王依婷，李素珍，毛志濤，廖小平，許慧敏，邱藝華，閆雪崧，楊鳳妍，李貞景，郭慶彬*，劉歡歡*

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.思念食品有限公司，河南 鄭州 450000；3.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；4.濱州市沾化區(qū)海洋和漁業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 濱州 256600）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一類革蘭氏陽(yáng)性菌，最初被定義為可產(chǎn)α-淀粉酶的枯草芽孢桿菌，廣泛用于生物防治、傳統(tǒng)發(fā)酵食品等領(lǐng)域[1-3]。B.amyloliquefaciens 具有較廣的抑菌譜，能通過自身代謝產(chǎn)生抑菌蛋白、聚酮化合物等來達(dá)到抑制病原菌生長(zhǎng)繁殖的作用。劉冬等[4]從大豆根際土壤分離得到的菌株JDF3，可抑制大豆疫霉孢子囊的產(chǎn)生，對(duì)大豆疫病的防治效果達(dá)到70.70%。Rasiya 等[5]從印度紅樹內(nèi)生細(xì)菌中分離到的菌株RKEA3，其產(chǎn)生的抗菌脂肽能夠抑制Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes和Cryptococcus neoformis。同時(shí)，B.amyloliquefaciens 也可用于醬油[6]、白酒[7]、豆豉[8]等傳統(tǒng)食品的發(fā)酵。此外，B.amyloliquefaciens 也被發(fā)現(xiàn)對(duì)黃曲霉毒素B1 誘導(dǎo)的小鼠盲腸炎癥具有保護(hù)作用[9]，表現(xiàn)出一定的益生活性。

由于B.amyloliquefaciens 在農(nóng)業(yè)與食品領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，越來越多的菌株已完成了基因組測(cè)序。截止目前，NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)已收錄超過150 個(gè)基因組序列，為更好地理解該菌株的生理生化特征以及工業(yè)化提供了支撐，同時(shí)也為解析該物種群體遺傳的多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化以及功能基因的多態(tài)性、基因組變異與表型關(guān)聯(lián)、正向基因篩選等提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。近些年發(fā)展起來的泛基因組學(xué)技術(shù)（pan-genome）[10]，通過群體內(nèi)大量的基因組來完整描述一個(gè)物種全部的遺傳信息[11]，側(cè)重于分析特定菌株基因的存在/缺失對(duì)種群功能的獲得/缺失變異（presence/absence variation，PAV）之間的關(guān)聯(lián)。其中，該種群所有樣本共有的基因稱為核心基因，一般與物種生物學(xué)功能和主要表型特征相關(guān)；僅在部分樣本中存在的基因稱為附屬基因，一般與物種對(duì)特定環(huán)境的適應(yīng)性或特有的生物學(xué)特征相關(guān)，反映了部分物種的特性。泛基因組是全面解析物種多樣性和研究表型差異背后分子機(jī)制的強(qiáng)有力工具[12]。

本文從泛基因組學(xué)角度出發(fā)，通過Prokka 基因組注釋[13]、Roary 泛基因組構(gòu)建[14]、ProCAST 蛋白功能注釋、antiSMASH 次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇注釋[15]以及ABRicate 抗生素耐受性基因注釋等分析流程，構(gòu)建B.amyloliquefaciens 的泛基因組并進(jìn)行深入分析，挖掘B.amyloliquefaciens 物種的普遍性遺傳特征及碳水化合物的利用、植物促生、生物防治等方面的遺傳特異性，以期為深度利用B.amyloliquefaciens 這種微生物資源作參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genomes）下載組裝水平標(biāo)識(shí)為“Complete”的66株B.amyloliquefaciens 基因組序列（fasta 格式，截止2022 年8 月17 日）。

1.2 方法

1.2.1 平均核苷酸一致性分析

平均核苷酸相似度（average nucleotide identity，ANI）是在核苷酸水平比較兩個(gè)基因組親緣關(guān)系的指標(biāo)。FastANI 可將基因組序列分割為短序列片段[16]，使用Mashmap 算法計(jì)算同源映射并估計(jì)ANI，在本研究中，參數(shù)fragLen 設(shè)定為500 bp。之后對(duì)所有基因組的ANI 數(shù)值矩陣在R 語(yǔ)言中進(jìn)行層級(jí)聚類，用iTOL v6[17]（https：//itol.embl.de/）繪制聚類樹圖。

1.2.2 泛基因組構(gòu)建及分析

采用Prokka 注釋流程[13]及默認(rèn)參數(shù)，對(duì)所有基因組進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能注釋，其中獲得的gff 格式文件作為泛基因組的輸入文件。Roary 通過blastp 對(duì)gff文件中的序列進(jìn)行直系同源基因分析[14]，獲得B.amyloliquefaciens 泛基因組（pan-genome）和核心基因組（core genome）。采用Origin 軟件對(duì)泛基因組/核心基因組編碼基因數(shù)目與基因組數(shù)目之間的關(guān)系進(jìn)行擬合[18]，擬合公式如下。

y=A×xB+C

式中：y 為泛基因組編碼基因數(shù)目；x 為新增基因組數(shù)目；A、B、C 為系數(shù)。對(duì)于核心基因組的變化，設(shè)新增核心基因組數(shù)目為x，泛基因組大小為y，A、B、C 為系數(shù)，擬合公式如下。

y=A×eBx+C

使用mafft 對(duì)核心基因組進(jìn)行序列比對(duì)，并采用FastTree 及GTR 算法對(duì)比對(duì)文件構(gòu)建基于核心基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。同時(shí)，對(duì)Roary 生成的泛基因組PAV 矩陣，進(jìn)行層級(jí)聚類并構(gòu)建樹圖。

1.2.3 核心基因組功能注釋及富集分析

利用ProCAST 平臺(tái)（https：//procast.biodesign.ac.cn）對(duì)Roary 分析獲得的核心基因組蛋白序列進(jìn)行功能注釋。該管路是由中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所開發(fā)的綜合蛋白質(zhì)注釋的無服務(wù)器網(wǎng)絡(luò)工具，涵蓋蛋白家族、域、分類、結(jié)構(gòu)、基因本體和途徑信息等26 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，并提供多個(gè)工具用于結(jié)果的可視化分析。

1.2.4 質(zhì)粒、抗生素耐藥性等基因的鑒定

采用ABRicate 流程（Seemann T，Abricate，https：//github.com/tseemann/abricate），整合CARD[20]、BacMet[21]、PHAGE、PlasmidFinder[22]、NCBI AMRFinderPlus[23]數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)66 個(gè)菌株基因組的所有蛋白編碼序列（coding sequence，CDS）進(jìn)行功能注釋。其中，CARD 與NCBI AMRFinderPlus 為抗生素耐藥性信息數(shù)據(jù)庫(kù)；BacMet為抗菌殺菌劑和金屬抗性基因數(shù)據(jù)庫(kù)；PHAGE 為噬菌體基因數(shù)據(jù)庫(kù)；PlasmidFinder 包含質(zhì)粒復(fù)制子序列，可用于原始和組裝測(cè)序數(shù)據(jù)的復(fù)制子序列分析。

1.2.5 次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇的鑒定

采用antiSMASH 本地化軟件流程[15]，對(duì)66 個(gè)菌株基因組注釋產(chǎn)生的gbk 文件進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇挖掘，參數(shù)采用--cb-general、--cb-subclusters、--cbknownclusters、--asf 及--pfam2go。

1.2.6 碳水化合物水解酶基因的鑒定

采用本地化的CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)66 個(gè)菌株基因組的所有蛋白編碼序列（CDS）進(jìn)行功能注釋[24]。

1.2.7 解磷途徑及吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA）合成途徑相關(guān)基因的鑒定

根據(jù)京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）中IAA 合成途徑中的蛋白質(zhì)酶編號(hào)[25]，以及解磷途徑涉及的酶編號(hào)[26]，在UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索已校驗(yàn)的fasta 蛋白序列，并通過blast 建庫(kù)，對(duì)66 個(gè)基因組蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，identity閾值設(shè)定為40%，鑒定潛在的IAA 合成和解磷途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 平均核苷酸一致性分析結(jié)果

ANI 被定義為兩個(gè)微生物基因組同源片段之間平均的堿基相似度，是從全基因組水平評(píng)估物種間親緣關(guān)系，尤其是近緣物種的重要工具，通常以ANI>95%作為劃分物種邊界的閾值[16]。本研究通過使用fastANI對(duì)66 個(gè)B.amyloliquefaciens 基因組進(jìn)行同源性評(píng)估，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 基于ANI 分析的B.amyloliquefaciens 層級(jí)聚類樹Fig.1 Hierarchical clustering based on ANI values from B.amyloliquefaciens genomes

如圖1 所示，所有基因組可聚類為2 個(gè)主要分支Clade I 與II，其中，在分支內(nèi)兩兩基因組之間的ANI數(shù)值均高于95%，而分支間的兩個(gè)基因組ANI 數(shù)值均高于90%而低于95%[16]。因此，Clade I 和Clade II 之間已經(jīng)出現(xiàn)較為明顯的物種邊界，未來可將這2 個(gè)分支進(jìn)行獨(dú)立命名。

2.2 泛基因組功能分析

利用Prokka 對(duì)所有基因組進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果見表1。

表1 B.amyloliquefaciens 基本信息Table 1 Basic information of B.amyloliquefaciens

由表1 可知，B.amyloliquefaciens 的基因組介于3.70～4.44 Mb，最小為RD7-7，最大為XJ5，GC 含量為45.50%～46.50%，編碼基因數(shù)目為3 716～4 445 個(gè)，平均每個(gè)基因組編碼3 997 個(gè)基因。結(jié)合Roary 泛基因組分析流程，對(duì)上述基因組的核心基因組和泛基因組進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖2。

圖2 核心基因數(shù)量和總基因數(shù)量隨基因組數(shù)目增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)Fig.2 Variation trend of core gene number and total gene number with the increase of genome number

由圖2 可知，B.amyloliquefaciens 泛基因組基因總數(shù)為13 051 個(gè)，核心基因組中包含基因2 165 個(gè)，占基因組平均編碼基因數(shù)目的54.16%。

由于物種受到生存環(huán)境與生態(tài)位差異、有效群體規(guī)模、多態(tài)性水平差異等因素的影響，泛基因組呈現(xiàn)開放型和閉合型兩種模式。開放型泛基因組特點(diǎn)是物種內(nèi)隨著測(cè)序菌株的增加，基因個(gè)數(shù)也隨之增加，較難到達(dá)平臺(tái)期；閉合型泛基因組特點(diǎn)是物種內(nèi)隨著有限的菌株個(gè)體增加，基因個(gè)數(shù)迅速達(dá)到平臺(tái)期[27-28]。

在對(duì)泛基因組編碼基因數(shù)目與基因組數(shù)目之間的擬合公式中，y=3 925x0.29-343.8（R2=0.998）。其中，0.29為非零正數(shù)，泛基因組中基因總數(shù)會(huì)隨著新的基因組的加入而呈指數(shù)性增加，因此推斷B.amyloliquefaciens的泛基因組呈現(xiàn)一定的開放性。

核心基因組編碼基因數(shù)目與基因組數(shù)目之間的擬合公式為y=1 388e-0.1571x+2 235（R2=0.980）。根據(jù)擬合方程，隨著B.amyloliquefaciens 基因組測(cè)序數(shù)量的增加，核心基因組編碼基因數(shù)目可能穩(wěn)定在2 235 個(gè)。上述分析表明，B.amyloliquefaciens 易從外界獲得新的基因，但同時(shí)核心基因組具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

泛基因組的缺失與存在變異（PAV）進(jìn)行聚類分析，泛基因組中核心基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖3 和圖4 所示。

圖3 B.amyloliquefaciens 基因存在/缺失變異（PAV）矩陣的層次聚類Fig.3 Hierarchical clustering based on gene presence/absence variation（PAV）matrix of B.amyloliquefaciens

圖4 基于B.amyloliquefaciens 核心基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on core genome sequence alignment of B.amyloliquefaciens

由圖3 與圖4 可知，此結(jié)果與ANI 結(jié)果一致，表明66 株菌在全基因組ANI 相似性、PAV 聚類以及核心基因組序列相似性中均可被明確劃為兩個(gè)分支，Clade II中的15 株菌與Clade I 中的51 株菌不屬于一個(gè)種，將來可作為獨(dú)立物種進(jìn)行研究。

為進(jìn)一步解析該物種所具有的核心基因功能特征，即菌株的普遍性遺傳特征，本研究采用ProCAST中集成的21 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心基因組蛋白序列進(jìn)行了注釋。其中NR、SwissPort 和PFAM 數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋基因占核心基因數(shù)的比例均超過90%。

基于COG 數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋結(jié)果如圖5 所示。

圖5 核心基因組的COG 注釋結(jié)果Fig.5 Main annotations for COG annotation

如圖5 可知，R（11.14%）、E（8.56%）、J（7.30%）、K（7.03%）、P（5.71%）、C（5.65%）、M（5.10%）、G（4.83%）等占據(jù)了主要的功能模塊。核心基因組的PATHWAY注釋結(jié)果見圖6。

圖6 核心基因組的PATHWAY 注釋結(jié)果Fig.6 Main annotations for PATHWAY annotation

在PATHWAY 注釋中（包含KEGG pathway、Reactome、MetaCyc 等數(shù)據(jù)庫(kù)），Aminoacyl-tRNA biosynthesis、Mitochondrial translation elongation 以及Purine metablism 等模塊聚集了大量的功能基因，顯示出B.amyloliquefaciens 在轉(zhuǎn)錄、翻譯、氨基酸代謝、離子運(yùn)輸、能量代謝等基礎(chǔ)代謝方面功能保守。

CAZy 是一個(gè)整合了碳水化合物酶活性的數(shù)據(jù)庫(kù)。B.amyloliquefaciens 的核心基因組注釋結(jié)果見圖7。

圖7 核心基因組的CAZy 注釋結(jié)果Fig.7 Main annotations for CAZy annotation

如圖7 所示，糖苷轉(zhuǎn)移酶類（glycoside transferases，GT）數(shù)量為50 個(gè)，糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）數(shù)量為49，占CAZy 酶總數(shù)的37.04%和36.30%。GH 和GT 是參與糖的合成和代謝的主要酶類，其中GH13 家族具有α-淀粉酶活性，占CAZy 酶總數(shù)的5.19%；GH3 和GH51 兩個(gè)家族具有β-葡聚糖酶活性，占CAZy 酶總數(shù)的3.70%；GH3 和GH43 兩個(gè)家族具有木聚糖酶活性，共占CAZy 酶總數(shù)3.70%。表明B.amyloliquefaciens 具有較好的水解淀粉、β-葡聚糖和木聚糖潛力。這為B.amyloliquefaciens 的糖苷水解酶和糖苷轉(zhuǎn)移酶類開發(fā)利用提供了遺傳基礎(chǔ)。已有研究表明，B.amyloliquefaciens 可以產(chǎn)生β-1，3-葡聚糖酶等病程相關(guān)蛋白，通過作用于真菌細(xì)胞壁的不同成分來破壞真菌細(xì)胞壁，以達(dá)到抵抗病原真菌侵染的目的[29-30]。核心基因組的基因本體論注釋結(jié)果見圖8。

圖8 核心基因組的GO 注釋結(jié)果Fig.8 Main annotations for GO annotation

如圖8 所示，在基因本體論（Gene Ontology，GO）注釋中，B.amyloliquefaciens 大量核心基因聚集在oxidoreductase activity（7.14%）、structural constituent of ribosome（5.42%）、integral component of membrane（2.97%）等涉及氧化還原、遺傳信息傳遞和生物膜合成等生物學(xué)過程模塊；在細(xì)胞組成模塊中，主要涉及catalytic activity（9.25%）、protein binding（1.98%）、cytoplasm（0.66%）等；而在分子功能模塊中，大量功能基因聚集在DNA binding（10.58%）、catalytic activity（9.25%）、transmembrane transporter activity（7.87%）等方面，表明B.amyloliquefaciens 在催化分解、蛋白質(zhì)的合成以及轉(zhuǎn)運(yùn)方面較為保守。上述核心基因組的功能注釋證明B.amyloliquefaciens 在基礎(chǔ)代謝相關(guān)的基因中顯示出一定的遺傳和功能保守性，為研究該菌的普遍代謝特征提供了基礎(chǔ)。

此外，利用TMHMM 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白質(zhì)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)采用SIGNALP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)氨基酸序列中的信號(hào)肽進(jìn)行注釋。將含有信號(hào)肽且無跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)識(shí)別為分泌蛋白。結(jié)果顯示，在B.amyloliquefaciens 的核心基因組中，共識(shí)別出99 個(gè)分泌蛋白，占核心基因總數(shù)的4.57%，并且在分泌蛋白中發(fā)現(xiàn)了溶桿菌素的蛋白質(zhì)序列，表明B.amyloliquefaciens普遍能夠分泌溶桿菌素這一抗菌肽，賦予了該物種廣譜抗菌的特性。

2.3 所有B.amyloliquefaciens 菌株基因組功能模塊的PAV 分析

因B.amyloliquefaciens 在生物防治以及食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，因此對(duì)所有66 株菌的CAZy、解磷途徑、IAA 合成途徑、次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇以及抗生素耐藥性基因進(jìn)行全面比較分析，為比較B.amyloliquefaciens種群內(nèi)生物功能提供理論基礎(chǔ)。

將66 株B.amyloliquefaciens 與其他芽孢桿菌（例如：B.subtilis 168、B.pumilus Ha06YP001 等）對(duì)比，結(jié)果見圖9。

圖9 CAZyme 編碼基因的分布Fig.9 CAZyme coding gene distribution

如圖9 所示，B.amyloliquefaciens GH3、GH43 以及GH51 基因數(shù)較多。其中，GH3 和GH51 家族為β-葡聚糖酶，能催化水解谷物細(xì)胞壁中的β-葡聚糖[29]；GH43 是一類降解木聚糖的酶系，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素。此外，B.amyloliquefaciens ARP23 等30 株菌的GH13 家族編碼基因數(shù)普遍較多，而GH13 家族為支鏈淀粉酶，能夠催化淀粉等多糖化合物中的α-1，6-糖苷鍵水解，形成直鏈淀粉。以上結(jié)果表明66 株B.amyloliquefaciens 具有豐富的β-葡聚糖和木聚糖降解酶的基因資源。依賴色氨酸的IAA 生物合成途徑見圖10。解磷途徑和IAA 合成途徑相關(guān)酶的基因簇分布見圖11。

圖10 依賴色氨酸的IAA 生物合成途徑Fig.10 Tryptophan dependent IAA biosynthesis pathway

圖11 解磷途徑和IAA 合成途徑相關(guān)酶的基因簇分布Fig.11 Gene distribution of enzymes related to phosphorus hydrolysis and IAA synthesis pathway

如圖11 所示，吲哚丙酮酸（indole pyruvic acid，IPyA）途徑為66 株菌所共有，而其它途徑均不完整或缺失。如圖11 所示，15 株菌（Clade II）在醛脫氫酶（NAD+）的基因存在與缺失上與其余51 株菌（Clade I）呈“互補(bǔ)”狀態(tài)。在IPyA 介導(dǎo)的IAA 合成途徑中，色氨酸通過氧化轉(zhuǎn)氨作用形成吲哚丙酮酸，隨后在苯丙酮酸脫羧酶作用下脫羧形成吲哚乙醛，再經(jīng)過醛脫氫酶（NAD+）脫氫變成IAA，而IAA 對(duì)于植物生長(zhǎng)具有重要影響。

此外，通過blast 分析比對(duì)，所有菌株的基因組中共含有5 種編碼堿性磷酸酯酶（4 個(gè)Pho D 和1 個(gè)Pho A）基因和1 種植酸酶（phy）編碼基因。由圖11 可知，這些基因在66 株菌中均被發(fā)現(xiàn)。微生物的解磷過程十分復(fù)雜，目前被廣泛接受的是有機(jī)磷（organophosphorus，OPB）酶解和無機(jī)磷（inorganic phosphorus，IPB）酸解兩個(gè)方式[31]。堿性磷酸酶是解磷菌參與OPB 礦化的重要酶類，分為phoA、phoD、phoX 3 種類型[32]，其中在海洋和土壤微生物中phoD 的含量更高[33]。磷酸酶通過去磷酸化或斷裂有機(jī)磷物質(zhì)中的磷酯鍵釋放有效磷，植酸酶則通過釋放植酸磷來增加有效磷的含量[34]。

2.4 抗性基因的挖掘與次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇

為揭示不同菌株在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成以及抗生素耐藥性等方面的特征，本研究利用本地化的anti SMASH 及ABRicate 注釋流程對(duì)每個(gè)B.amyloliquefaciens 的基因組進(jìn)行了功能挖掘，結(jié)果如圖12 所示。

圖12 B.amyloliquefaciens 次級(jí)代謝產(chǎn)物和抗性、噬菌體以及質(zhì)粒基因簇分布Fig.12 Distribution of B.amyloliquefaciens secondary metabolites resistance，phage and plasmid gene clusters

如圖12 所示，在所有B.amyloliquefaciens 基因組中，共鑒定出5 種抗藥性基因和3 種銅離子抗性基因，菌株覆蓋率高達(dá)98.48%，只有B.amyloliquefaciens B408未鑒定出抗性基因。其中YFMP、YFMO、FABL、CUER數(shù)量最多，出現(xiàn)頻次各為66 次；其次為rphC、satAbsub、clbA、rphB、tet（L）、CSOR、COPZ，共254 個(gè)。YFMP、YFMO、CUER、CSOR、COPZ 蛋白表現(xiàn)出對(duì)銅的抗性；FABL 蛋白表現(xiàn)出對(duì)酚類化合物的抗性；rphB 和rphC蛋白對(duì)利福霉素具有耐受性；clbA 和satA-bsub 對(duì)鏈霉素具有耐受性，且clbA 對(duì)林可酰胺以及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素也具有耐受性，tet（L）對(duì)四環(huán)素以及多西環(huán)素具有耐藥性。

噬菌體和質(zhì)粒的存在可以增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。通過PlasmidFinder 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋發(fā)現(xiàn)，B.amyloliquefaciens HM618、TL106、LL3、IT -45、S499、LS1 -002-014s 和MBE1283 中含有質(zhì)粒，覆蓋率達(dá)10.61%；PHAGE 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)66 株B.amyloliquefaciens 進(jìn)行噬菌體基因注釋，共檢測(cè)出16 種噬菌體基因，覆蓋率達(dá)100%，涉及參與細(xì)菌素生產(chǎn)或免疫、小酸溶性孢子蛋白和硫氧還蛋白的合成等功能，為B.amyloliquefaciens 的抗菌、遺傳穩(wěn)定、環(huán)境耐受等特性提供遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。

antiSMASH 注釋結(jié)果表明，66 株B.amyloliquefaciens 共預(yù)測(cè)到815 個(gè)基因簇，每個(gè)基因組內(nèi)約包含10～15 個(gè)次級(jí)代謝基因簇。其中，與已知基因簇同源性大于60%的有441 個(gè)，同源性為100%的有354 個(gè)，主要涉及桿菌烯（bacillaene）、桿菌肽（bacillibactin）和溶桿菌素（bacilysin）等的生產(chǎn)（圖12），這可能是B.amyloliquefaciens 作為生防菌株的主要遺傳基礎(chǔ)。

上述分析表明，作為生防菌株，B.amyloliquefaciens有望通過次級(jí)代謝產(chǎn)物遏制病原菌來實(shí)現(xiàn)抑菌效果，并通過抗藥性/噬菌體/質(zhì)粒增強(qiáng)自我保護(hù)與環(huán)境適應(yīng)性；B.amyloliquefaciens 對(duì)銅離子具有較好的抗性，表明在土壤受到銅污染時(shí)，具有自我保護(hù)的能力。江春玉等[35]從重金屬污染土壤中分離到Cu2+抗性B.amyloliquefaciens，可顯著增加培養(yǎng)液中游離Cu2+的含量，從而提高植物吸收Cu2+速率，增強(qiáng)Cu2+污染土壤治理的效率，但相關(guān)機(jī)制尚不明確。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)B.amyloliquefaciens 進(jìn)行泛基因組構(gòu)建以及對(duì)核心基因組的功能注釋，從基因組層面評(píng)估了其作為生物防治菌株的遺傳潛力。ANI 以及聚類分析表明66 株B.amyloliquefaciens 分為相對(duì)獨(dú)立的兩個(gè)分支；COG、GO、PATHWAY 等對(duì)核心基因組基礎(chǔ)注釋表明B.amyloliquefaciens 具有較為保守的能量生產(chǎn)、蛋白質(zhì)合成、基因表達(dá)、化合物轉(zhuǎn)運(yùn)等功能，這為B.amyloliquefaciens 的代謝穩(wěn)定性提供了遺傳基礎(chǔ)。

在功能基因注釋上，CAZy 注釋結(jié)果表明B.amyloliquefaciens 具有較強(qiáng)的水解多糖類物質(zhì)的能力。PATHWAY 和SwissProt 注釋結(jié)果表明B.amyloliquefaciens 可通過IPyA 途徑合成IAA 以及通過分泌植酸和堿性磷酸酶降解環(huán)境中的磷，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。

在66 株B.amyloliquefaciens 的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析中預(yù)測(cè)到大量的桿菌烯和桿菌肽合成基因簇。同時(shí)抗生素耐藥性分析表明，多數(shù)B.amyloliquefaciens 基因組中含有大量編碼利福霉素、鏈霉素、林可酰胺以及大環(huán)內(nèi)酯類抗生素等耐藥性基因以及銅抗性基因，上述基因元件進(jìn)一步增強(qiáng)了該菌在遏制病原菌、聯(lián)合用藥、自我保護(hù)和土壤改良方面的優(yōu)勢(shì)和潛力。總之，本文通過構(gòu)建B.amyloliquefaciens 泛基因組，系統(tǒng)揭示了該物種內(nèi)普遍性及特異性遺傳特征，為將來深度利用B.amyloliquefaciens 這種微生物資源奠定了基礎(chǔ)。