葛修通，趙佳慧，任文靜，周 悅，張 凡, 2*

黃柏不同炮制品中生物堿類成分在腎小管上皮細(xì)胞中的攝入差異考察

葛修通1，趙佳慧1，任文靜1，周 悅1，張 凡1, 2*

1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116000 2. 遼寧省中藥炮制專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116000

探討人腎小管上皮HK-2細(xì)胞攝取黃柏中生物堿類成分的情況，以及HK-2細(xì)胞攝取黃柏中生物堿類成分的途徑，從細(xì)胞層面驗(yàn)證黃柏“鹽炙入腎”理論。利用UPLC-QqQ-MS技術(shù)分析HK-2細(xì)胞攝取生黃柏、鹽黃柏和酒黃柏中的黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、小檗紅堿和小檗堿5種成分差異，黃柏及其炮制品中5種生物堿類成分隨著給藥時(shí)間的含量變化；以及分析有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（organic anion transporters，OATs）抑制劑丙磺舒和有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（organic cation transporters，OCTs）抑制劑四乙基氯化銨對(duì)HK-2細(xì)胞攝取黃柏及其炮制品中5種生物堿類成分的影響。HK-2細(xì)胞對(duì)黃柏不同炮制品攝取差異表現(xiàn)為鹽黃柏組＞生黃柏組＞酒黃柏組。抑制劑組HK-2細(xì)胞攝取差異主要表現(xiàn)為丙磺舒（OATs抑制劑）組＞四乙氯化基銨（OCTs抑制劑）組。黃柏中生物堿成分可以被HK-2細(xì)胞攝取，其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制主要是OCTs介導(dǎo)的結(jié)果。鹽炙品生物堿攝取較高，可能是鹽炙提高了腎臟攝取型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性。

黃柏；鹽炙；腎小管上皮細(xì)胞；UPLC-QqQ-MS；黃柏堿；木蘭花堿；藥根堿；小檗紅堿；小檗堿；有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Schneid.的干燥樹皮，味苦、性寒，歸腎、膀胱經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、消腫祛腐等功效[1]?！侗静菥V目》提出：“黃檗性寒而沉，生用則降實(shí)火，熟用則不傷胃，酒炙則治上，鹽炙則治下，蜜炙則治中?！睂?duì)黃柏的炮制方法進(jìn)行了總體的概括。黃柏目前的主流炮制品種為生黃柏、鹽黃柏、酒黃柏，在不同炮制方法下，黃柏的化學(xué)成分、含量以及藥理作用也會(huì)產(chǎn)生變化[2-4]。生黃柏多用于濕熱瀉痢、濕熱黃疸、小便淋瀝澀痛以及濕疹等癥；鹽炙可引藥下行入腎，治陰虛火旺、潮熱盜汗、咳嗽咯血以及耳鳴遺精等癥；酒炙又引藥上行頭目，清上焦?jié)駸幔糜陬^暈?zāi)垦?、口舌生瘡以及耳痛耳鳴等癥[5]。

“鹽炙入腎”這一理論為歷代醫(yī)家所認(rèn)可，經(jīng)考證，《本草蒙筌》第一次系統(tǒng)地概括了炮制的輔藥作用論，提出“入鹽走腎臟，仍仗軟堅(jiān)”；《本草綱目》也曾記載：“故服補(bǔ)腎藥用鹽湯者，咸歸腎，引藥氣入本臟也”。目前對(duì)于黃柏“鹽炙入腎”的機(jī)制并未得到全面且深入的闡釋，仍缺乏現(xiàn)代系統(tǒng)研究。因此探尋黃柏不同炮制品在腎臟中的攝取差異，以及腎臟攝入黃柏不同炮制品中生物堿類成分的可能途徑具有重要意義。

藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)藥物在體內(nèi)的吸收和外排，腎臟的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體主要表達(dá)于腎小管近端的上皮細(xì)胞中，其中吸收型藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體主要為有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（organic cation transporters，OCTs）和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（organic anion transporters，OATs），同時(shí)腎小管上皮細(xì)胞也是參與藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的最主要細(xì)胞[6-8]。目前對(duì)于黃柏“鹽炙入腎”的機(jī)制探究，多采用體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)變化以及組織分布等方面來(lái)進(jìn)行闡述。本研究運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，通過(guò)UPLC-QqQ-MS技術(shù)對(duì)黃柏不同炮制品中生物堿成分在人近端腎小管上皮HK-2細(xì)胞的吸收率，以及OATs抑制劑丙磺舒[9]和OCTs抑制劑四乙基氯化銨[10]對(duì)HK-2細(xì)胞攝取黃柏不同炮制品中生物堿的情況2方面來(lái)探究黃柏內(nèi)生物堿類成分在腎中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

1 材料

1.1 藥材

黃柏購(gòu)自四川雅安，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹Schneid.的干燥樹皮。

1.2 細(xì)胞

HK-2細(xì)胞購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)為20210527A2。

1.3 藥品與試劑

DMEM/f12培養(yǎng)基（批號(hào)8122311）、PBS緩沖液（批號(hào)20210927）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清（批號(hào)ST200913）購(gòu)自德國(guó)PAN公司；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合三抗液（批號(hào)20220519JH）、二甲基亞砜（批號(hào)710N0310）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（批號(hào)MA0233-Jul-05G2）、CCK-8試劑盒（批號(hào)MA0218-5-Sep-27H1）、小檗紅堿對(duì)照品（批號(hào)A1107AS）、黃柏堿對(duì)照品（批號(hào)M0107AS）購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司；木蘭花堿對(duì)照品（批號(hào)wkq16050801）購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)MUST-16040702）、鹽酸藥根堿對(duì)照品（批號(hào)MUST-16040702）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，以上對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；丙磺舒（批號(hào)C14488578）、四乙基氯化銨（批號(hào)C13917729）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.4 儀器

Waters Acquity UPLC/Xevo TQD超高效液相色譜串聯(lián)飛行質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；ZHJH-C1112B型超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）；MCO-15AC型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；NIB-100型倒置顯微鏡（寧波永新光學(xué)股份有限公司）；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；LX-800型調(diào)速型迷你離心機(jī)（上海生工生物工程股份有限公司）；手動(dòng)移液器（艾本德上海國(guó)際貿(mào)易有限公司）。

2 方法

2.1 炮制品制備

2.1.1 生黃柏制備 取黃柏原藥材，除去雜質(zhì)，噴淋清水，潤(rùn)透，干燥。

2.1.2 鹽黃柏制備 取凈黃柏絲，用鹽水拌勻，悶潤(rùn)2 h，待鹽水被吸盡后，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱至160 ℃時(shí)炒至焦黃，取出晾涼。每100克黃柏絲，用食鹽2 g。

2.1.3 酒黃柏制備 取凈黃柏絲，用黃酒拌勻，悶潤(rùn)2 h，待黃酒被吸盡后，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱至160 ℃時(shí)炒至焦黃，取出晾涼。每100克黃柏絲，用黃酒20 mL。

2.1.4 黃柏凍干粉制備 取生黃柏、鹽黃柏和酒黃柏，加入10倍量蒸餾水，浸泡30 min，強(qiáng)火加熱煮沸后調(diào)整至文火煎煮60 min，攪拌，濾過(guò)；藥渣再加入8倍量蒸餾水，按上法煎熬、濾過(guò)；合并2次藥液并濃縮后放入?80 ℃冷藏過(guò)夜，置于凍干機(jī)真空凍干24 h，制備成相應(yīng)黃柏及炮制品的凍干粉。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、小檗紅堿、小檗堿對(duì)照品適量，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.065 6、0.080 0、0.065 6、0.065 2、0.066 0 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 黃柏不同炮制品給藥液 分別精密稱取生黃柏、鹽黃柏、酒黃柏凍干粉適量，加入含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合三抗液的DMEM/f12培養(yǎng)基，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)配制成3200、1600、800、400、200、100、50、25 μg/mL的黃柏及不同炮制品給藥液。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B混合三抗液的DMEM/f12培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。每2～3天換1次完全培養(yǎng)基。顯微鏡下觀察，待細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)用胰蛋白酶消化，將細(xì)胞懸液收集于15 mL離心管中，1500 r/min離心5 min，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基，混勻后按1∶2比例進(jìn)行傳代。

2.4 黃柏給藥液對(duì)HK-2細(xì)胞的最大安全濃度的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第5代HK-2細(xì)胞，調(diào)整密度為5×104/mL，吸取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在實(shí)驗(yàn)孔中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的黃柏炮制品給藥液處理細(xì)胞，對(duì)照組加入100 μL不含藥物的培養(yǎng)基，另設(shè)置未接種細(xì)胞的空白孔，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行孔。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，再加入CCK-8溶液10 μL，移至培養(yǎng)箱孵育4 h取出，在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，以三者相對(duì)最大存活率濃度作為后期細(xì)胞給藥濃度。

細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)－空白)/(對(duì)照－空白)

2.5 HK-2細(xì)胞內(nèi)黃柏不同炮制品中生物堿含量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、生黃柏、鹽黃柏和酒黃柏給藥組，每組3個(gè)平行孔。將HK-2細(xì)胞接種至24孔板內(nèi)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，分別在生黃柏、鹽黃柏和酒黃柏給藥組加入對(duì)應(yīng)的400 μL黃柏不同炮制品給藥液，空白對(duì)照組加入400 μL完全培養(yǎng)基，分別作用1、4、6、9 h后棄去上清液，PBS清洗3次，留取第3次洗液500 μL待檢[11]。加500 μL純水于24孔板，?80 ℃保存。細(xì)胞反復(fù)凍融破碎后，測(cè)定細(xì)胞中各成分的含量。

2.6 黃柏生物堿進(jìn)入HK-2細(xì)胞途徑考察

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、生黃柏、鹽黃柏和酒黃柏給藥組，丙磺舒、四乙基氯化銨生黃柏給藥組，丙磺舒、四乙基氯化銨銨鹽黃柏給藥組和丙磺舒、四乙基氯化銨酒黃柏給藥組，每組3個(gè)平行孔。抑制劑組分別用1 mmol/L對(duì)應(yīng)分組抑制劑處理30 min[12-13]，其余操作與“2.5”項(xiàng)下相同。

2.7 HK-2細(xì)胞樣品前處理

取“2.5”項(xiàng)以及“2.6”項(xiàng)下細(xì)胞，于?80 ℃反復(fù)凍融3次破壞細(xì)胞膜，在破碎的細(xì)胞液中加入1 mL甲醇沉淀蛋白，吸出孔內(nèi)液體，12 000 r/min離心20 min，收集上清液并以氮?dú)獯蹈?。將吹干處理后的?次洗液和細(xì)胞破碎液加入500 μL甲醇復(fù)溶，渦旋2 min混勻后，12 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測(cè)樣品進(jìn)行UPLC-QqQ-MS檢測(cè)。

2.8 采用UPLC-QqQ-MS對(duì)生物堿的含量測(cè)定

2.8.1 色譜條件 Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～2.5 min，15%～25% A；2.5～6.0 min，25%～30% A；6.0～6.9 min，30%～34% A；6.9～7.0 min，34% A；7.0～8.0 min，34%～100% A；8.0～10.0 min，100% A。體積流量0.25 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

2.8.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI源），正離子掃描模式，離子掃描范圍/50～1000，毛細(xì)管電離電壓2.0 kV，源溫度150 ℃，脫溶劑溫度450 ℃，脫溶劑氣體體積流量900 L/h，錐孔氣體體積流量50 L/h，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multiple reaction monitoring，MRM）。5種生物堿成分的質(zhì)譜參數(shù)信息見表1，MRM模式下的混合生物堿對(duì)照品總離子流圖、給藥后HK-2細(xì)胞破碎液總離子流圖、空白對(duì)照組細(xì)胞破碎液總離子流圖、第3次洗液總離子流圖見圖1。

表1 黃柏中5種生物堿成分質(zhì)譜MRM模式下參數(shù)

Table 1 Parameters of five alkaloid components in Phellodendri Chinensis Cortex in MRM mode

成分母離子(m/z)子離子(m/z)錐孔電壓/V碰撞能量/eV 黃柏堿342.18192.093024 木蘭花堿342.18265.124018 藥根堿338.15322.224026 小檗紅堿332.12307.10 3028 小檗堿336.13320.144030

A-混合生物堿對(duì)照品 B-鹽黃柏給藥組 C-空白組 D-第3次洗液 1-黃柏堿 2-木蘭花堿 3-藥根堿 4-小檗紅堿 5-小檗堿

2.9 方法學(xué)考察

2.9.1 專屬性 取空白細(xì)胞破碎液、空白細(xì)胞破碎液液加混合對(duì)照品溶液和含藥細(xì)胞樣品500 μL，按“2.7”項(xiàng)下方法操作，通過(guò)比較空白組細(xì)胞破碎液、空白細(xì)胞破碎液加混合對(duì)照品溶液和含藥細(xì)胞樣品的色譜圖，排除潛在的相同MRM通道的內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，考察分析方法的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃柏5種生物堿類成分的分離度良好，組織中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)所測(cè)定成分無(wú)干擾。

2.9.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 取空白細(xì)胞破碎液500 μL，依次加入混合對(duì)照品溶液向下稀釋，制備成8個(gè)質(zhì)量濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，按“2.8”項(xiàng)下條件測(cè)定，并記錄各測(cè)定成分峰面積，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，結(jié)果見表2。

2.9.3 準(zhǔn)確度和精密度 取空白細(xì)胞破碎液500 μL，按“2.9.2”項(xiàng)下方法分別配制5種生物堿成分空白細(xì)胞破碎液低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品，質(zhì)量濃度分別為黃柏堿（0.004 7、2.329 5、815.340 9 ng/mL）、木蘭花堿（0.005 7、2.840 9、994.318 2 ng/mL）、藥根堿（0.004 7、2.329 5、815.340 9 ng/mL）、小檗紅堿（0.004 6、2.315 4、810.377 3 ng/mL）、小檗堿（0.004 7、2.343 7、820.304 5 ng/mL），每個(gè)質(zhì)量濃度平行分析6份，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)質(zhì)量控制樣品測(cè)定的結(jié)果考察本方法的準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果表明，黃柏5種生物堿成分低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度日內(nèi)精密度RSD為2.31%～11.68%，準(zhǔn)確度為89.31%～113.66%；日間精密度RSD為1.89%～11.66%，準(zhǔn)確度為87.86%～109.47%，表明該方法準(zhǔn)確度與精密度良好。

2.9.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 同“2.9.2”項(xiàng)下操作得A樣品；另取空白細(xì)胞破碎液500 μL，與“2.9.2”項(xiàng)下操作相比，在加入對(duì)照品溶液的先后順序上做調(diào)整，此樣品為離心后向獲得的上清液中加入上述相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液作為B樣品；除不加空白細(xì)胞破碎液外，按“2.9.2”項(xiàng)下方法操作得C樣品。上述樣品每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行樣品。提取回收率為A樣品與B樣品色譜峰面積之比，基質(zhì)效應(yīng)為B樣品與C樣品的色譜峰面積之比。結(jié)果表明，黃柏5種生物堿成分低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品基質(zhì)效應(yīng)為86.31%～105.28%，提取回收率為88.69%～106.37%，提示提取回收率良好，無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)干擾。

表2 各生物堿成分線性關(guān)系

Table 2 Linear relationships of various alkaloids

成分回歸方程r線性范圍/(ng·mL?1)定量限/(ng·mL?1) 黃柏堿Y＝33 141.1 X＋91.427 60.999 1530.002 33～820.000 000.002 33 木蘭花堿Y＝3 642.70 X＋14.527 70.997 5130.002 84～1 000.000 000.002 84 藥根堿Y＝46 177.9 X＋47.925 10.998 9950.002 33～820.000 000.002 33 小檗紅堿Y＝162 709 X＋102.301 00.999 5380.002 32～815.000 000.002 32 小檗堿Y＝116 717 X＋179.964 00.999 0740.002 34～825.000 000.002 34

2.9.5 樣品穩(wěn)定性 同“2.7”項(xiàng)下方法樣品處理后儀器進(jìn)樣盤中放置12 h；樣品處理后放置4 ℃儲(chǔ)存24 h；細(xì)胞破碎液樣品反復(fù)凍融3次后按“2.7”項(xiàng)下方法處理?？疾旒?xì)胞破碎液中黃柏生物堿類成分在進(jìn)樣器放置以及4 ℃儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定性。結(jié)果表明，黃柏5種生物堿成分低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品在進(jìn)樣盤放置12 h精密度RSD為0.98%～13.89%、準(zhǔn)確度為88.68%～112.85%，4 ℃冷藏24 h精密度RSD為1.37%～11.45%、準(zhǔn)確度為89.13%～109.52%，各成分均較穩(wěn)定。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 CCK-8法檢測(cè)藥物毒性結(jié)果

通過(guò)CCK-8法測(cè)定黃柏給藥液對(duì)HK-2細(xì)胞的毒性作用，并確定黃柏給藥液的給藥濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃柏給藥液在質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí)，生黃柏、鹽黃柏和酒黃柏組HK-2細(xì)胞存活率分別為93.73%、103.29%和93.68%，均大于90%，說(shuō)明該藥物濃度對(duì)HK-2細(xì)胞細(xì)胞增殖沒有明顯影響，無(wú)細(xì)胞毒性，隨著給藥液濃度的提高其對(duì)細(xì)胞增殖也存在抑制作用。因此，本研究最終選擇400 μg/mL作為給藥濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 正常給藥組HK-2細(xì)胞中黃柏不同炮制品生物堿類成分?jǐn)z取差異考察

空白對(duì)照組細(xì)胞破碎液總離子色譜圖（圖1-C）未檢測(cè)到黃柏中生物堿類成分所對(duì)應(yīng)的離子峰，提示空白對(duì)照組細(xì)胞破碎液中無(wú)黃柏生物堿類成分，細(xì)胞破碎液不干擾樣品檢測(cè)。第3次洗液（圖1-D）無(wú)明顯黃柏生物堿響應(yīng)強(qiáng)度，可以忽略不計(jì)，說(shuō)明3次的洗滌已經(jīng)把物理吸附細(xì)胞膜上的成分清洗干凈，在加藥的細(xì)胞破碎液中的成分應(yīng)為與細(xì)胞膜有相互作用的成分。通過(guò)MassLynx 4.1工作站計(jì)算HK-2細(xì)胞破碎液中黃柏生物堿含量變化趨勢(shì)（圖2）。

從黃柏不同炮制品中生物堿類成分?jǐn)z入差異來(lái)看，各給藥組在給藥前期的1 h內(nèi)，黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿和小檗堿在HK-2細(xì)胞內(nèi)的攝入含量差異比較為鹽黃柏組＞生黃柏組＞酒黃柏組。各給藥組小檗紅堿含量則為鹽黃柏組＞酒黃柏組＞生黃柏組。

從HK-2細(xì)胞給藥后孵育時(shí)間來(lái)看，黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、小檗堿在HK-2細(xì)胞內(nèi)的含量變化，隨著給藥時(shí)間的推移，1、4、6、9 h含量整體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。小檗紅堿的藥時(shí)曲線略有不同，生黃柏、酒黃柏小檗紅堿含量在6 h達(dá)到峰值，鹽黃柏則在4 h到達(dá)峰值，隨后整體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。

圖2 黃柏不同炮制品5種生物堿成分在HK-2細(xì)胞中含量變化趨勢(shì)

3.3 抑制劑給藥組HK-2細(xì)胞中黃柏不同炮制品生物堿類成分?jǐn)z取差異考察

在給藥的HK-2細(xì)胞破碎液中所檢測(cè)到的黃柏生物堿類成分均未在空白對(duì)照組和給藥細(xì)胞的第3次洗液中檢測(cè)出，提示該檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為HK-2細(xì)胞所攝取的生物堿類成分。抑制劑干預(yù)后HK-2細(xì)胞破碎液中黃柏生物堿含量均小于無(wú)抑制劑干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05、0.01、0.001），提示轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對(duì)HK-2細(xì)胞攝取生物堿成分發(fā)揮作用。不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對(duì)HK-2細(xì)胞攝取生黃柏生物堿的影響結(jié)果見圖3，加入不同抑制劑后，黃柏中生物堿在HK-2細(xì)胞攝取情況出現(xiàn)不同程度地下降，其中部分指標(biāo)有顯著的下降差異。不同抑制劑干預(yù)后HK-2細(xì)胞破碎液中黃柏生物堿含量變化趨勢(shì)圖見圖4。

從轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑對(duì)不同生物堿攝取情況來(lái)看，黃柏堿、木蘭花堿含量差異為丙磺舒（OATs抑制劑）組＞四乙基氯化銨（OCTs抑制劑）組；藥根堿的含量比較結(jié)果為四乙基氯化銨（OCTs抑制劑）組＞丙磺舒（OATs抑制劑）組，但差異并不明顯。

與生黃柏組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

圖4 不同抑制劑干預(yù)后HK-2細(xì)胞中黃柏不同炮制品5種生物堿含量變化趨勢(shì)

小檗紅堿的含量比較結(jié)果為各時(shí)間段丙磺舒（OATs抑制劑）組≈四乙基氯化銨（OCTs抑制劑）組；小檗堿的含量比較結(jié)果為給藥后1 h內(nèi)丙磺舒（OATs抑制劑）組≈四乙基氯化銨（OCTs抑制劑）組，4～9 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為丙磺舒（OATs抑制劑）組＞四乙基氯化銨（OCTs抑制劑）組。

從抑制劑組的HK-2細(xì)胞給藥孵育時(shí)間來(lái)看，HK-2細(xì)胞對(duì)黃柏各生物堿攝取變化趨勢(shì)相似，生物堿含量變化趨勢(shì)整體呈現(xiàn)為1～6 h先下降，6～9 h有所上升。

4 討論

腎小管作為腎臟的重要功能單位，主要由近端小管、遠(yuǎn)端小管、集合管3部分組成。其中發(fā)揮重要功能的是近端小管，負(fù)責(zé)血液和尿液之間的物質(zhì)吸收、交換、排泄等功能，在這一過(guò)程中腎小管上皮細(xì)胞可以通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白攝取葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽、藥物成分等[14-17]。OATs家族和OCTs家族作為腎小管上皮細(xì)胞上分布最為廣泛的轉(zhuǎn)運(yùn)體，發(fā)揮著藥物重吸收和體內(nèi)分布的重要作用[18-19]。

黃柏作為傳統(tǒng)清熱燥濕藥，味苦、性寒，歸腎、膀胱經(jīng)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃柏具有多種生物堿、檸檬苦素類、酚酸類等成分，其中主要的活性成分為生物堿類成分。黃柏的傳統(tǒng)炮制方法主要有鹽制、酒制等[20-21]。通過(guò)炮制可以改變中藥的作用趨勢(shì)，如入鹽則走腎臟?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，黃柏經(jīng)鹽炙后，其生物堿類成分更趨向于腎組織臟器的分布[22-24]。

4.1 HK-2細(xì)胞對(duì)黃柏不同炮制品生物堿類成分?jǐn)z取差異

本實(shí)驗(yàn)使用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，通過(guò)UPLC-QqQ-MS技術(shù)對(duì)黃柏“鹽炙入腎”的機(jī)制進(jìn)行探究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組HK-2細(xì)胞破碎液中生物堿類成分含量總體呈現(xiàn)鹽黃柏組＞生黃柏組＞酒黃柏組，表明了黃柏經(jīng)過(guò)鹽炙后，其生物堿成分更容易被腎小管上皮細(xì)胞吸收，從而在一定程度上進(jìn)一步驗(yàn)證了黃柏“鹽炙入腎”的炮制理論。

4.2 HK-2細(xì)胞給藥孵育時(shí)間對(duì)黃柏生物堿類成分含量變化的影響

隨著黃柏不同炮制品對(duì)HK-2細(xì)胞孵育時(shí)間的推移，1、4、6、9 h正常給藥組HK-2細(xì)胞內(nèi)生物堿類成分含量總體呈下降趨勢(shì)，其主要原因是腎臟作為體內(nèi)代謝的重要器官，發(fā)揮著藥物排泄的功能。抑制劑組HK-2細(xì)胞內(nèi)生物堿成分的含量總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，提示可能是抑制劑抑制效果隨時(shí)間逐漸減弱。

4.3 黃柏生物堿類成分進(jìn)入HK-2細(xì)胞途徑的考察

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示表明，黃柏堿、木蘭花堿可能是通過(guò)OCTs運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)，而藥根堿、小檗紅堿和小檗堿的轉(zhuǎn)運(yùn)則是OATs和OCTs共同介導(dǎo)的結(jié)果。其中抑制劑組HK-2細(xì)胞內(nèi)藥根堿含量差異表現(xiàn)為OATs攝取效果較好于OCTs，而小檗堿則是有機(jī)陽(yáng)離子攝取效果較好，從化合物結(jié)構(gòu)上來(lái)看，相對(duì)于小檗堿，藥根堿更容易生成負(fù)電荷。

與黃柏正常給藥組相比，抑制劑組生物堿成分含量具有顯著性差異，提示相應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑發(fā)揮了抑制HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的作用?？瞻捉M無(wú)生物堿類成分檢出，第3次洗液幾乎無(wú)生物堿響應(yīng)強(qiáng)度，提示實(shí)驗(yàn)組所檢測(cè)的生物堿含量即為HK-2細(xì)胞攝取生物堿含量。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)OATs和OCTs共同抑制HK-2細(xì)胞攝取進(jìn)行了考察，其生物堿成分含量變化很小，抑制HK-2細(xì)胞攝取能力與單個(gè)抑制劑組相比，雙重抑制劑組生物堿含量＞單個(gè)抑制劑組，其具體機(jī)制尚不清晰，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)繼續(xù)考察。實(shí)驗(yàn)中對(duì)于黃柏內(nèi)酯類成分同時(shí)也進(jìn)行了檢測(cè)，幾乎無(wú)響應(yīng)強(qiáng)度，初步推測(cè)可能黃柏內(nèi)酯類成分含量過(guò)少，亦或是很難被HK-2細(xì)胞吸收。因此本實(shí)驗(yàn)主要就黃柏生物堿類成分?jǐn)z取情況進(jìn)行探究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和UPLC-QqQ-MS技術(shù)證實(shí)了黃柏中生物堿類成分能夠被腎小管上皮細(xì)胞攝取，腎小管上皮細(xì)胞對(duì)黃柏不同炮制品中生物堿類成分?jǐn)z取差異，也進(jìn)一步佐證了黃柏“鹽炙則治下”的炮制理論。實(shí)驗(yàn)初步表明黃柏中生物堿類成分的攝取主要是OCTs介導(dǎo)的結(jié)果，具體是哪種亞型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用，本實(shí)驗(yàn)后期將用化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑將帶熒光蛋白報(bào)告基因系統(tǒng)的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入HK-2細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過(guò)構(gòu)建OCT2、OAT1和OAT3穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞，再分別以Western blotting、qRT-PCR法測(cè)定黃柏不同炮制品對(duì)HK-2細(xì)胞中相應(yīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高表達(dá)狀態(tài)下，腎臟各轉(zhuǎn)運(yùn)體與黃柏鹽炙前后效應(yīng)成分的關(guān)系。從而精確分析出黃柏鹽炙前后效應(yīng)物質(zhì)入腎過(guò)程與腎中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的關(guān)聯(lián)性，并以“載體轉(zhuǎn)運(yùn)”的角度解析黃柏“鹽炙入腎”的機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 侯小濤, 戴航, 周江煜. 黃柏的藥理研究進(jìn)展 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2007, 18(2): 498-500.

[2] 明·李時(shí)珍. 本草綱目: 點(diǎn)效本 [M]. 北京: 北京燕山出版社, 2007: 120-121.

[3] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 318.

[4] 祁東利, 賈天柱, 廉蓮. 黃柏炮制后化學(xué)成分轉(zhuǎn)化研究 [J]. 中成藥, 2010, 32(3): 443-447.

[5] 賈天柱. 中藥炮制學(xué) [M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2008: 195-197.

[6] 徐慶翰, 劉克辛. 腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體及其研究方法 [J]. 藥品評(píng)價(jià), 2013, 10(14): 40-45.

[7] 師少軍, 張玉. 腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體和/或代謝酶介導(dǎo)藥物排泄及藥物相互作用的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2022, 42(15): 1600-1606.

[8] 隋森芳. 膜分子生物學(xué) [M]. 北京: 高等教育出版社, 2003: 1-45.

[9] Hagos F T, Daood M J, Ocque J A,. Probenecid, an organic anion transporter 1 and 3 inhibitor, increases plasma and brain exposure of-acetylcysteine [J]., 2017, 47(4): 346-353.

[10] Engel K, Wang J. Interaction of organic cations with a newly identified plasma membrane monoamine transporter [J]., 2005, 68(5): 1397-1407.

[11] 董倩倩, 李萍, 宋越, 等. 靶細(xì)胞提取和高效液相飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析預(yù)測(cè)丹參中的活性成分 [J]. 分析化學(xué), 2007, 35(5): 648-652.

[12] Kang D H, Han L, Ouyang X S,. Uric acid causes vascular smooth muscle cell proliferation by entering cells via a functional urate transporter [J]., 2005, 25(5): 425-433.

[13] Endo T, Kimura O, Sakata M. Carrier-mediated uptake of cisplatin by the OK renal epithelial cell line [J]., 2000, 146(2/3): 187-195.

[14] 李云, 尹娟娟, 尹登科. 腎小管靶向給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥師, 2013, 16(9): 1417-1420.

[15] Saito A, Sato H, Iino N,. Molecular mechanisms of receptor-mediated endocytosis in the renal proximal tubular epithelium [J]., 2010, 2010: 403272.

[16] 李珍, 劉宏寶. 納米粒子腎靶向的影響因素及機(jī)制 [J]. 中國(guó)組織工程研究, 2023, 27(3): 453-460.

[17] Sweet D H. Organic anion transporter (Slc22a) family members as mediators of toxicity [J]., 2005, 204(3): 198-215.

[18] 陸汝江, 李玲, 高麗輝. 有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在腎臟尿酸排泄中的作用研究進(jìn)展 [J]. 國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2019, 46(6): 405-410.

[19] 武衛(wèi)黨, 崔濤, 張星艷, 等. 小檗堿對(duì)有機(jī)陽(yáng)離子藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制作用研究 [J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2017, 40(5): 633-637.

[20] 張冠英, 董瑞娟, 廉蓮. 川黃柏、關(guān)黃柏的化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展 [J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 29(10): 812-821.

[21] 代琪, 胡宇, 雷蕾, 等. 黃柏炮制品的考證、化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2020, 16(10): 205-208.

[22] 張凡, 孟莉, 劉蓬蓬, 等. 黃柏生品與鹽炙品中生物堿類成分在大鼠腎組織臟器中的吸收差異 [J]. 中成藥, 2020, 42(11): 2954-2959.

[23] Lei X F, Shan G S, Zhang F,. Determination and comparison of alkaloids and triterpenes among tissues after oral administration of crude and processedby UPLC-QqQ-MS [J]., 2020, 34(9): 1337-1340.

[24] Zhang F, Li L, Zhao J H,. The effects of salt-water processing ofon the enhancement of kidney absorption of the main alkaloids [J]., 2022, 17(2): 1-10.

Difference of intake of alkaloids in renal tubular epithelial cells from different kinds of processed products of

GE Xiu-tong1, ZHAO Jia-hui1, REN Wen-jing1, ZHOU Yue1, ZHANG Fan1, 2

1. College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116000, China 2. Liaoning TCM Processing Technology Innovation Center, Dalian 116000, China

To investigate the uptake of alkaloids from Huangbo () by human renal tubular epithelial HK-2 cells and the pathway of alkaloid uptake by HK-2 cells, so as to verify the theory of “entering into kidney through salt-water processing” fromat the cellular level.UPLC-QqQ-MS technique was used to analyze the differences of phellodendrine, magnoflorine, jatrorrhizine, berberrubine and berberine uptake by HK-2 cells in raw, salt-water processed ofand wine processed of. The contents of five alkaloids inand its processed products changed with the time of administration. The effects of organic anion transportors (organic anion transporters, OATs) inhibitor probenecid and organic cationic transportors (organic cation transporters, OCTs) inhibitor tetraethyl ammonium chloride on uptake of five alkaloids fromand its processed products by HK-2 cells were analyzed.The difference of HK-2 cell uptake of different processed products ofwas as follows: salt-water processed group > raw group > wine processed group. The difference in uptake of HK-2 cells in the inhibitor group was mainly manifested as that of the probenecid (OATs inhibitor) group > tetraethyl ammonium chloride (OCTs inhibitor) group.The alkaloids incan be taken up by HK-2 cells, and their transport mechanism is mainly mediated by OCTs. The higher intake of alkaloids in salt-water processed group may be due to the increased activity of kidney uptake transporters.

; salt-water processing; renal tubular epithelial cells; UPLC-QqQ-MS; phellodendrine; magnoflorine; jatrorrhizine; berberrubine; berberine; organic anion transporters; organic cationic transportors

R285.61

A

0253 - 2670(2023)18 - 5993 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.017

2023-03-30

國(guó)家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（81903801）；遼寧省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2022-MS-287）；沈陽(yáng)市中青年科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（RC210192）

葛修通，男，碩士研究生，從事炮制所致藥性變化研究。Tel: 13555958392 E-mail: gexiutong@126.com

張 凡，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事炮制所致藥性變化的科學(xué)內(nèi)涵研究。Tel: 13804094590 E-mail: fantcm@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]