(zhì)量及二級質(zhì)譜碎片等的對比分析，從升麻提取物中共鑒定12個化學(xué)成分，包括升麻酸C、norkhelloside、升麻消旋體A、cimiheracleins A、cimigenol-3--β--galactopyranoside、7,8-二羥基升麻醇、25-methoxy-24--acetylisohurinol、2′--acetyl cimicifugoside H-1、25--methylcimigenol-3--α--ara、cimiracemoside C、金龜草二醇和升麻醇-3-酮；從黑升麻膠囊內(nèi)容物中共鑒定14個化學(xué)成分，包括去甲豬毛菜堿、cimicifugolide C、升麻酸A、15,16--14-carboxyl-16-oxo-hydro-shengmanol-3--β--xyl、3--α--ara-24--acetylhydroshengmanol-15--β--glucose、3,4-二甲氧基肉桂酸、升麻消旋體A、阿克特素、15,16--升麻新醇C、7,8-二羥基升麻醇、cimiracemoside J、2′--acetyl cimicifugoside H-1、cimicinol和24--acetylhydroshengmanol，其中升麻和黑升麻提取物中均檢測到的成分為升麻消旋體A、7,8-二羥基升麻醇及2′--acetyl cimicifugoside H-1。

1-升麻酸C 2-norkhelloside 3-升麻消旋體A 4-cimiheracleins A 5-cimigenol-3-O-β-D-galactopyranoside 6-7,8-二羥基升麻醇 7-25-methoxy-24-O-acetylisohurinol 8-2′-O-acetyl cimicifugoside H-1 9-25-O-methylcimigenol-3-O-α-L-ara 10-cimiracemoside C 11-金龜草二醇 12-升麻醇-3-酮 13-去甲豬毛菜堿 14-cimicifugolide C 15-升麻酸A 16-15,16-seco-14-carboxyl-16-oxo-hydro-shengmanol-3-O-β-D-xyl 17-3-O-α-L-ara-24-O-acetylhydroshengmanol-15-O-β-D-glucose 18-3,4-二甲氧基肉桂酸 19-阿克特素 20-15,16-seco-升麻新醇C 21-cimiracemoside J 22-cimicinol 23-24-O-acetylhydroshengmanol

3.2 升麻與黑升麻含藥血清基于CB2R及ERα對MC3T3-E1細胞增殖的影響

如表1所示，5%、10%和15%的升麻和黑升麻含藥血清作用24 h，對MC3T3-E1細胞的增殖均無顯著影響。5%和10%的升麻和黑升麻含藥血清作用24 h，對MC3T3-E1細胞的增殖均無顯著影響。升麻和黑升麻含藥血清分別作用48 h均可劑量相關(guān)性地顯著促進MC3T3-E1細胞的增殖（＜0.05、0.01、0.001）。CB2R反向激動劑AM630或ERα抑制劑ICI預(yù)處理后能逆轉(zhuǎn)15%升麻或黑升麻含藥血清對成骨細胞增殖的促進作用（＜0.01、0.001）；AM630和ICI共同處理后更加有效逆轉(zhuǎn)升麻或黑升麻含藥血清對成骨細胞增殖的促進作用（＜0.001），表明升麻或黑升麻含藥血清可能通過激活CB2R和ERα增加成骨細胞的增殖。

3.3 升麻與黑升麻含藥血清基于CB2R及ERα對MC3T3-E1細胞ALP活性的影響

成骨細胞表達ALP，參與其分化和骨基質(zhì)的礦化。ALP活性常用于表征成骨細胞的分化和骨基質(zhì)礦化功能。如圖2所示，5%、10%和15%的升麻與黑升麻含藥血清均可顯著增加成骨細胞ALP活性，且呈劑量相關(guān)性（＜0.01、0.001）。AM630、ICI及二者共同預(yù)處理均可逆轉(zhuǎn)15%升麻含藥血清對成骨細胞ALP活性的促進作用（＜0.001），且AM630和ICI共同處理的逆轉(zhuǎn)作用更為顯著（＜0.01、0.001），表明升麻通過激活CB2R及ERα增加成骨細胞ALP的活性。AM630預(yù)處理不能逆轉(zhuǎn)15%黑升麻含藥血清對成骨細胞ALP的促進作用，而ICI預(yù)處理能夠逆轉(zhuǎn)15%黑升麻含藥血清對ALP活性的促進作用，表明黑升麻可能僅通過激活ERα增加成骨細胞ALP的活性。

表1 升麻與黑升麻含藥血清對MC3T3-E1細胞增殖的影響及AM630和ICI的逆轉(zhuǎn)作用(, n = 3)

與含相同濃度血清的對照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與無AM630或ICI的15%藥物處理組比較：◆＜0.05◆◆＜0.01◆◆◆＜0.001

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group containing the same concentration of serum;◆< 0.05◆◆< 0.01◆◆◆< 0.00115% drug treatment group without AM630 or ICI

與對照組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與無AM630或ICI的15%藥物處理組比較：◆＜0.05◆◆＜0.01◆◆◆＜0.001；與AM630及ICI聯(lián)合給藥組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，圖3、5、6同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001control group;◆< 0.05◆◆< 0.01◆◆◆< 0.00115% corresponding drug treatment group without AM630 or ICI;#< 0.05##< 0.01###< 0.001AM630 and ICI combined administration group, same as figs. 3, 5 ,6

3.4 升麻與黑升麻含藥血清基于CB2R及ERα對MC3T3-E1細胞骨礦化結(jié)節(jié)形成的影響

成骨細胞通過礦化產(chǎn)生骨基質(zhì)，增加骨量。如圖3所示，5%、10%和15%的升麻與黑升麻含藥血清均可顯著促進成骨細胞礦化結(jié)節(jié)的形成（＜0.01、0.001）。AM630和ICI預(yù)處理均可逆轉(zhuǎn)15%升麻含藥血清對成骨細胞礦化結(jié)節(jié)形成的促進作用（＜0.001），且AM630和ICI共同處理后，逆轉(zhuǎn)作用更加顯著（＜0.01、0.001），表明升麻含藥血清通過激活CB2R及ERα增加成骨細胞的礦化。ICI預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)15%黑升麻含藥血清對骨礦化結(jié)節(jié)的促進作用（＜0.05），但AM630預(yù)處理對不能逆轉(zhuǎn)15%黑升麻含藥血清對骨礦化結(jié)節(jié)的促進作用，表明黑升麻僅通過激活ERα增加成骨細胞的礦化。

圖3 升麻與黑升麻含藥血清對MC3T3-E1細胞骨礦化結(jié)節(jié)形成的影響及AM630和ICI的逆轉(zhuǎn)作用(, n = 3)

3.5 升麻與黑升麻含藥血清對MC3T3-E1細胞CB2R與ER-α及骨形成相關(guān)蛋白表達的影響

BMP2、Runx2和Osterix是參與成骨細胞功能調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，COL-1是成骨細胞分泌的基質(zhì)蛋白，這些蛋白表達水平的高低，反映了成骨細胞的骨形成能力。如圖4所示，5%、10%和15%的升麻與黑升麻含藥血清均可顯著上調(diào)成骨細胞BMP2、Runx2、Osterix及COL-1的表達（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性，表明升麻和黑升麻含藥血清可促進成骨細胞的形成和分化。

如圖5所示，15%的升麻含藥血清可顯著上調(diào)成骨細胞CB2R與ERα，及骨形成相關(guān)蛋白BMP2、Runx2、Osterix及COL-1的表達（＜0.001），AM630、ICI或兩者共同預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)15%升麻含藥血清對成骨細胞CB2R、ERα及骨形成蛋白BMP2、Runx2、Osterix及COL-1表達的促進作用（＜0.05、0.01、0.001），進一步表明升麻含藥血清通過激活CB2R與ERα促進成骨細胞的形成、分化和骨礦化作用。

如圖6所示，15%的黑升麻含藥血清可顯著上調(diào)成骨細胞CB2R與ERα，及骨形成相關(guān)蛋白BMP2、Runx2、Osterix及COL-1的表達，其對成骨細胞關(guān)鍵蛋白表達的增強作用可被ICI逆轉(zhuǎn)，而不能被AM630逆轉(zhuǎn)。

與對照5%組比較：◆P＜0.05 ◆◆◆P＜0.001；與對照10%組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001；與對照15%組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001

圖5 升麻含藥血清對成骨細胞CB2R與ERα及骨形成相關(guān)蛋白表達影響及AM630和ICI的逆轉(zhuǎn)作用(, n = 3)

圖6 黑升麻含藥血清對成骨細胞CB2R與ERα及骨形成相關(guān)蛋白表達影響及AM630和ICI的逆轉(zhuǎn)作用(, n = 3)

4 討論

目前，骨質(zhì)疏松癥的治療藥物如雌激素、雙磷酸鹽、甲狀旁腺素等均存在一定程度的不良反應(yīng)。中藥和天然藥物均有不良反應(yīng)小、可長期服用等特點，在骨質(zhì)疏松癥的防治上具有明顯的優(yōu)勢[13-14]。動物實驗研究表明升麻和黑升麻提取物可顯著減少去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨丟失[15-16]。黑升麻在歐美長期用于防治更年期綜合征和骨質(zhì)疏松癥。本研究發(fā)現(xiàn)升麻與黑升麻含藥血清可顯著增加成骨細胞的增殖活性、ALP活性、骨礦化結(jié)節(jié)形成及成骨細胞BMP2和Runx2等關(guān)鍵蛋白的表達，顯示出確切的促進成骨細胞骨形成的作用。升麻含藥血清對成骨細胞功能的促進作用可被CB2R反向激動劑AM630或ERα抑制劑ICI所逆轉(zhuǎn)，表明升麻含藥血清可能通過激活CB2R與ERα雙靶點發(fā)揮調(diào)控骨代謝的作用。黑升麻含藥血清對成骨細胞功能的促進作用僅可被ERα抑制劑ICI逆轉(zhuǎn)，CB2R反向激動劑AM630對黑升麻含藥血清促進成骨細胞功能的作用沒有顯著影響，表明黑升麻僅通過激活ERα促進成骨細胞的骨形成。這些結(jié)果可為升麻和黑升麻臨床用于防治骨質(zhì)疏松癥提供科學(xué)的依據(jù)。

成骨細胞的分化和骨形成在維持骨重塑平衡和骨量方面起著關(guān)鍵作用。成骨細胞是參與骨形成的關(guān)鍵效應(yīng)細胞，負責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，并完成骨重建。BMP在未分化間充質(zhì)細胞向成骨細胞的分化中起關(guān)鍵作用，Runx2和Osterix是成骨細胞分化和骨形成所需的轉(zhuǎn)錄因子[17]。MC3T3-E1細胞系是小鼠成骨前體細胞系，該細胞系在體外經(jīng)誘導(dǎo)可分化為成骨模型，常用于研究藥物對成骨細胞增殖和分化影響的研究。本實驗觀察升麻和黑升麻含藥血清對MC3T3-E1的增殖、分化、礦化及關(guān)鍵蛋白表達的影響，發(fā)現(xiàn)升麻和黑升麻含藥血清能顯著促進成骨細胞的增殖、ALP的活性、骨礦化結(jié)節(jié)的形成及骨形成關(guān)鍵蛋白的表達，具有抗骨質(zhì)疏松癥的作用。在成骨細胞增殖研究中，發(fā)現(xiàn)含藥血清干預(yù)成骨細胞24、48、72 h中，僅在48 h有顯著的增殖作用，在24、72 h增殖效果不顯著，可能是因為藥物干預(yù)24 h后，藥效作用于成骨細胞時間較短，未有顯著增殖；藥物干預(yù)72 h后增殖效果不顯著，可能是因為成骨細胞在給藥48 h后達到一定程度增殖，所以對照組與給藥處理未顯示出差別。

CB2R可在成骨細胞上表達，激活成骨細胞CB2R的表達，可增加成骨細胞的骨形成作用[18]。成骨細胞CB2R的表達增加，可激活BMP/Wnt/β-catenin通路，增加Runx2和BMP2的表達，進而促進成骨細胞的增殖、ALP活性和骨基質(zhì)礦化。本研究發(fā)現(xiàn)升麻與黑升麻含藥血清作用于成骨細胞后，可促進成骨細胞增殖、ALP活性和骨礦化結(jié)節(jié)形成及Osterix、BMP2、Runx2及COL-1的表達，CB2R反向激動劑AM630可以逆轉(zhuǎn)升麻含藥血清對成骨細胞的作用，而不能逆轉(zhuǎn)黑升麻含藥血清的作用，表明升麻含藥血清通過激活CB2R促進骨形成相關(guān)蛋白的表達調(diào)控成骨細胞功能，而黑升麻則可能不是通過直接激活CB2R發(fā)揮促進成骨細胞骨形成作用的。

ERα為成骨細胞上調(diào)控骨代謝的關(guān)鍵靶點，雌激素通過ERα在維持骨骼穩(wěn)態(tài)和防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮著重要作用。臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的藥物如戊酸雌二醇、他莫昔芬和雷諾昔芬等選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑均以ERα為靶點發(fā)揮調(diào)控骨代謝作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)升麻與黑升麻含藥血清對成骨細胞功能的促進作用可被雌激素受體拮抗劑ICI所逆轉(zhuǎn)，顯示升麻和黑升麻可通過ERα調(diào)控成骨細胞的功能。然而，對ERα具有激動活性的藥物?？梢鹑橄侔?、子宮內(nèi)膜癌及心血管疾病等不良反應(yīng)[20-22]，因此，后期需要進一步評價升麻和黑升麻用于骨質(zhì)疏松癥防治可能產(chǎn)生的相關(guān)不良反應(yīng)。

升麻和歐美常用的天然藥物黑升麻均來源于毛茛科升麻屬植物，均具有三萜及苷類、酚酸類、色酮類、生物堿、含氮類等化合物[23]。本研究鑒定了升麻提取物中三萜及苷類8個、酚酸類1個、色酮類2個；天然藥物黑升麻中三萜及苷類8個、酚酸類3個、生物堿類1個。其中共有成分3種，分別為酚酸類成分升麻消旋體A、三萜及苷類成分7,8-二羥基升麻醇和2′--acetyl cimicifugoside H-1。升麻中三萜及其苷類主要為升麻苷H-1，其質(zhì)量分數(shù)為0.53%～1.09%[24]；酚酸類以咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸為主，質(zhì)量分數(shù)分別為0.57%～1.75%、0.22%～1.79%、12.18%[25]；色酮類以升麻素為主，質(zhì)量分數(shù)為0.73%～5.81%[24]。天然藥物黑升麻膠囊內(nèi)容物的主要成分為三萜及其苷類成分，其質(zhì)量分數(shù)為2.5%。本研究發(fā)現(xiàn)升麻可能通過激活CB2R與ERα發(fā)揮促進成骨細胞增殖、分化和骨基質(zhì)礦化的作用，表明升麻含有CB2R和ERα激動劑類化學(xué)成分；但黑升麻可能僅通過激活ERα發(fā)揮促進成骨細胞增殖、分化和骨基質(zhì)礦化的作用。因此，后續(xù)有必要深入挖掘升麻和黑升麻對CB2R和ERα有激動作用的化學(xué)成分，明確其結(jié)構(gòu)特征，為進一步的升麻和黑升麻調(diào)控骨代謝的機制闡明及新型抗骨質(zhì)疏松癥先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Aspray T J, Hill T R. Osteoporosis and the ageing skeleton [J]., 2019, 91: 453-476.

[2] Kim J M, Lin C J, Stavre Z,. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis [J]., 2020, 9(9): 2073.

[3] Xu A H, Yang Y, Shao Y,. Activation of cannabinoid receptor type 2-induced osteogenic differentiation involves autophagy induction and p62-mediated Nrf2 deactivation [J]., 2020, 18(1): 9.

[4] Apostu D, Lucaciu O, Mester A,. Cannabinoids and bone regeneration [J]., 2019, 51(1): 65-75.

[5] Franks L N, Ford B M, Fujiwara T,. The tamoxifen derivative ridaifen-B is a high affinity selective CB2 receptor inverse agonist exhibiting anti-inflammatory and anti-osteoclastogenic effects [J]., 2018, 353: 31-42.

[6] Sun Y X, Xu A H, Yang Y,. Activation of cannabinoid receptor 2 enhances osteogenic differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells [J]., 2015, 2015: 874982.

[7] Tian F, Yang H T, Huang T,. Involvement of CB2 signalling pathway in the development of osteoporosis by regulating the proliferation and differentiation of hBMSCs [J]., 2021, 25(5): 2426-2435.

[8] 陳李乙, 李佳欣, 張美晴, 等. 升麻藥材化學(xué)成分及藥理作用研究進展 [J]. 中草藥, 2023, 54(5): 1685-1704.

[9] 李玥鍇, 李欽琳, 韓凌, 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的升麻治療乳腺癌作用機制研究[J]. 藥物評價研究, 2022, 45(4): 642-651.

[10] Castelo-Branco C, Gambacciani M, Cano A,. Review & meta-analysis: Isopropanolic black cohosh extract iCR for menopausal symptoms - an update on the evidence [J]., 2021, 24(2): 109-119.

[11] Qin Z Y, Dong Z Y, Liu J L,. A preliminary study on the effects of black cohosh preparations on bone metabolism of rat models with GnRH-a-induced peri-menopausal symptoms [J]., 2022, 13: 854345.

[12] Miao L Y, Chu T T H, Li P,.is therapeutically similar to black cohosh in relieving menopausal symptoms: Evidence from pharmacological and metabolomics studies [J]., 2019, 17(6): 435-445.

[13] Martiniakova M, Babikova M, Omelka R. Pharmacological agents and natural compounds: Available treatments for osteoporosis [J]., 2020, 71(3): 307-320.

[14] Zhuo Y, Li M, Jiang Q Y,. Evolving roles of natural terpenoids from traditional Chinese medicine in the treatment of osteoporosis [J]., 2022, 13: 901545.

[15] Ahn B S, Yang M, Jang H,. Evaluation of the antiosteoporotic potential ofin female mice [J]., 2012, 26(5): 663-668.

[16] Chen J M, Wang H H, Dong Z Y,. GnRH-a-induced perimenopausal rat modeling and black cohosh preparations' effect on rat’s reproductive endocrine [J]., 2021, 12: 683552.

[17] Ponzetti M, Rucci N. Osteoblast differentiation and signaling: Established concepts and emerging topics [J]., 2021, 22(13): 6651.

[18] Rossi F, Tortora C, Punzo F,. The endocannabinoid/endovanilloid system in bone: From osteoporosis to osteosarcoma [J]., 2019, 20(8): 1919.

[19] Lee Y S, Gupta R, Kwon J T,. Effect of a bisphosphonate and selective estrogen receptor modulator on bone remodeling in streptozotocin-induced diabetes and ovariectomized rat model [J]., 2018, 18(10): 1877-1887.

[20] Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Aromatase inhibitors versus tamoxifen in premenopausal women with oestrogen receptor-positive early-stage breast cancer treated with ovarian suppression: A patient-level meta-analysis of 7030 women from four randomised trials [J]., 2022, 23(3): 382-392.

[21] Machek S B, Cardaci T D, Wilburn D T,. Considerations, possible contraindications, and potential mechanisms for deleterious effect in recreational and athletic use of selective androgen receptor modulators (SARMs) in lieu of anabolic androgenic steroids: A narrative review [J]., 2020, 164: 108753.

[22] Liang B, Burley G, Lin S,. Osteoporosis pathogenesis and treatment: Existing and emerging avenues [J]., 2022, 27(1): 72.

[23] Salari S, Amiri M S, Ramezani M,. Ethnobotany, phytochemistry, traditional and modern uses ofL. (black cohosh): A review [J]., 2021, 1308: 403-449.

[24] 姚梅芬, 王岳峰, 李展, 等. 反相高效液相色譜法測定升麻藥材中升麻苷H-1的含量 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2011, 23(4): 696-699.

[25] 姜柔齊, 常麗靜, 李明月, 等. 不同基原升麻飲片HPLC指紋圖譜研究及4個成分含量測定 [J]. 中藥材, 2021, 44(5): 1161-1167.

Effects ofand black cohosh medicated serum on osteoblasts functions based on CB2R and ERα

ZHAO Zi-hui1, HU Si-jing1, CHEN Gao-ce1, YE Xin-yuan1, LIU Yan1, ZHANG Quan-long1, XU Jin-long2, QIN Lu-ping1, HAN Ting3, ZHANG Qiao-yan1, 3

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. 969 Hospital of PLA Joint Logistics Support Forces, Hohhot 010051, China 3. School of Pharmacy, Naval Medical University, Shanghai 200433, China

To study the regulatory effects ofand black cohosh medicated serum on osteoblastic bone formation based on cannabinoid receptor type 2 (CB2R) and estrogen receptor α (ERα).High-resolution mass spectrum was used to identify the chemical constituents inand black cohosh. The osteoblastic MC3T3-E1 cells were treated with various concentrationsand black cohosh medicated serum or the combination with CB2R inverse agonist AM630 or ERα antagonist ICI. CCK-8 method was used to determine the proliferation of MC3T3-E1 cells. The assay kit was used to measure the alkaline phosphatase (ALP) activity. The alizarin red staining was used to detect the formation of bone mineralized nodules in MC3T3-E1 cells. Western blotting was applied to analyze the expressions of CB2R, ERα and related proteins with osteoblastic bone formation.A total of 12 chemical constituents were identified in, and 14 constituents in black cohosh, with three common constituents. Bothand black cohosh medicated serum significantly increased the proliferation, ALP activity and the formation of bone mineralized nodules, and also enhanced the expression of CB2R, ERα and related proteins associated with osteoblastic bone formation. Moreover, the promoting effects 15%medicated serum on osteoblastic MC3T3-E1 cells could be reversed by AM630 and ICI, while the improvement effects of 15% black cohosh medicated serum on osteoblast only could be reversed by ICI.medicated serum increased the osteoblastic bone formation via activation of CB2R and ERα and black cohosh medicated serum enhanced the osteoblastic bone formation only via activiation of ERα.

L.; black cohosh; osteoblast; cannabinoid receptor type 2; estrogen receptor α; cimicifugate racemimer A; 7,8-dihydroxy cohoshol; 2′--acetyl cimicifugoside H-1

R285.5

A

0253 - 2670(2023)18 - 5941 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.012

2023-05-05

上海市科委科技支撐計劃項目（22S21901600）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81973534）

趙子慧，女，碩士研究生，研究方向為中藥活性成分及其作用。E-mail: zzh18684297873@163.com

韓 婷，教授，主要從事中藥活性成分及資源開發(fā)利用研究。E-mail: hanting@smmu.edu.cn

張巧艷，教授，主要從事中藥活性成分及其作用機制研究。E-mail: zqy1965@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]